Domande e Risposte per l'esame di Fermentazioni Industriali

DOMANDE ESAME FERMENTAZIONI INDUSTRIALI

3 DOMANDE:

1 DOMANDA: COLTURE – 1 domanda tra le seguenti:

ª • Coltura batch: aspetti cinetici ed equazione di monod (grafico)

• .

Coltura batch: definizione di Ks e relazione con Bilanci di biomassa e di substrato dx/dt o

ds/dt.

• Coltura continua: Parametri coinvolti (D velocità di diluizione), concetto di steady state,

bilanci di biomassa e di substrato. (grafico di D in funzione di x e di S, concetto di

chemostato, turbidostato).

• Coltura fed-batch

2 DOMANDA: PROCESSO DI PRODUZIONE DI ACIDI ORGANICI – 1 domanda tra le seguenti:

ª

(biochimismo, processo metabolico, tempi, T, resa di conversione, nome del mo ecc.)

• Processo di produzione di acido lattico

• Processo di produzione di acido gluconico

• Processo di produzione di acido citrico: coltura stazionaria o sommersa

3 DOMANDA: ARGOMENTI VARI – 1 domanda tra le seguenti:

ª • Procedure di valutazione dello sviluppo microbico: dirette o indirette (vantaggi e

svantaggi)

• Bioreattori non convenzionali

• Aerazione: strategie di miglioramento del trasferimento di ossigeno

• Colture di cellule animali: caratteristiche e bioreattori

• Colture di cellule vegetali: caratteristiche e bioreattori

• Immobilizzazione di cellule microbiche per intrappolamento in gel: vantaggi e svantaggi,

procedura

Coltura batch: aspetti cinetici ed equazione di monod (grafico)

La coltura batch è un sistema chiuso perché nel corso del processo non si hanno aggiunte di

substrato o prelievi di coltura (al massimo si può aggiungere un correttore di pH o si può effettuare

un prelievo di quantità limitata di volume per controllare che il mo sia cresciuto).

Lo sviluppo prosegue fino all’esaurimento del substrato.

La coltura batch è un sistema che passa attraverso diverse

fasi della vita della cellula.

Il grafico di vitalità di una coltura batch presenta:

• sull’asse X il tempo

• sull’asse Y il numero di mo espresso in log

La curva non parte mai dall’intersezione degli assi.

1- Fase di Latenza:

• la popolazione rimane costante

• la cellula sintetizza nuovi componenti e si adatta alle condizioni ambientali

• la durata di questa fase è variabile

• →

non si ha incremento di biomassa Tempo morto: deve durare meno possibile

• velocità di crescità è nulla

2- Fase di Accelerazione:

• le reazioni metaboliche raggiungono una condizione di equilibrio

• la velocità inizia ad aumentare

3- Fase Esponenziale:

• la velocità di crescita raggiunge il massimo e rimane costante in tutta la fase

• la velocità è indipendente dalla concentrazione di substrato che in questa fase è in eccesso

• la popolazione è uniforme

• i costituenti cellulari sono prodotti a velocità costante gli uni rispetto agli altri

4- Fase di Decelerazione:

• la fase esponenziale si interrompe bruscamente

• la velocità di crescita diminuisce:

• si aprono vie metaboliche secondarie produzione metaboliti secondari

• la composizione della biomassa può cambiare:

• i prodotti di biosintesi raggiungono in questa fase la massima produzione

• generalmente i processi produttivi di biomassa e metaboliti primari vengono

interrotti nella fase di decellerazione

5- Fase Stazionaria:

• la popolazione rimane costante:

• la riproduzione cellulare si arresta

• velocità di sviluppo delle cellule = velocità di morte delle cellule

• cause del raggiungimento di questa fase:

• limitata disponibilità di nutritili

• acccumulo di sostanze tossiche

• Risposta cellulare: cambiamenti morfologici e produzione di spore

Durante questo sviluppo si ha:

• un incremento del numero di cellule, ovvero si ha una duplicazione

• aumenta anche il volume delle cellule (diventano più grosse dopo fase esponenziale):

L’andamento della curva di un mo è strettamente dipendente dal tipo di substrato, fonte di C ed

energia. Il substrato deve essere utilizzato, ovvero deve diminuire nel corso del tempo e l’utilizzo

deve essere a favore della biomassa e del composto che voglio far produrre al mo.

Quando siamo in fase di crescita esponenziale della coltura batch, il mo ha disposizione tanto

substrato in eccesso e quindi può svilupparsi alla massima velocità possibile.

