Domande aperte di Funzione e dinamica delle proteine intracellulari

6)PERCHÈ LE PROTEINE PICCOLE NON HANNO BISOGNO DI

TRASPORTATORI

Le proteine più piccole non hanno bisogno di trasportatori specifici perché basta il

gradiente di concentrazione per farle diffondere o attraverso le membrane ma se

parliamo di proteine basta il gradiente per farle diffondere attraverso canali (per

esempio alcune proteine possono entrare o uscire dal nucleo senza avere trasportatori

specifici).

7)ESPORTAZIONE DI RNA

L’esportazione di RNA dal nucleo è un processo molto importante perché nel nucleo

vengono prodotti tRNA, rRNA e mRNA che poi serviranno nel citosol per produrre le

proteine. I tRNA e i rRNA si legano alle esportine e utilizzano il gradiente di ran-GTP

per uscire dal nucleo. In generale questi si legano alle esportine (recettori di

esportazione nucleare) nel quale nel nucleo Ran-GTP si lega e promuove il legame

esportina-cargo. Questo complesso segue il gradiente di ran-gtp (presente solo nel

nucleo e non nel citosol e quindi tende a uscire) e quando esce infatti incontra subito

una Ran-Gap che stimola idrolisi di GTP in GDP. Quando si forma Ran-GDP viene

rilasciato il carico e poi Ran-GDP seguendo il gradiente ritorna nel nucleo dove c’è

ran-GEF che ripristina Ran-GTP che poi agirà di nuovo.

Gli mRNA invece seguono un altro tipo di trasporto mediato da RNA exporter

(vengono portati fuori come ribonucleoproteine). Questi sfruttano idrolisi di ATP per

essere trasportati. In generale gli RNA exporter sono dei dimeri formati da NXF1(lega

RNA, e le sequenze FG) e NXT1 (lega NXF1 e le sequenze FG). Questo dimero (si

trova nel nucleo) lega le Fg del poro nucleare e quindi attraversa il poro uscendo da

nucleo. Qui interviene un elicasi associata ai filamenti citoplasmatici del poro che

rompe il legame tra NXT1 e NXF1 che si disassemblano, rilasciano il cargo e rientrano

come monomeri nel nucleo.

8)MISSFOLDING PROTEICO

Le proteine vengono prodotte dal ribosoma come lunghe catene polipeptidiche di

residui amminoacidici legati con legame peptidico tra di loro. Le proteine per essere

funzionanti non devono rimanere in forma distesa ma devono ripiegarsi prima in

strutture secondarie e dopo in strutture terziarie e in alcuni casi quaternarie. Quando

una proteina si folda correttamente raggiunge la sua conformazione nativa, che è la

struttura con la minore energia libera possibile, la proteina è stabile in questa

conformazione e in grado di svolgere le sue funzioni biologiche. Una proteina durante

il folding però può andare incontro a ripiegamenti errati che in alcuni casi non sono

stabili e vengono corretti, ma in alcuni casi questi folding errati sono stadi di energia

libera basi quindi stabili e che sono difficili da correggere. In questo caso la proteina si

dice che è missfoldata quindi ripiegata in modo errato. Quando una proteina è ripiegata

in modo errato potrebbe per esempio esporre sulla sua superficie dei residui idrofobici

che dovrebbero stare all’interno oppure potrebbe avere una conformazione molto

diversa da quella nativa e quindi non essere funzionale. Il caso più dannoso è quando

vengono esposti dei residui idrofobici che possono portare ad aggregazione tra più

proteine portando a formare degli aggregati di proteine che possono poi risultare

citotossici e portare alla morte della cellula. Quando una proteina è missfoldata

intervengono dei sistemi della cellula che possono mandare verso la degradazione

questa proteina, uno dei più comuni è quello di degradazione proteasoma dipende. Una

proteina può essere riconosciuta da ubiquitine ligasi, essere ubiquitinato ed essere

infine degradata. Inoltre il proteasoma 19S quado opera da solo è in grado di

riconoscere e degradare in modo molto efficiente le proteine che sono missfoldate.

