Analisi biochimico-cliniche

HBA2: ILLUSTRARE CHE COSA È, L'UTILITÀ CLINICA DELLA SUA MISURA E I PRINCIPALI ASPETTI ANALITICI.

EMOGLOBINA TOTALE E DERIVATI

• Concentrazione di Hb nel sangue e determinazione di eventuale anemia (anche in plasma, urine, ...)
• Determinazione di derivati emoglobinici quali HbCO e MetHb
• Determinazione di Hb minori quali HbA2 e HbF e determinazione di talassemie e HbA1c per il controllo glicometabolico del diabete
• Separazione delle Hb e presenza di Hb varianti

HbA

Struttura 64mila Da, proteina tetramerica formata da 4 catene globiniche uguali 2 a 2 (2α e 2β) e su ogni catena è presente un gruppo eme ferroprotoporfirina IX nel quale si lega il Fe2+ (allo stato ossidato Fe3+ l'Hb non è funzionale e non trasporta O). L'eme è costituito da 4 anelli pirrolici con al centro il Fe2+.

Aptoglobina lega Hb per prendere il complesso più grande per evitare di farla finire nelle urine.

L'Hb è scissa dai macrofagi nelle sue...

componenti: Ham e Fe2+ sono recuperati e rimessi in circolo mentre la protoporfirina è trasformata in bilirubina.

L'Hb, come le altre proteine, è sintetizzata dal ribosoma; il Fe2+ è introdotto con la dieta mentre il gruppo eme è sintetizzato in fegato e midollo osseo con reazioni che avvengono nei mitocondri e nel citosol:

• condensazione tra succinil Co-A e glicina che dà acido aminolevurinico che è portato nel citosol dove forma coproporfirinogeno e rientra nei mitocondri
• decarbossilazione dà protoporfirina IX con i 4 anelli pirrolici che legano il Fe2+

Emopoiesi nel midollo osseo dell'adulto da cui derivano la linea linfoide, mieloide che darà origine a eritrociti, leucociti e piastrine.

L'eritropoiesi è sotto il controllo di epo (eritropoietina) prodotta dal rene. Determina:

• aumento di sintesi dell'emoglobina negli eritroblasti
• promuove la differenziazione dei precursori eritroidi a reticolociti ed

eritrociti e il loro rilascio in circolo

Quando l'epo è bassa a livello periferico interviene il rene che risponde producendo epo: è prodotta in funzione del grado di ipossia (=carenza di O).

L'eritrocita è rilasciato in circolo dove vi rimane per 120gg ed è poi rimosso attraverso:

• emolisi extra-vascolare: l'eritrocita espone sulla superficie dei marker di invecchiamento (90%)
• emolisi intra-vascolare: l'eritrocita si rompe nel letto vascolare rilasciando il suo contenuto nel plasma (10%)

Primitive:

• policitemia vera

Secondarie: risposta fisiologica a situazioni di ipossia

• altitudine, ridotta pO2 atmosferica (alta montagna)
• malattie polmonari con insufficienza respiratoria (enfisema)
• cardiopatie
• epatite ad alta affinità per O2: non lo rilasciano
• nefropatie

Come si determina Hb nel sangue?

Metodo di Drabkin: metodo spettrofotometrico.

Tutte le Hb presenti nel campione (HbO2, Hb, HbCO, Hb+) vengono convertite in un unico

derivato moltostabile (Hb+CN-) che ha un massimo di assorbimento a 540nm.

Campione: sangue coagulato con EDTA

Protocollo: 5 ml di reagente di Drabkin (K ferricianuro, K+cianuro, detergente) + 50 mL sangue

Calcolo Hb misurata in g/dL

Interferenze: essendo un esperimento ottico il campione deve essere limpido

Valori di riferimento: divisi per uomini e donne e fasce d'età (neonato Hb alta, donna bassa fino a età fertile)

Hb nel globulo rosso

• Diverse per sintesi genetica (nell'adulto):
  • Hb A0 92-95% (α2,β2)
  • HB A2 2-3% (Α2,Δ2) TRASPORTA O COME HB A0, IMP PERCHÉ MARCATORE DI Β-TALASSEMIA
  • Hb F < 1 % (α2,ϒ2) fetale (componente emoglobinica principale nel neonato)
• Diverse per modifiche post-traduzionali:
  • HbA1c glicata: lega glucosio spontaneamente
  • HbA1a lega fruttosio-1,6-difosfato
  • HbA1b lega glucosio 6-fosfato
  • HbF acetilata (nel neonato)
• Diverse per il sostituente legato all'eme (derivati emoglobinici)
  • Hb

Cause:

• Ridotta produzione di RBC (matrice eritropoietica nel midollo osseo):
  • Insufficiente produzione nel midollo osseo di cellule del sangue (anemia aplastica)
  • Infiltrazione neoplastica del midollo osseo (leucemie)
  • Carenza di vitamina B12 o folati (anemia megaloblastica)
• Ridotta o anomala sintesi di Hb per alterazione della sintesi dell'eme (anemia sideroblastica)
• Carenza di Fe (anemia sideropenica)
• Ridotta/assente sintesi catene globiniche (talassemie)
• Aumentata perdita o distruzione di RBC per:
  • Perdita di sangue acuta o cronica
  • Aumentata distruzione a causa di un processo emolitico (anemie emolitiche)
• Da difetto intra-globulare:
  • Alterazioni proteine di membrana (sferocitosi, ellissocitosi): l'eritrocita è riconosciuto come estraneo ed è rimosso dal sistema reticolo endoteliale
  • Difetti enzimatici (G6PDH glucosio6fosfato-deidrogenasi, PK): l'eritrocita si ossida, si denatura e precipita
  • Varianti emoglobiniche instabili dal punto di vista strutturale che causano l'emolisi degli eritrociti (anemie emolitiche ereditarie)

tendono a precipitare in vitro_da difetto extra-globulare -stress meccanici-agenti fisici, chimici, farmaci-anemie autoimmuni (autoanticorpi)-anemie isoimmuni da trasfusioni non immuni

Esame emocromocitometrico (emocromo): per la diagnosi e il monitoraggio dell'anemia.