Dopo un certo punto il SUBSTRATO inizia a diventare LIMITANTE e la velocità di crescita

diminuisce. Qui si trova la fase di decelerazione, ovvero la curva si inizia ad appiattirsi.

La diminuzione della velocità di crescita e la cessazione dello sviluppo (fase di declino) è descritta



da una relazione tra e la concentrazione residua di substrato: S diventa limitante lo sviluppo

Monod ha dimostrato la seguente relazione:

KS è la costante di saturazione:  max

equivale alla concentrazione di S cui corrisponde = ½ 

Secondo Monod dovrebbe essere possibile fissare la velocità specifica di crescita a valori ben

max

definiti in funzione di S compresi fra 0 e variando la concentrazione del S

Possono essere individuate delle correlazioni tra la curva che descrive Monod e la curva di crescita

.

Coltura batch: definizione di Ks e relazione con Bilanci di biomassa e di substrato

dx/dt o ds/dt.

Bilanci di Biomassa e di substrato: la variazione della biomassa è data da:



La velocità specifica di crescità

 è la velocità specifica di crescita ed è riferita all’unità di massa x



In generale può essere riferita a:

• Biomassa (X)

• Prodotto (P)

• Substrato (S):  →

Basse concentrazioni di S condizionano effetto da S limitante (fase decelerazioene)

 →

Alte concentrazioni di S condizionano raggiunge il valore MAX (fase esponenziale)

La velocità volumetrica si esprime in g/Lh che si formano, è una caratteristica dell’attività

istantanea del bioreattore ed è funzione della popolazione presente.



La velocità specifica invece è espressione della velocità riferita all’unità di massa:



La velocità specifica è una proprietà intrinseca del sistema microrganismo-substrato e

Quindi:

descrive lo stato istantaneo della coltura.

Sia la velocità volumetrica che la velocità specifica non sono costanti, ma variano nelle diverse fasi

dello sviluppo microbico.

Per i due tipi di velocità i massimi non coincidono nel tempo:

→

Velocità volumetrica max in fase di decelerazione

→

Velocità specifica max in fase esponenziale

L’ottimizzazione di un processo fermentativo prevede la messa a punto delle condizioni operative

che prevedono un compromesso tra i due massimi.

Il valore di KS è indice dell'affinità del microrganismo per il S

si evince che esiste una correlazione inversa tra µ e

KS→ KS è al denominatore quindi:

• Alto valore di Ks→ Bassa affinità

• →

Basso valore di Ks Alta affinità

Generalmente si cerca di operare a basse KS (scelta adeguata del substrato) S>>Ks

 →

risulta indipendente dalla concentrazione di S non è possibile influire sulla crescita



→ caratteristica della coltura batch: lavorare sempre a e fare in modo che

max

questa fase duri più a lungo possibile

Coltura continua: Parametri coinvolti (D velocità di diluizione), concetto di steady

state, bilanci di biomassa e di substrato. (grafico di D in funzione di x e di S, concetto

di chemostato, turbidostato).

La coltura continua nasce dall’esigenza di ridurre i tempi morti presenti nella coltura batch.

La coltura continua è un sistema aperto con scambio continuo e costante con l'esterno di

substrato, biomassa e metaboliti.

Si ha il continuo rifornimento di terreno colturale a velocità costante, alla stessa velocità si ha il

prelievo di un ugual volume di coltura.

• il volume della coltura è costante

• la velocità di sviluppo è costante

• continuo ingresso di substrato (rifornimento di terreno colturale)

• continua fuoriuscita di brodocoltura (cellule + metaboliti + S residuo) con scambio con

l'esterno di substrato, biomassa e metaboliti

Parametri della coltura continua

Chemostato e Turbidostato

Bilanci di massa e di substrato – Steady State

Quando si esegue il bilancio bisogna considerare l’input e l’output del sistema

Il sistema raggiunge lo stato stazionario (steadystate) quando non si ha variazione di biomassa

quindi:

Lo sviluppo bilancia esattamente la biomassa che esce dal sistema per cui:

→

Volume Costante (D=F)

Il sistema raggiunge lo stato stazionario (steadystate) quando non si ha variazione di

concentrazione di substrato quindi:

Relazione tra μ e D →

La velocità specifica μ è correlata a D, in particolare sul flusso F, essendo il volume V costante

μ può essere modificata agendo su D (D=F/V)

Allo steady statela velocità specifica è controllata da D, quindi dal flusso variabile sperimentale.

