Appunti di Analisi Biochimico cliniche

Università di Catania Luigi Fiorentino

Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

Analisi biochimico-cliniche per la diagnostica medica

Contenuti del corso

Tipologia delle analisi biochimiche-cliniche. Analisi singole, raggruppamenti di analisi, profili biochimici, prove di funzionalità, esami di screening, esami d'urgenza.

Importanza della preparazione del paziente prima del prelievo. Modalità di prelievo del campione. Trattamento e conservazione del campione. Precisione, accuratezza e specificità dei metodi adoperati. Controllo di qualità. Valori di riferimento.

Tecniche fondamentali impiegate nel laboratorio di biochimica-clinica. Tecniche spettrofotometriche, fluorimetriche. Elettroforesi, tecniche elettrochimiche, tecniche immunologiche, radioimmunologiche, tecniche enzimatiche.

Sistemi automatici per la misura dei vari parametri biochimici. Enzimi e diagnostica enzimatica. Considerazioni sui metodi di misura delle attività enzimatiche.

Caratteristiche generali dei più importanti enzimi di interesse clinico. Isoenzimi: caratteristiche, distribuzione e loro significato clinico. Variazioni delle attività enzimatiche in condizioni patologiche.

Proteine plasmatiche. Caratteristiche generali e funzioni di alcune proteine: metodi di analisi chimiche. Elettroforesi. Lipoproteine plasmatiche. Colesterolo. Trigliceridi. Caratteristiche generali degli ormoni. Modificazioni in condizioni patologiche. Metodi di determinazione dei principali ormoni.

Indagini quantitative delle cellule del sangue: conteggio degli eritrociti, conteggio dei leucociti e delle piastrine. Ematocrito, emoglobina. Classificazione delle anemie. La bilirubina nel sangue. Alterazioni del metabolismo della bilirubina. Gli itteri. VES. TAS. I gruppi sanguigni. Coagulazione e fibrinolisi.

Metabolismo del glucosio. Regolazione della glicemia e metodi di determinazione. Diabete. Curve da carico, la glicemia post-prandiale. Corpi chetonici. Azoto non proteico. Azotemia e suo significato. Creatina e creatinina. Acido urico e gotta.

Capitolo 1: Gli enzimi della diagnostica

Aminotransferasi

Le aminotransferasi (transaminasi) catalizzano il trasporto di un gruppo amminico da un amminoacido ad un chetoacido. Dal punto di vista clinico rivestono particolare importanza due transaminasi: l’Aspartato Aminotransferasi e l’Alanina Aminotransferasi.

1. Aspartato aminotransferasi catalizza la reazione:

   AST α-Chetoglutarato → LL Aspartato + Glutammato + Ossalacetato

   L’enzima è largamente diffuso e si trova in concentrazioni diverse nei vari tessuti. Nell’uomo, il tessuto con la più alta concentrazione è il miocardio, cui fanno seguito il cervello e il fegato, la mucosa gastrica, il tessuto adiposo, il muscolo scheletrico, il rene, il pancreas, la milza, il testicolo, è presente nei globuli rossi, e in quantità assai minori nel plasma.

   La localizzazione dell’AST spiega come questo enzima aumenti nel siero, talvolta in modo notevolissimo, nelle affezioni interessanti il miocardio ed il fegato, soprattutto se queste affezioni sono caratterizzate da necrosi cellulare, e quindi nell’infarto da miocardio e nella epatite virale. Nei casi da infarto da miocardio, l’AST, aumenta nel siero dopo 8-12 ore dall’inizio della sintomatologia dolorosa, raggiunge il massimo livello dopo 24-48 ore e poi, nei casi a decorso favorevole, decresce fino a tornare a valori normali, dopo 4-7 giorni.

   Dal punto di vista prognostico è importante il fatto che l’aumento dell’AST sia in rapporto all’estensione della zona infartuata, per cui i casi con valore dell’AST elevati hanno una prognosi più sfavorevole dei casi che presentano aumenti più moderati. Inoltre, è importante il rilievo che nei pazienti, con crisi anginoidi, il valore dell’AST non aumenta per cui la determinazione di questo enzima consente di distinguere, nel caso di una sindrome dolorosa precordiale, se essa è dovuta ad infarto o ad angina pectoris.

   Di grande importanza, ai fini della diagnosi, è l’aumento dell’AST nel siero in alcune forme dell’infarto del miocardio con referto elettrocardiografico incerto o negativo. Infine, il controllo sistematico dell’AST nel siero dei giorni successivi all’infarto miocardico consente di seguire il decorso della malattia: l’estendersi della zona infartuata è accompagnato da un ulteriore innalzamento nel siero dell’AST.