Inoltre alche il proteasoma 20s da solo può degradare le proteine missfoldate in questo

caso con un meccanismo ubiquitina indipendente nel quale una proteina con aumentata

idrofobicità diventa affine per questo proteasoma e quindi entra e viene degradata.

9)AUTOFAGIA

L’autofagia è un processo messo in atto dalle cellule quando si trovano in condizioni

di deprivazione di nutrienti o quando ci sono aggregati proteici da eliminare. Questo

processo è molto importante perché permette alla cellula di “mangiare” parti di sé

rovinate o non funzionanti bene che possono danneggiarla (aggregati proteici) o

componenti cellulari che possano fornire molti nutrienti alla cellula. Questo consente

quindi un riciclaggio delle componenti cellulari danneggiate per formarle nuove e

intanto riuscire ad affrontare condizioni in cui mancano amminoacidi nella cellula. La

degradazione avviene ad opera dei lisosomi che con le idrolasi acide degradano i

componenti che devono essere degradati. Questo è un processo strettamente regolato.

Nell’autofagia si formano specifici comparti cellulari che sequestrano le componenti

cellulari che devono essere degradate. Quando viene indotta l0autofagia si formano de

novo delle componenti membranose nel citoplasma (fagofori) che si espandono e

diventano poi sferiche e a doppia membrana (autofagosomi). nell’autofagosoma la

membrana esterna si fonde con quelle dei lisosomi permettendo la degradazione delle

componenti cellulari delimitate dalla membrana interna. Questo processo non è

selettivo e media la degradazione di tantissime proteine intracellulari ma anche di

organelli (mitofagia).i corpi autofagici sono le componenti cellulari da degradare

racchiuse nella membrana interna dell’autofagosoma. Nell’autofagia abbiamo un sito

di assemblaggio del fagoforo (detto PAS). Il fagoforo è una struttura membranosa che

inizia a inglobare tutto ciò che deve essere degradato e questo si inizia a formare al

PAS e infatti quasi tutte le proteine coinvolte nell’autofagia passano dal pas. Quando il

fagoforo si richiude si è formato l’autofagosoma. Le membrane che formano queste

struttura derivano dal RE e dal Golgi. Una delle principali proteine che interviene

regolando l’autofagia è la chinasi TORC1. Questa chinasi è una chinasi che, quando è

attiva (in condizioni di abbondanza di nutrinrit9) e inibisce l’autofagia, invece questa

è inattiva quando siamo in starvation e in questo caso attiva autofagia. Interviene anche

regolando la proliferazione (si quando è attiva no quando è inattivo). Questa serina-

treonina chinasi è regolata da EGO 8complesso localizzato a livello del vacuolo e

firmanti da 4 proteine Ego1,ego3,gtr1 e Gtr2). Quando questo complesso si trova ad

avere GTP legata su gtr1 e GDP legata su gtr2 attiva il complesso torc1 invece bella

condizione opposta inattiva torc inducendo autofagia. Questo complesso trovandosi sul

vacuolo sente i livelli intracellulari dui leucina e quelli all’interno del vacuolo.

Le proteine che vengono coinvolte nell’autofagia le chiamiamo Atg e sono di vario

tipo, alcune sono delle chinasi, altre proteasi altre ubiquitina ligasi. Un esempio è la

chinasi Atg1 che forma che forma un complesso con altre Atg(13,17,29,31) e è tutto

coinvolto nella formazione dell’autofagosoma. Atg1-Atg13 va a forma un complesso

con altre proteine che si attiva in risposta a starvation (atg13, per esempio, si attiva

quando torc1 non la inibisce più).