Campione: sangue anticoagulato con EDTA. Fornisce oltre alla concentrazione di Hb nel sangue, una serie di informazioni sulle cellule del sangue e sul loro rapporto con la parte liquida.

Valuta: globuli rossi (n°, volume, contenuto di Hb), ematocrito (rapporto tra la parte cellulare e la parte liquida del sangue), Hb concentrazione nel sangue, globuli bianchi (n°, sottoclassi), piastrine (n°, volume).

Ematocrito HCT: esprime il V tra le cellule del sangue (soprattutto eritrociti) sul totale del sangue

MCV: V medio degli eritrociti del sangue per classificare le anemie

Diminuzione -anemia sideropenica (carenza di Fe)-talassemie

Aumento -carenza vit B12 e folati-alcolismo-malnutrizione

RDW: è

L'ampiezza della distribuzione dei volumi degli eritrociti intorno al valore medio aumenta nell'anemia sideropenica.

MCH: è la quantità di emoglobina contenuta in media in un singolo globulo rosso (valore non misurato ma calcolato su Hb e cellule).

MCHC: è la concentrazione di emoglobina all'interno di un singolo globulo rosso (si calcola ma non si misura).

Determinazione Hb non nel sangue

Si fa lettura allo spettrofotometro, non si usa il metodo Drabkin perché non è abbastanza sensibile per la piccolissima concentrazione di sangue che si trova in plasma, urine o feci. λ=415 nm l'Hb ha un elevato coefficiente di estinzione (assorbe tanto).

Determinazione Hb nel plasma (non nel siero dove potrebbe esserci emolisi)

Fenomeni acuti di emolisi intravascolari: anemie emolitiche acute

Metodi: spettrofotometrici

Campione: plasma separato da sangue in EDTA

Interferenze: emolisi durante e dopo il prelievo, iperlipidemia, bilirubinemia

5Determinazione Hb nelle urine

Analisi con lettura visiva comparativa con una scala colorimetrica e strisce reattive per determinare attività perossidasica (Hb è in grado di ridurre H2O2 ed ossida il cromoforo: stima qualitativa).

Campione: urine fresche

Interferenze: presenza di contaminanti ossidanti (candeggina), batteri contenenti perossidasi.

Significato clinico: ematuria, patologie glomerulari, emolisi intravascolare acuta

Determinazione Hb nelle feci

Sanguinamento nel tratto gastro-intestinale, utile nello screening tumore colon-retto

Metodo con anticorpi specifici-HbA2 2-3% (α2,δ2) trasporta O come HbA0, imp perché marcatore di β-talassemia

Determinazione di Hb minori (HbA2 e HbF) per diagnosi di talassemie

Emoglobine nel globulo rosso (diverse per composizione in globine)

• Soggetto adulto:
  • HbA 92-95%
  • HbA2 2-3%
  • HbF < 1%
• Alla nascita:
  • HbA 15-30%
  • HbF 65-85%

Emoglobinopatie: difetti congeniti a carico della componente proteica della

Hb (delle catene globiniche)di sintesi (alterazioni quantitative) talassemie e HPFH (elevata persistenza di HbF), si riduce la quantità dellaproduzione di catenedi struttura (alterazioni qualitative) varianti di Hb, difetti nella sequenza di HamTalassemie: gruppo eterogeneo di disordini ereditari a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzati dasintesi ridotta o assente di una catena globinica (alterazione quantitativa).In base al tipo di catena interessata vengono distinte in:-α-talassemia (ridotta sintesi catene α)-β-talassemia (ridotta sintesi di catene β)-δ-talassemia (ridotta sintesi di catene δ, non rilevante clinicamente)-δβ-talassemia, ψδβ-talassemia (la mutazione riguarda tutto il cluster dei geni β)β-talassemia con più di 300 diverse mutazioni, sono mutazioni autosomiche recessive (il malato è l'omozigote)-β 0 -talassemia: totale assenza di catene β-β +

-talassemia: variabile produzione di catena β-β ++

-talassemia: minima sintesi di catene β

Assente/ridotta sintesi catene β determina un eccesso di catene α libere che, se non associate, sono molto poco solubili e precipitano in cellula: ci sono poche cellule eritroidi perché vengono distrutti eritroblasti nel midollo o per danno cellulare e sequestro splenico (sequestro della milza) che provoca emolisi extra-vascolare quindi anemia perché l'eritropoiesi è inefficace. Per ipossia tissutale c'è un'iperproduzione di epo e l'espansione di organi eritropoietici e stimolazione della sintesi di eritrociti nel midollo. L'organo risponde per combattere l'anemia cercando di assumere più Fe: se c'è un sovraccarico di Fe si verificano complican