   Rimanendo nel campo delle affezioni cardiache, AST aumenta nel siero nelle miocarditi di origine virale, reumatica o batterica; l’aumento dell’AST nel siero, in caso d’infarto del miocardio, raggiunge in genere livelli 10-20 volte superiori ai valori massimi normali, valori molto più alti si osservano invece nell’epatite acuta, dove non sono rari valori 100 e più volte superiori ai massimi normali.

   Nella maggior parte dei casi di epatite virale, l’aumento dell’AST nel siero precede da una a quattro settimane la comparsa dell’ittero, per cui il suo valore diagnostico è altissimo, essendo possibile, attraverso la sua determinazione, diagnosticare un’epatite virale prima della comparsa del segnale clinico caratteristico (costituito dall’ittero), oltre che consentire la diagnosi delle epatiti anitteriche. L’aumento dell’AST riflette la gravità e l’estensione del danno epatico. I valori più elevati si osservano nelle forme più gravi, con interessamento più profondo delle cellule epatiche. Nei casi con decorso regolare l’AST, dopo aver raggiunto un valore massimo verso il 7°-10° giorno dall’inizio della sintomatologia clinica, comincia a diminuire, per tornare a valori normali verso la 4°-5° settimana. In caso di riacutizzazione del processo morboso, il valore dell’AST torna a innalzarsi, mentre il persistere di valori elevati oltre la 6°-7° settimana di malattia indica l’evoluzione della forma acuta in quella cronica.

   Nelle forme di necrosi acuta, diffusa nel fegato, come nel caso di avvelenamento da Amanita Falloide, l’AST raggiunge nel siero valori elevatissimi, superiori diverse centinaia di volte ai massimi normali. Nelle fasi terminali di queste forme morbose, il valore dell’AST si abbassa notevolissimamente e tale abbassamento, anziché essere un segno favorevole, indica l’esaurimento dell’enzima nelle cellule epatiche. La localizzazione cellulare dell’AST è in parte citoplasmatica e in parte mitocondriale.

2. Alanina aminotransferasi (GPT o ALT) catalizza la reazione:

   ALT α-Chetoglutarato → Piruvato + L Alanina + L Glutammato

   L’enzima è localizzato soprattutto nel fegato e, in concentrazioni assai minori, nel rene, nel miocardio, nei muscoli scheletrici, nel pancreas, nella milza. Si tratta quindi di un enzima con sede prevalentemente epatica e, nella cellula epatica, è localizzato esclusivamente nel citoplasma. L’interesse clinico della determinazione dell’ALT nel siero è legato in modo prevalente alla patologia epatica. Nell’epatite virale il comportamento della ALT nel siero è del tutto sovrapponibile a quello dell’AST. Il suo aumento precede la comparsa dell’ittero ed è accentuato da quello dell’AST. Aumenti modesti si osservano nell’ittero ostruttivo e tale comportamento ha particolare importanza nella diagnosi differenziale fra ittero epatico e ittero colestatico.

   Nell’infarto del miocardio l’aumento dell’ALT, a differenza dell’AST, è modesto o nullo in rapporto alla sua bassa concentrazione nel miocardio.

Ornitina carbossil-transferasi (OCT)

L’Ornitina Carbossil-Transferasi (OCT) è l’enzima che catalizza la seconda tappa del ciclo dell’urea, trasferendo sull’Ornitina il gruppo carbossilico, con formazione di Citrullina. L’interesse clinico nel determinare la presenza di questo enzima nel siero deriva dal fatto che si trova localizzato per il 99% nel fegato e quindi può considerarsi un enzima epatico specifico; la sua localizzazione, nelle cellule epatiche, è all’interno del mitocondrio. Il comportamento dell’OCT nel sangue costituisce un valore molto sensibile di qualunque danno epatico. Nella epatite virale l’OCT aumenta nel siero molto precocemente, raggiungendo valori molto elevati (fino a 40-50 volte superiori ai valori massimi normali) e presenta un comportamento simile a quello delle transaminasi.

