Domande e Risposte per l'esame di Fermentazioni Industriali

Stadio 1 - Prestadio di sviluppo vegetativo

In questo primo stadio bisogna far crescere la biomassa per fare l'ossidazione del glucosio e questo viene chiamato stadio vegetativo.

• pH: 6,5 (lievemente acido)
• Temperatura: 30°C
• Tempo: 72 ore (3gg)
• Aerazione: 0,5-1 vvm (volumi d'aria per volumi di coltura al minuto)

Questo terreno non è molto importante dal punto di vista del processo perché serve per lo sviluppo della muffa.

Stadio 2 - Produzione

Una volta che il micelio è cresciuto, si trasferisce la muffa in una soluzione di solo glucosio e qui il mo non deve crescere, ma deve solo attivare la glucosio ossidasi e la catalasi.

• Substrato: Glucosio 180-220 g/L (La soluzione di glucosio di solito è intorno ai 200g/L)
• Inoculo: 10% v/v
• Temperatura: 30-33°C
• Tempo: 20 ore
• pH: 5,5-6,5 viene mantenuto lievemente acido non e bisogna scendere troppo, con il pH=3 altrimenti la glucosio ossidasi si inattiva

pH tende a scendere durante il processo perché si produce l'acido. Se non viene controllato il pH si inattiva l'enzima e anche la reazione di apertura del lattone è lenta.

Aerazione: 1,5 vvm: è tra le più alte in assoluto perché è un'ossigenazione, bisogna dare ossigeno alla glucosio ossidasi.

Correzione di acidità - 2 casi:

• Aggiungendo gocce di soda (idrossido di sodio) e in questo caso si forma il sale corrispondente che è il gluconato di sodio
• Aggiungendo il carbonato di calcio come polvere dentro questa soluzione di glucosio e quando il pH scende, il carbonato va in soluzione e il pH rimane costante e si forma il gluconato di calcio.

Quindi il primo stadio è per far crescere la biomassa, mentre il secondo stadio è l'aggiunta della soluzione di glucosio e in questo il mo non cresce più ma fa l'ossidazione.

Resa di conversione: Y=0,95

Resa di

fermentazione: 170-200g/L.

Note Conclusive: IL processo ha bisogno di due reattori, uno per ogni stadio.

La soluzione fornita deve contenere glucosio in forma più pulita possibile, ovvero non bisogna utilizzare ad esempio il melasso perché si ha il saccarosio che da fruttosio e glucosio e così come tutti gli ingredienti che possono contenere degli altri componenti oltre al glucosio.

L'acido gluconico è classificato come prodotto ottenibile da metabolismo aerobio per biotrasformazione microbica.

Il microrganismo coinvolto nel processo non si sviluppa, ma agendo da biolocalizzatore opera la sola ossidazione selettiva, in posizione C1 del glucosio. Per questa motivazione la resa di conversione è tra le più alte della microbiologia applicata, circa il 95% del glucosio inserito in fase di produzione viene trasformato in acido gluconico, questa è alta perché il glucosio serve solo per dare acido gluconico ovvero non vi sono altre vie.

metaboliche.

• IN QUESTO PROCESSO NON SI HA LO SVILUPPO MICROBICO, MA SOLO LA FORMAZIONE DEL PRODOTTO.

Variante di Processo:

Ci sono dei sistemi che consentono di aumentare la produttività di questo processo. Una variante di processo che diminuisce i costi è il riutilizzo del micelio fino a 2 volte.

1. sedimentazione per 30 minuti a fine fermentazione, in assenza di aerazione e agitazione
2. recupero del micelio unilateralmente al 20% di filtrato colturale (se si toglie tutta la parte liquida rimane un ammasso di pellet che non si riesce a movimentare)
3. trasferimento in un bioreattore contenente solo glucosio

Nel secondo recupero non si ha più una resa di conversione del 95% perché riutilizzando la biomassa, essa perde di efficienza. Questo consente di diminuire i costi perché non si ha tutte le volte la produzione di 3 giorni. Quindi riutilizzando il micelio è possibile migliorare l'efficienza del processo. Si ha la formazione di acido

gluconico in tempi più brevi per la mancanza del prestadiodi sviluppo.

Sottoprodotti: Una volta che il micelio viene scartato è possibile recuperare gli enzimi utilizzati, ovvero si estraggono la glucosio ossidasi e la catalasi, che sono due enzimi che hanno valore commerciale (ad esempio la glucosio ossidasi è presente negli stick del controllo della glicemia).

L'acido gluconico può essere ottenuto anche da Gluconobacter suboxydans

Impieghi dell'acido gluconico:

• Agente lievitante
• Uso farmacologico (complessante del ferro)
• Trattamento della ruggine

Review Acido Gluconico: Usato nelle bavande per ridurre l'opacità, ma costo ancora molto alto: uso ristretto in alcuni campi

Processo Produzione: Fermentazione, Ossidazione chimica/elettronica chimico vs Fermentativo

