Risposte alle domande d'esame di Fermentazioni industriali

C

Trasferimento = - * sistema

del

forza motrice

C CL =

-

Cx è la concentrazione a saturazione nella fase liquida e Kl è il coefficiente di trasferimento che dipende dalle

–

condizioni del processo. (Cx Cl) è la forza motrice del sistema.

Lavorando con delle bolle è però necessario considerare l’area interfacciale specifica utilizzando un coefficiente

di trasferimento globale o Kla dove a è l’area interfacciale specifica:

CL)

(C +

Knd

OTR = -

La kla (e quindi l’OTR) dipende dal reattore e dalle condizioni operative. Ottenuta questa formula per il

trasferimento di ossigeno è possibile dedurre 3 metodi per migliorare l’OTR:

1) Aumentare l’agitazione del sistema, questo permette di aumentare l’area interfacciale specifica e mi

permette di lavorare su Kla

2) Aumentare la pressione del gas nella fase gassosa strozzando la valvola di sfiato o aumentando la pressione

nella parte alta del fermentatore. Questo permette di lavorare su Cx aumentando quindi la forza motrice del

sistema

3) Utilizzo aria arricchita di ossigeno in modo tale da aumentare Cx e quindi la forza motrice del sistema

Tendenzialmente questi metodi vengono utilizzati in scaletta, ovvero si inizia con l’1 se non basta si prosegue con

2 e se non basta ancora allora si utilizza aria arricchita.

NB: tutti i bioreattori air lift e bubble column hanno un valore di KLa superiore rispetto all’STR; di contro non hanno l’agitazione

meccanica che potrebbe consentire una riduzione della dimensione delle bolle d’aria. Pertanto, non sono tanto flessibili. L’STR può

lavorare con bassi valori KLa, che può essere anche aumentato incrementando l’agitazione meccanica (flessibilità).

10. Batteriocine: struttura e meccanismo d'azione attività di laboratorio,

Le batteriocine sono delle molecole proteiche prodotte principalmente da batteri lattici (LAB), sono in grado di

eliminare altri batteri filogeneticamente vicini a quelli che le hanno prodotte, in sostanza hanno un’azione nociva

contro i competitor in modo tale che il batterio che le ha prodotte possa svilupparsi. Sono dei composti che

vengono sintetizzati durante il metabolismo primario, ovvero durante la fase di sviluppo e la loro sintesi si ferma

durante la fase stazionaria. Hanno principalmente azione contro i microrganismi Gram + ed è difficile identificare

un’azione contro i microrganismi Gram -

.

Le batteriocine hanno un’applicazione importante nella conservazione degli alimenti in quanto prodotti naturali,

non tossici e attivi a basse concentrazioni. Possono essere utilizzate in situ, ovvero prodotte nella matrice

alimentare come ad esempio i prodotti fermentati, oppure ex situ ovvero aggiunte direttamente nella matrice

alimentare. Possono essere utilizzate anche nell’active packaging mediante incorporamento diretto o coating i

quali permettono un rilascio graduale e una concentrazione di batterio cine costante nel tempo. Possono essere

utilizzate anche per accelerare la maturazione dei formaggi.

Le batteriocine vengono divise in 3 classi principali:

CLASSE I: si tratta di batteriocine con massa atomica inferiore a 5kDa, sono peptidi termostabili che possono

subire modificazioni post- traduzionali. La loro caratteristica è il peptide leader, ovvero una sequenza di

amminoacidi che permette la fuoriuscita della batteriocina dal batterio in modo tale che possa agire contro i

competitor ed inoltre rende innocua la batteriocina nei confronti del batterio produttore. Di questa classe la più

importante è la NISINA, questa è l’unica batteriocina approvata come additivo alimentare (E234). La nisina è

prodotta da Lactococcus lactis ed è caratterizzata da 57 amminoacidi di cui 23 caratterizzano il peptide leader,

sequenza che viene eliminata una volta che la batteriocina fuoriesce dalla cellula. Questa ha due meccanismi di

attacco: uno riguarda la lisi della membrana cellulare con creazione di pori mentre l’altro riguarda il legame con

le lipoproteine di membrana destabilizzando il trasporto attraverso la membrana citoplasmatica. Hanno residui

amminoacidici inusuali come lantionina e 3-metilantionina;

CLASSE II: sono batteriocine la cui massa atomica è inferiore ai 10 kDa, sono molecole molto termostabili, ovvero

in grado di resistere a temperature anche superiori ai 100 gradi. NON subiscono modificazioni post- traduzionali

ma sono caratterizzate da una regione idrofobica e da una idrofilia, quest’ultima si trova sulla parte N-terminale

della molecola e si lega alla membrana celulare grazie a un recettore. La parte idrofobica si piega all’interno della

membrana e grazie al meccanismo di due peptidi di questo tipo posti specularmente si forma un poro sulla

membrana, questo porta alla fuoriuscita di materiale cellulare successiva morte della cellula. Questo tipo di

molecole ha anche un’azione litica nei confronti della membrana. La più famosa batteriocina di questa classe è la

PEDIOCINA di notevole interesse in quanto attiva contro Lysteria monocytogenes, un microrganismo in grado di

provocare la listeriosi, un problema sia

sanitario che economico. Un’altra batteriocina di questa classe attiva contro questo microrganismo è la

SAKACINA A prodotta da Lactobacillus sakei, formata da 41 amminoacidi e circa 4 kDa di massa atomica.

La classe II ha anche una azione litica nei confronti della parete cellulare: rompe i legami presenti nell’acido N-

acetil muramico.