La determinazione della velocità specifica di crescita è di fondamentale importanza per la gestione

della coltura continua.

Andamento di X e S in funzione di D

• Si lavora di solito a valori parì a meta D critico fino a 2/3

In funzione di D si possono verificare 3 situazioni differenti: max

La velocità di washout della biomassa x è superiore alla velocità di crescita (w>max)

1- • La concentrazione della biomassa diminuisce

• La concentrazione del substrato limitante tende a risalire al valore iniziale So

max

2- La velocità di washout della biomassa bilancia la velocità di crescita (w=max)

• Si ha una condizione stazionaria

• Il substrato limitante rimane costante (condizione piuttosto instabile)

max

3- La velocità di washout della biomassa è minore della velocità di crescita (w<max)

• La concentrazione di biomassa aumenta

• Si ha un maggior consumo di substrato

• 

La diminuzione di S fa diminuire finché eguaglierà la velocità di washout

• =

Si raggiunge uno stato di equilibrio in cui si ha: w = D

• < max

In questo caso la e dipende da D



Relazioni tra D, e KS

• Da KS dipendono le concentrazioni di S residuo e di biomassa, e la massima D impiegabile

• Le caratteristiche cinetiche di un microrganismo e quindi l'andamento dello sviluppo in

max

chemostato, dipendono da e KS

• max

Da dipende la massima D impiegabile

• max

All'aumentare di D, il S residuo aumenta fino a quando D si avvicina a (Dcrit), S

aumenta, in misura diversa in funzione di Ks ovvero in base all’affinità.

→RICICLO CELLULARE: Posso lavorare a D>max (condizione instabile: non si raggiunge steady

state) SOLO facendo un riciclo delle cellule in uscita dal sistema che escono prima di svilupparsi

→ Elevato grado di depurazione (trattamento effluenti)

Coltura fed-batch

La coltura feed-batch trova applicazioni in diversi casi di inibizione da:

→ →

- Prodotto Produzione Penicillina Effetto Diluizione

→ →

- Substrato Produzione di Lievito da Pane S aggiunto in funzione a velocità di consumo

➔ SI EVITA IN OGNI CASO L’INIBIZIONE: aggiunta continua di substrato SENZA prelievo

Il substrato nella coltura feed-batch ha

un andamento diverso: quello che

viene aggiunto viene subito

consumato, poi se ne aggiunge altro

che viene subito consumato ecc…

• Coltura continuamente alimentata senza uscita di brodocoltura

• V0 può anche essere 1/10 del V totale.

• Nella fase iniziale la coltura è identica ad una c.batch

• Quando le cellule entrano in fase log, inizia il feed.

• FEED può essere costituito da:

▪ SINGOLI NUTRILITI: sviluppo si ferma per carenza di uno:

→ Si aggiunge solo quel nutriente

▪ TERRENO COLTURALE COMPLETO: potrebbe svilupparsi all’infinito l’unico limite è il

→

volume del reattore Generalmente si usa questo tipo di feed

I Parametri:

• Variazione di volume in funzione della portata:

• Volume aumenta in modo lineare a un dato tempo t:

• → →

Nella coltura continua: D = F/V Coltura batch

➔ Feed-batch: D NON E’ COSTANTE MA DIMINUISCE PROGRESSIVAMENTE

Esempio: Produzione di Amilasi Alti livelli di amido (S)

rendono coltura molto

→

viscosa Aggiungo

amido poco alla volta

e ovvio il problema

Considerazioni:

• Coltura ideale per produzione di metaboliti non associati a sviluppo microbico

• Per avere alte concentrazioni di prodotto serve un’alta concentrazione cellulare

→Segue una fase biosintetica (non è possibile con la coltura multistadio

Fasi della coltura feed-batch:

1. FASE DI SVILUPPO: cellule crescono fino a raggiungere la concentrazione prestabilita

2. FASE BIOSINTETICA: fase in cui viene fornito il feed (terreno colturale completo o singolo

nutriente) necessario alla biosintesi del Prodotto, ad una data concentrazione e ad una

velocità predefinita

➔ Se l’Alimetnazione (Feed) viene interrotta significa che:

▪ →

Perdita di vitalità della biomassa Calo produzione

▪ Raggiunto Volume Max del bioreattore

➔ Presupposti per fare la coltura:

▪ Biomassa allo stato vitale

▪ OSSIGENO SEMPRE IN ECCESSO

▪ Presenza di 1 S limitante con tutti gli altri nutriliti in eccesso

Tipi di coltura feed-batch:

Vantaggi:

• Possibilità di incrementare produzione di biomassa

• Possibilità di impiego di Substrati in gradi di inibire sviluppo microbico se usati ad alte conc.