Processo di produzione di acido citrico: coltura stazionaria o sommersa

Esso è un intermedio del ciclo di krebs quindi la sua produzione è

più complicata. L’acido citrico è stato estratto dagli agrumi (limoni e limetta che ne contengono il 7-9%). Attualmente il 99% dell’acido citrico prodotto a livello mondiale viene ottenuto per via microbiologica (oltre 1,5 milioni di t nel 2010). Dal punto di vista industriale esso viene prodotto da una muffa Aspergillus niger che è aerobia. E’ stato anche sviluppato un processo con un lievito che si chiama Yarrowia lipolytica; questo però ha degli inconvenienti perché produce oltre all’acido citrico anche altri acidi che sono poi difficili da separare. • È preferibile quindi l’utilizzo di Aspergillus perché la produzione è più selettiva. Biochimismo: l’acido citrico è il primo intermedio del ciclo di krebs: il glucosio arriva a piruvato tramite la glicolisi il piruvato che ha 3C perde un atomo di C, si lega al CoA e diventa acetil-CoA, si combina con l’ossalacetato e diventa

citrato che viene subito trasformato in cis-aconitato dall'enzima aconitasi. Se quello che ci interessa è un intermedio bisogna cercare di bloccare l'enzima a valle della produzione della molecola che ci interessa. Se viene bloccata l'aconitasi si ha l'accumulo del citrato, ma il metabolismo microbico è finemente regolato quindi quando l'acido citrico raggiunge un certo livello (concentrazione) arriva ad inibire uno dei primi enzimi della via metabolica. Questo enzima che viene inibito è la PFK (fosfofruttochinasi) che trasforma il fruttosio-6-fosfato in fruttosio-1,6-bifosfato nella via glicolitica che sta a monte.

INIBIZIONE A MONTE:

Questa rimozione dell'inibizione si ottiene togliendo il manganese nel terreno colturale e aumentando invece gli ioni ammonio. Questa modifica al terreno colturale è una modifica dei cofattori degli enzimi. Il manganese è un ione che tende a bloccare la PFK, mentre l'ammonio è un

attivatore di questo enzima. In questo modo si antagonizza l'inibizione per far lavorare in modo migliore la PFK.

INIBIZIONE A VALLE:

Successivamente bisogna bloccare l'attività dell'aconitasi, la quale lavora avendo come cofattori importanti il ferro ed il manganese. Per bloccare l'enzima questi vengono tolti dal terreno in modo che l'enzima lavori male e si mette il rame che compete con ferro e manganese.

• Questi metalli sono principalmente presenti nell'acqua di rete che viene utilizzata per diluire tutti gli ingredienti, i quali non si sciolgono in acqua distillata ed è per questo che si usa l'acqua di rete. L'acqua di rete a seconda delle zone può contenere diversi metalli in quanto le tubature sono costituite da ferro.
• L'altro componente che può avere questi metalli è il melasso che è l'ingrediente principale che si usa come fonte di C ed è un concentrato di saccarosio.

• acqua (trattata per eliminare ferro e manganese ed eliminare il rame)
• melasso

• allestimento di COLTURE DI SUPERFICIE liquide, statiche, aerobie, in basso strato
• allestimento di COLTURE SOMMERSE (circa 80% produzione mondiale fatta così)

• Substrato: UE – melasso 160 g/L (USA – glucosio) caricato tutto a inizio fermentazione
• Terreno colturale: saccarosio, Nitrato di Ammonio (NH NO3), Ferro e Manganese (basse concentrazioni 0,05-0,5 mg/L) e ferrocianuro
• pH: iniziale: 6-6,5 in trofase 1,5-2 in idiofase
• Inoculo: spray di spore o spore in sospensione quando è terminata la sterilizzazione
• Incubazione: Temperatura 30°C e aerazione per

• Trofase: fase di sviluppo con formazione di micelio compatto superficiale in 30-48 h
• Idiofase: fase di accumulo e produzione dell'acido in 8-14 gg
• Resa di conversione: Y=0,7-0,8

Quando si ha l'accumulo di un intermedio di una via metabolica, non possiamo bloccarla totalmente altrimenti si ferma tutto il metabolismo quindi l'aconitasi lavora ancora un po', la quale permette di terminare il ciclo di krebs. Quindi la resa di conversione non è molto alta perché una quota di acido citrico viene trasformata.

• Resa di fermentazione: 1,2-1,5 kg/m
• Recupero: a fine processo si avrà un vassoio coperto da un tappeto di muffa che assume una pigmentazione nera completa e sotto rimane il liquido, nel quale viene accumulato l'acido citrico. Per recuperare la parte liquida dove è presente l'acido citrico, si prendono i vassoi e si inclinano in un lato, quindi la parte liquida

viene convogliata verso un tank. Quindi nelvassoio vi residua solo il tappeto di muffa. Per aumentare la % di recupero si strizza il micelio,perché una parte di acido citrico potrebbe esser intrappolata nel tappeto di ife, quindi si usala canna dell’acqua che permette di lavare il micelio rimasto sul vassoio, si strizza con unpistone e l’acqua di lavaggio ottenuta viene convogliata insieme al terreno colturale liquidorecuperato prima per avere il recupero completo dell’acido citrico.→ Il processo di superficie è svolto anche in coltura solida (500 t/anno al mondo) in impianti dipiccole dimensioni.

PROCESSO IN COLTURA SOMMERSA Downstream:

Isolamento e Purificazione

• Substrato: saccarosio da melasso 160 g/L: 40 g/L in trofofase e 120 g/L in idiofase
• →pH: 5 in trofase 2-3 in idiofase
• →Inoculo: spore fatte pregerminare per 24 h a 32°C Inoculo finale: 10% v/v
• Temperatura: 28-32°C