CLASSE III: sono batteriocine la cui massa atomica è superiore ai 10 kDa e sono molto termosensibili, questo le

rende poco interessanti ed utilizzate. Una delle più note è la Lysostaphina, prodotta da Staphilococcus simulans.

Questa classe comprende un gruppo A caratterizzato dalle batterio lisine, ovvero enzimi batteriolitici in grado di

lisare la parete cellulare e dal gruppo B caratterizzato da peptidi non litici i quali impediscono la sintesi di DNA e

ne inducono la morte.

La produzione di Sakacina A è stata valutata in laboratorio mediante due step:

STEP 1: viene valutato lo sviluppo di Lactobacillus sakei a diversi tempi di incubazione, questo può essere

fatto mediante la conta in piastra, in questo caso vengono determinate le sole cellule vive su terreno MRS.

Le piastre e la provetta contenente la coltura di L. sakei vengono incubate a 26 gradi per 24 ore. Viene

prelevata inoltre la coltura appena inoculata (T0) e ne viene fatta un’analisi della torbidità allo

spettofotometro con lunghezza d’onda pari a 600 nm. La conta in piastra e la densità ottica permettono

di costruire una retta di taratura. (Assorbimento correlato a qt cellule presenti: legge Lambert Beer)

STEP 2: viene determinata la produzione di sakacina mediante la verifica dell’attività antimicrobica contro

Listeria. Per questo step viene utilizzata Listeria innocua, un surrogato di L. monocytogenes. Viene

preparata la piastra contenente listeria innocua addizionando nel terreno TSA molle caldo 1% v/v di una

coltura di Listeria innocua, viene agitata e vengono prelevati 20 mL da porre nella piastra. A questo punto

viene lasciata solidificare. Si parte poi dalla coltura liquida di L. sakei incubata per 24 ore che viene

centrifugata ottenendo cosi il filtrato colturale che viene diluito secondo una serie di diluizioni (1:5, 1:10, 1:20,

1:30, 1:50). Quando la piastra con L. innocua è solidificata, vengono depositati sulla superficie 5 microlitri

delle diluizioni di L. sakei in punti distanti, la piastra viene poi incubata a 37 gradi per 24 ore. Se L. sakei ha

prodotto Sakacina, allora dopo l’incubazione della piastra si potrà verificare la presenza di aloni chiari nei

punti in cui sono state depositate le vari diluizioni. Questi aloni dimostrano che il microrganismo ha

prodotto sakacina che ha un effetto su Listeria. Per valutarne l’attività si fa: 10

l'alone

cui vede

elevato in si

diluizione

Ultima

(A) +

Sakacina = 3

Le batteriocine vengono studiate come conservanti naturali, con il focus sulle strategie di bio-conservazione (usare

microorganismi o loro prodotti naturali e bioattivi da vegetali per aumentare la shelf life degli alimenti). Il problema dei

bioattivi da vegetali, spesso contenuti negli olii essenziali, è che hanno un aroma caratteristico che può interferire con le

caratteristiche sensoriali; inoltre, l’aggiunta di un composto che maschera l’eventuale deterioramento del prodotto è

vietata per legge in UE

Vantaggi:

• sono naturali, prodotte da microorganismi sicuri e non da sintesi chimica;

• assenza di tossicità, vengono degradate nell’intestino dalle proteasi come tutte le proteine presenti negli alimenti;

• non inducono resistenza nei patogeni, almeno per il momento pare non provochino lo sviluppo di resistenza in altri

microorganismi;

• attive a basse concentrazioni;

• non alterano le caratteristiche sensoriali dei prodotti.

Svantaggi:

• ristretto spettro di inibizione (soprattutto verso i Gram -), anche se posso giocare con altri componenti. Per esempio,

aggiungendo detergente EDTA è possibile disgregare la membrana esterna dei Gram -, esponendoli alla batteriocina;

• soggette a restrizioni normative (l’unica approvata è la nisina) e l’approvazione come additivo alimentare non è banale;

• interferenza con altri ingredienti (es. si lega ai fosfolipidi presenti nella matrice e non attacca la membrana cellulare

del patogeno) nella matrice alimentare o sue caratteristiche, come il pH (gli studi in vitro e in vivo a volte non coincidono

nei risultati). stulati)

(molt

o

I microrganismi citati producono: sakacina, plantaricina e curvacina.

Dal punto di vista normativo, l’utilizzo di batteriocine in forma pura è vietato (ad eccezione della nisina)! Pertanto,

per bypassare la normativa, le aziende ricorrono all’utilizzo di preparati liofilizzati di brodocolture liquide di ceppi

produttori di batteriocine. Non vengono effettuati processi di estrazione e purificazione, viene venduta tutta la

brodocoltura sottoposta a trattamenti termici e allontanamento di acqua. In questo modo, i batteri lattici muoiono

e rimango le batteriocine termostabili. È un preparato sporco, contiene anche residui di cellule e terreno colturale.

Uso delle batteriocine nell’active packaging

Il confezionamento degli alimenti avviene in un film che ha azione antimicrobica. La batteriocina viene incorporata

nell’imballaggio in due modi:

• incorporamento diretto nella matrice del film = la batteriocina si mescola agli altri ingredienti in fase di

produzione del film. Una parte di batteriocina potrebbe non andare mai a contatto con l’alimento poiché si

trova nella parte centrale del film;

• –

spalmatura sulla superficie del film coating = si effettua un rivestimento bioattivo della superficie di un film

già prodotto.