Nei casi con decorso regolare i valori tornano a livelli normali verso la 3°-4° settimana, precedendo la normalizzazione delle transaminasi. Il comportamento dell’OCT nel siero è un indice molto preciso dell’andamento della malattia, non tornando alla norma nelle forme di epatite a decorso protratto e tornando ad aumentare nei casi di riacutizzazione. Valori particolarmente elevati si osservano nelle epatopatie tossiche acute, come nella necrosi epatica causata da Amanita Falloide. Nelle epatopatie croniche il comportamento dell’OCT nel siero esprime, assai fedelmente, l’evoluzione del processo morboso, aumentando durante i periodi evolutivi della malattia. Negli itteri colestatici il suo aumento è modesto, ad eccezione dei casi accompagnati da compromissione della cellula epatica.

Grazie alla sua localizzazione quasi esclusivamente epatica e alla sua mobilizzazione, malgrado la sede mitocondriale, l’OCT costituisce uno degli indici più sensibili di sofferenza degli epatociti.

Gamma-glutammil transferasi (γ-GT)

La γ-Glutammil-Transferasi catalizza il trasporto del gruppo γ-glutammile da un glutammilpeptide a un altro peptide o a un amminoacido. La γ-GT è presente in numerosi tessuti: nel rene, dove si trova il contenuto più elevato (più precisamente nei tubuli renali), nel pancreas e nel fegato, l’enzima è presente anche nell’intestino, nei polmoni, nella milza, nella tiroide.

La sua localizzazione intracellulare è prevalentemente microsomiale, ma una quota è anche presente in forma solubile nel citoplasma. L’interesse clinico nel determinare la presenza della γ-GT nel siero risiede nel fatto che questo enzima aumenta, costantemente, in tutte le affezioni del fegato e delle vie biliari e, solo saltuariamente, in altre condizioni morbose. Gli aumenti più marcati si osservano negli itteri da ostruzione delle vie biliari. In questa condizione morbosa l’aumento della γ-GT è più precoce e più intenso della fosfatasi alcalina.

Un particolare significato acquista la determinazione della γ-GT, nella diagnosi delle metastasi epatiche. Inoltre, aumenta nell’intossicazione alcolica, nella pancreatite, nelle neoplasie renali, nel diabete, nel carcinoma pancreatico e nei tumori cerebrali.

Colinesterasi

Le Colinesterasi: con questo termine si indica un gruppo di enzimi accomunati dalla capacità di idrolizzare gli esteri della Colina. In base alla specificità per alcuni substrati e per la sensibilità di alcuni inibitori, se ne distinguono due tipi:

1. La Acetilcolinesterasi (AChE) indicata anche come colinesterasi dei globuli rossi, colinesterasi vera, specifica e di tipo I; la Colinesterasi (PChE) indicata anche col termine di colinesterasi del siero, colinesterasi non specifica, pseudo colinesterasi, colinesterasi tipo II. La reazione catalizzata da questo gruppo di enzimi può essere così schematizzata:

   Colinesterasi → Acetilcolina Acido Acetico + Colina + H₂O

   L’Acetilcolinesterasi si trova negli eritrociti, nei polmoni, nella milza, nella sostanza grigia del cervello e nelle terminazioni nervose dove svolge una funzione fisiologica della massima importanza. In corrispondenza delle terminazioni nervose viene sintetizzata l’Acetilcolina che consente la trasmissione dell’impulso nervoso, dal nervo alla fibra muscolare: dopo che è avvenuta la trasmissione dell’impulso, l’Acetilcolinesterasi distrugge l’Acetilcolina rendendo così possibile la trasmissione di un nuovo impulso.

2. La Colinesterasi si trova nel fegato, nel pancreas, nel miocardio, nella sostanza bianca del cervello e nel siero. In realtà, l’attività della Colinesterasi del siero risultante dell’attività di 13 isoenzimi: tra questi, 2 sono Acetilcolinesterasi specifiche ed idrolizzano solo l’Acetilcolina, mentre i restanti 11 isoenzimi sono Colinesterasi non specifiche ed idrolizzano, oltre all’Acetilcolina, numerosi altri esteri. Entrambi gli enzimi (Colinesterasi e Acetilcolinesterasi) sono inibiti da due alcaloidi, la Prostigmina e la Fisostigmina, che competono con la Colina per legarsi al sito attivo dell’enzima, si tratta quindi di una inibizione competitiva e, come tale, reversibile. Esercitano invece un’inibizione irreversibile alcuni composti organici fosforati, fra i quali hanno particolare importanza pratica alcuni esteri fosforici organici impegnati in agricoltura come insetticidi. Oltre a questi vi sono numerosi altri inibitori, tra questi ricordiamo il Citrato, il Fluoruro, la Morfina e il Chinino.

