Virologia - Microbiologia

Virologia generale

Struttura e replicazione dei virus

Struttura dei virus

✧ Piccoli parassiti intracellulari obbligati, non possiedono il macchinario necessario alla produzione di energia, non sintetizzano proteine e non possono replicare il loro genoma.

✧ Dimensioni di 20-100 nm, i più grandi arrivano anche a 400 nm (non visibili al microscopio ottico).

✧ Strutture fondamentali: genoma e capside (rivestimento proteico).

✧ Alcuni virus possiedono un envelope (struttura lipidica).

✧ Strati esterni: mediano interazione fra virus e cellula bersaglio.

✧ Simmetria del capside: icosaedrica (forma vagamente sferica) o elicoidale (forma bastoncellare).

• Classificati in base a:
  • Struttura: presenza o assenza di envelope, tipo di acido nucleico.
  • Strategie di replicazione: caratteristiche biochimiche e molecolari.

Þ Genoma: DNA, circolare o lineare, o RNA, singola (polarità positiva o negativa) o doppia elica, segmentato o non segmentato.

Þ Capside: struttura proteica rigida, i virus nudi sono in genere più resistenti ad essiccamento, acidi e detergenti; vengono in genere trasmessi per via oro-fecale.

Þ Envelope: membrana glicolipidica distrutta da essiccamento, acidità e detergenti; vengono in genere trasmessi attraverso fluidi.

Spettro d'ospite

Þ Spettro d'ospite: insieme delle specie animali che possono essere infettate da un virus.

• Spettro ampio o ristretto.

• Fattori che determinano lo spettro d'ospite:
  • Presenza di recettori a cui il virus può legarsi.
  • Presenza di strutture nella cellula necessarie al virus per la replicazione.
  • Necessario che i virioni escano dalla cellula e diffondano ad altre.
  • Necessario che l'ospite non metta in atto una risposta antivirale.

Replicazione virale

✧ Dopo l'ingresso del virus nella cellula c'è la scomparsa delle particelle virali (fase di eclissi).

✧ Durante questa fase: espressione e replicazione del genoma e sintesi delle proteine virali.

• Fasi della replicazione:
  • Adsorbimento. Legame del virus alla cellula attraverso i recettori cellulari (molecole con funzione fisiologica specifica); il recettore cellulare definisce il tropismo tissutale del virus.
  • Penetrazione. I virus con envelope penetrano per fusione con una membrana (cellulare o dell'endosoma); nell'endosoma il pH acido attiva la proteina di fusione. I virus nudi entrano per traslocazione o per endocitosi.
  • Uncoating. Il virus viene liberato del rivestimento e viene reso disponibile il genoma per la sintesi delle proteine e la replicazione.
  • Replicazione del genoma. Diversi virus attuano strategie diverse, a seconda del tipo di genoma; alcuni replicano nel nucleo e alcuni nel citoplasma. Per la replicazione devono rispettare le regole della cellula ospite oppure devono cambiarle.
    • Virus a DNA. Usano una RNA polimerasi DNA-dipendente per la trascrizione degli mRNA e una DNA polimerasi DNA-dipendente per replicare il genoma; enzimi cellulari o virali (proteine precoci). Si replicano nel nucleo.
    • Virus a DNA citoplasmatici. Codificano per DNA e RNA polimerasi citoplasmatiche e necessitano di proteine accessorie alla trascrizione e alla replicazione.
    • Virus a RNA a polarità positiva. Il genoma funziona come mRNA e si lega direttamente ai ribosomi, dove viene tradotto in proteine; RNA polimerasi RNA-dipendente necessaria per la replicazione del genoma. RNA genomico trascritto in filamenti stampo per la sintesi di nuovi genomi.
    • Virus a RNA a polarità negativa. Possiedono la RNA polimerasi RNA-dipendente, il genoma viene trascritto in filamenti positivi (filamenti stampo o mRNA) per la sintesi di nuovi genomi e la traduzione delle proteine strutturali e non strutturali.
    • Virus a RNA doppio filamento. Meccanismo simile ai virus a RNA (-): filamento negativo trascritto in mRNA dalla polimerasi presente nel virione.
    • Retrovirus. Genoma a RNA trascritto in un filamento di cDNA, tramite una trascrittasi inversa presente nel virione, che viene usato per la sintesi di un filamento complementare: questo DNA si integra nel genoma della cellula ospite e viene trascritto dagli enzimi cellulari.
  • Assemblaggio e maturazione. Genoma e proteine virali assemblati in nucleocapsidi per formare il virione maturo; processo di autoassemblaggio che può avvenire nel nucleo, nel citoplasma o sulla membrana.
  • Rilascio. I virioni maturi escono dalla cellula con diversi meccanismi: i virus nudi in genere per lisi, mentre i virus con envelope per esocitosi o gemmazione. I nucleocapsidi si posizionano sul foglietto interno della membrana dove si trovano proteine virali e acquisiscono l'envelope.
  • Maturazione. In alcuni casi i virioni rilasciati non sono direttamente infettanti e subiscono un processo di maturazione al di fuori della cellula ospite.

Þ Infezione produttiva: produzione di nuove particelle virali.

Þ Infezione abortiva: infezione di una cellula che non permette tutte le fasi della replicazione.