• Possibilità di ottenere metaboliti non legati allo sviluppo microbico:

Osservazioni:

• Minor incidenza della repressione dei cataboliti per effetto diluizione (es. diminuzione di

viscosità nella produzione di amilasi)

• Rispetto a coltura continua minor incidenza nei riflessi dei fenomeni di mutazione e

instabilità plasmidica

Processo di produzione di acido lattico

L’acido lattico può essere prodotto in tre forme:

• Forma L(+)

• Forma L(-): sarcolattico

• Forma DL in miscela racemica

La presenza nella molecola di due gruppi funzionali diversi conferisce ad essa una naturale tendenza

a polimerizzare.

Impieghi dell’acido lattico:

• Acidulante in settore alimentare e farmaceutico

• Materia prima per la produzione di polimeri biodegradabili

• Utilizzato come Ammonio Lattato nell’alimentazione animale

E’ prodotto dai batteri lattici sia eterofementati (fermentano il glucosio producendo acido lattico,

etanolo/acido acetico e CO2) che omofermentati (fermentano il glucosio producendo quasi

unicamente acido lattico).

A livello industriale si usano principalmente ceppi omofermentanti, in quanto non producono

metaboliti secondari, considerati indesiderati ai fini economici e di processo

Biochimismo:

L’acido lattico si ottiene attraverso un metabolismo anaerobio.

l’acido lattico deriva dal catabolismo del glucosio, attraverso la via glicolitica per riduzione del

piruvato ad opera delle lattato deidrogenasi, a dare acido lattico.

Bilancio:

• Teorico: Da una mole di glucosio si ottengono 2 moli di acido lattico.

• Reale: La resa reale è il 90% del teorico.

La resa di conversione Y esprime il rapporto tra il prodotto ottenuto in peso e substrato utilizzato

in peso. Questa resa in questo processo è altissima (0,9-0,95) e quindi vuol dire che tra il 90 e il

95% di glucosio consumato si trasforma in acido lattico.

Processo:

• Microrganismo: Lactobacillus delbruckii subspecie bulgaricus (m.o. omofermentante

principale, non si usa lo Streptococcus perché è meno acido tollerante).

• Temperatura di processo: 40-45°C in quanto in mo è termofilo

• Substrato: Glucosio 150 g/L, il quale viene fornito non puro ma ci sono in commercio degli

sciroppi di glucosio (poco costosi).

• Inoculo: 3-5% v/v

• Resa di conversione: Y=0,9-0,95.

• Resa di fermentnazione: 135 g/L (pissibilità di variazioni in base alla tecnologia adottata)

Quindi: se mettiamo 150g/L di glucosio, il 90-95% (resa di conversione) di questo diventa acido

lattico quindi la resa di fermentazione è 135g/L di acido lattico.

• pH: 5,5-6,5 (così che il m.o. possa contunuare a usare il substrato)

In un fermentatore c’è un controllo del pH, ovvero c’è una sonda immersa nella coltura ed un

intervallo di pH consentito; quindi se il pH rimane tra 5,5 e 6,5 non si attiva nessuna correzione

mentre se il pH scende sotto il livello di 5,5 si attiva un sistema che consente l’ingresso di una base

per rialzarlo.

• Tempo: 72 ore

• Correzione di acidità - 2 casi:

✓ Neutralizzare con idrato d’ammonio NH4OH (ammoniaca) che porta alla

formazione di acido lattico e alla formazione del sale corrispondente, ovvero

lattato d’ammonio che è un sale solubile che andrà poi recuperato.

✓ Tamponare con carbonato di calcio (CaCO3) che è una polvere insolubile a pH

neutri e quindi quando si formula il terreno a pH 6-7 si ha una polvere sul fondo

del fermentatore e man mano che il pH scende per produzione di acido lattico, il

carbonato di calcio si solubilizza quindi insieme all’acido lattico si forma il lattato

di calcio. Se si sa quanto acido lattico si forma, si possono ricavare le moli di questo

utilizzando il suo peso molecolare, le quali sono stechiometriche a quelle di

carbonato di calcio che ci servono e