   L’insorgenza in alcuni pazienti di complicazioni dopo la somministrazione di un miorilassante, la Succinilcolina, ha portato alla scoperta di una forma atipica di Colinesterasi nel siero; tale forma atipica viene trasmessa su base genetica ed è caratterizzata da una debole attività enzimatica, corrispondente a circa un decimo dell’attività dell’enzima normale. I portatori di questa variante atipica di Colinesterasi non presentano alcun disturbo, se però a questi viene somministrata della Succinilcolina (la cui azione dura normalmente pochi minuti, in quanto il miorilassante viene rapidamente idrolizzato dalla colinesterasi) l’effetto miorilassante può protrarsi nel tempo fino a determinare un’apnea di 40-50 minuti e infine morte per paralisi cardiaca. Questa variante di Colinesterasi può essere identificata per la sua maggior resistenza ad alcuni inibitori dell’enzima normale: Dibucaina, Fluoruro.

   La Colinesterasi è studiata, tramite specifici test che mirano a determinarne la concentrazione nel plasma, quando si affronta l’argomento della funzionalità epatica in cui è coinvolta, dato che è sintetizzata dal fegato. Le altre due condizioni chimiche in cui è richiesta la determinazione delle colinesterasi nel siero sono: l’intossicazione da esteri fosforici organici e l’identificazione di soggetti che presentano la forma atipica dell’enzima prima del trattamento con Succinilcolina. La PChE (colinesterasi) rappresenta un indice della funzionalità epatica, in quanto, il suo livello nel siero è considerata espressione della capacità Protidopoietica delle cellule epatiche.

   Una situazione nella quale si ha un netto abbassamento della PChE è costituita dall’avvelenamento con composti organici contenenti esteri fosforici, che sono inibitori della colinesterasi, e poiché tali composti sono usati in agricoltura come anticrittogamici, quest’avvelenamento è più frequente negli agricoltori. In questi casi la determinazione della PChE è netta, pertanto l’attività della colinesterasi nel siero può scendere al 40% del valore iniziale, prima che si renda evidente la sintomatologia clinica tramite debolezza muscolare, di cui troviamo in particolar modo interessati i muscoli delle gambe, delle braccia e il diaframma; nei casi di grave intossicazione l’attività della colinesterasi può scendere addirittura al 20%.

   Infine, la determinazione della PChE deve essere eseguita prima di sottoporre i pazienti a trattamento miorilassante con Succinilcolina, allo scopo di individuare i soggetti portatori della variante atipica della Colinesterasi, nei quali l’attività dell’enzima nel siero è bassa. La presenza di questa variante atipica può essere accertata sfruttando l’attività inibente della Dibucaina o del Fluoruro (test d’inibizione con Dibucaina e Fluoruro), che hanno la proprietà di inibire la forma normale di colinesterasi, l’inibizione che invece non si riscontra alla presenza della forma atipica che quindi è particolarmente resistente sia alla Dibucaina sia al Fluoruro.

   Utilizzando tale test d’inibizione è quindi possibile determinare l’attività della Colinesterasi in presenza e in assenza di Dibucaina, stabilendo così la percentuale di inibizione dovuta alla Dibucaina (indicato con D.N.). Con tale indagine, non solo è possibile identificare i soggetti con variante atipica (Omozigote), ma si possono anche riconoscere i portatori di tale carattere (Eterozigoti). Infatti, i risultati che si ottengono da questo test sono i seguenti:

   • Soggetti normali: PChE 3000-9000, D.N. circa 70-80%
   • Eterozigoti: PChE circa 3000, D.N. 30-60%
   • Omozigoti: PChE inferiore a 3000

   Modici aumenti della PChE possono osservarsi nelle Tireotossicosi (tossicosi della tiroide) e nella sindrome nefrosica, in cui l’aumentata sintesi della PChE nel fegato accompagna l’aumento della sintesi della Sieroalbumina, che si verifica in tale malattia per compensare l’elevata perdita di Albumina con le urine.

Fosfatasi

Le Fosfatasi sono un gruppo di enzimi che catalizzano l’idrolisi del legame estere fra alcoli e acido fosforico, con liberazione di Fosfato Inorganico.

Piruvato + NADH + H⁺ → Lattato + NAD⁺

Secondo il pH ottimale si distinguono due gruppi, Alcalina e Acida. L’attività Fosfatasica Alcalina è largamente diffusa nei vari tessuti; la ritroviamo negli osteoblasti dello scheletro.