È anche il portante il complesso della fosfatidil-inositolo 3 chinasi che è coinvolto nella

nucleazione(processo della mobilitazione delle proteine richieste per l’espansione del

fagoforo al pas). Questa chinasi è responsabile della produzione del fosfatidil-

inositolo3 fosfato che è essenziale nella localizzazione di Atg18-Atg2 al PAS. Questi

poi sono essenziali per il reclutamento di Atg8,Atg9 e Atg12 al PAS. Atg18 si associa

al fosfatidilinositolo 3 fosfato e quindi tutto si associa a Atg2 e questo recluta Atg9 al

APS. Atg9 è responsabile del trasporto delle membrane al PAS. esiste anche la proteina

Atg8 che può essere coniugata alla fosfatidil etanolammina ( componente importante

nelle membrane). Questo viene sintetizzato come precursore con una sequenza che poi

viene tagliata da Atg4(proteasi) e poi grazie a Atg7 e Atg3 si forma Atg8 PE che in

questa forma si localizza al PAS e nell’autofagosoma dopo Atg4 può anche liverare

Atg8 dalle membrane. La fusione tra vacuolo/lisosomi e autofagosoma i complessi

Atg8-Pe e Atg12/Atg5-Atg16 si trovano su entrambe le membrane, invece Atg8 pe solo

sulla membrana interna quando Atg8-pe deconiuga avviene la fusione.

Nelle cellule di mammiferi mTOR1 viene regolato da fattori di crescita e da insulina,

infatti questi attivano il pathway della fosfatidil-inositolo 3 chinasi. Questo pathway va

ad attivare la pKB/AKT che a sua volta fosforila la proteina TSC2. Quando TSC2 è

fosforilato non è attivo come GAP e RHEB rimane attivo associato a GTP. Se invece

TSC2è non fosforilato insieme a TSC1 agisce come GAP e idrolizza GTP su Rhb

inattivandola. Rheb se è legata a GTP stimola attività di mTor1 se no la inibisce. Negli

eucarioti pluricellulari abbiamo AMPK (proteina sensibili al rapporto intracellulare tra

AMP/ATP).

L’inizio dell’autofagia è dettata dal complesso ULK1-FIP200Atg13. Quando AMPK

fosforila ULK lo attiva intanto ampk inattiva mtor1) iene attivata autofagia. Se invece

è mTor fosforilare Ulk questa fosforilazione blocca autofagia. Quando ulk1 si attiva

questo richiama gli Atg all’autofagosoma. Intanto il complesso della chinasi lipidica

quando si associa a beclin e altre proteine sintetizza fosfatidilinositolo3fosfato che

dirige la migrazione delle proteine a livello del fagoforo. Beclin viene attivato da parte

di ULK (fosforilazione=. Inoltre Ampk va anche a fosforilare ATG9 stimolando il

reclutamento dove si sta formando autofagosoma . inoltre interviene LC3 che subisce

un taglio proteolitico e una coniugazione con etanolammina consentendo associazione

con la membrana fagoforo. Dopo di che, quando si sono formati autofagosomi questi

si muovono grazie al network di microtubuli e si fondono con i lisosomi.

11)SAGGIO PER FLUORESCENZA

Il saggio per fluorescenza nell’autofagia è utilizzato per quantificare i processi

autofagici e vedere se in una cellula avvenendo autofagia. Uno dei metodi più utilizzati

è quello di marcare alcuni marcatori dell’autofagia come LC3 (Atg8) in modo

fluorescente e poi osservare al microscopio le cellule e vedere che queste proteine

quando vengono lipidate si localizzano a livello di un dot dove vanno a riunirsi anche

altre proteine Atg (questo punto è il PAS doge si localizzano le proteine che

intervengono nell’autofagia). Infatti gli autofagosomi si localizzano a livello di questo

punto dove si collocano le proteine Atg. Inoltre possiamo anche monitorare l’autofagia

mediante il monitoraggio della formazione degli autolisosomi (stadio finale au