Effetti del virus sulla cellula

✧ Possibili effetti della replicazione: inibizione della sintesi di DNA, RNA o proteine cellulari.

• Effetto citopatico virale:
  • Cambiamenti morfologici.
  • Formazione di sincizi.
  • Crescita indefinita della cellula.
  • Morte cellulare: distruzione da parte del sistema immunitario o per blocco del metabolismo cellulare.
  • Apoptosi.

Presenza delle proteine virali sulla cellula infettata

✧ Proteine virali di superficie:

• Permettono l'inizio del ciclo di replicazione.
• Permettono il riconoscimento da parte del sistema immunitario.

Þ Emoagglutinine: proteine virali in grado di legare le emazie, fenomeno di emoagglutinazione (reazione che avviene in laboratorio).

Þ Sincizi: cellule giganti multinucleate, derivanti dalla fusione di una cellula infetta con quelle circostanti; dovuto all'attività delle proteine fusogene virali.

Patogenesi virale

Fasi dell’infezione virale

• Fasi dell'infezione virale:
  • Invasione dell'ospite.
  • Replicazione in cellule suscettibili a livello del sito di ingresso.
  • Elusione delle risposte immunitarie locali.
  • (Eventuale) diffusione dal sito di ingresso in altre aree.
  • Ulteriore replicazione in organi bersaglio.
  • Comparsa dei sintomi caratteristici della malattia.
  • Eliminazione del virus per infettare altri ospiti.

• Progressione delle infezioni virali:

1. Ingresso del virus attraverso la mucosa.
2. Prima replicazione nel sito di ingresso (asintomatica o sintomi aspecifici).
3. Passaggio del virus ai linfonodi regionali:
   • Ulteriore replicazione.
   • Blocco da parte del sistema immunitario.
4. Arrivo nel sangue (viremia primaria).
5. Replicazione nelle cellule endoteliali.
6. Viremia secondaria.
7. Arrivo agli organi bersaglio (comparsa dei sintomi tipici della malattia).

Ingresso nell'ospite

✧ Sorgente di infezione: altri uomini e raramente animali (zoonosi).

• Trasmissione orizzontale: da un individuo infetto a un altro.
  • Diretta: contatto diretto, rapporti sessuali, trasfusioni e trapianti.
  • Indiretta: veicoli (oggetti) o vettori (animali).
• Trasmissione verticale: dalla madre al figlio.
  • Transplacentare: virus presenti nel sangue che possono attraversare la placenta, come rosolia e CMV, importanti teratogeni.
  • Perinatale: virus presenti nei genitali materni, come HPV o HSV.
  • Post-natale: virus presenti nel latte, come HIV.

Infezioni virali

• Alcune infezioni restano localizzate alla porta d'entrata e provocano malattia locale.
• Molti virus diffondono in tutto l'organismo e provocano malattie sistemiche.

Þ Infezioni localizzate:

• Periodo di incubazione relativamente breve.
• Immunità mediata dalle IgA mucosali.

Þ Infezioni sistemiche:

• Periodo di incubazione relativamente lungo.
• Immunità mediata da anticorpi circolanti e cellule immunitarie.

Trasmissione

• Trasmissione respiratoria: più comune nei climi temperati.
  • Replicazione nelle prime vie aeree.
  • Confinati all'apparato respiratorio: virus influenzali.
  • Diffusione e malattia sistemica: morbillo.
• Trasmissione per ingestione:
  • Replicazione nella mucosa intestinale.
  • Confinati all'apparato digerente: enterovirus.
  • Diffusione e malattia sistemica: poliovirus o epatite A.
• Trasmissione sessuale:
  • Replicazione nella mucosa.
  • Confinati al tratto uro-genitale: herpesvirus o papillomavirus.
  • Diffusione e malattia sistemica: HIV o epatite B.
• Difficile trasmissione attraverso congiuntiva, cute integra (impossibile) e iatrogena (basso rischio).

Effetti dell'infezione virale

• Diversi possibili effetti di un virus sulle cellule infettate.

Þ Infezione litica: in cellule permissive, moltiplicazione virale e rilascio dei virioni in seguito a lisi (morte) della cellula.

Þ Infezione persistente produttiva: moltiplicazione lenta o poco efficiente, la cellula non muore.

Þ Infezione persistente latente: genoma all'interno della cellula, senza che sia espresso.

Þ Infezione trasformante: virus causano immortalizzazione della cellula e trasformazione in cellula tumorale.

• Geni che stimolano la crescita.
• Inibizione dei meccanismi che regolano la crescita.
• Inibizione dell'apoptosi.

• Diversa progressione delle infezioni virali, in base al virus, alla cellula ospite e al sistema immunitario.
  • Infezione acuta e scomparsa del virus.
  • Infezione acuta, seguita da infezione latente e riattivazione periodica.
  • Infezione acuta, seguita da infezione cronica.

Meccanismi di patogenesi

• Meccanismi diretti:
  • Inibizione della sintesi delle proteine cellulari.
  • Inibizione e degradazione del DNA cellulare.
  • Formazione di corpi inclusi, con effetto tossico sulla cellula.
  • Alterazioni della struttura della membrana.
• Meccanismi indiretti:
  • Risposta del sistema immunitario agli antigeni virali e morte della cellula infetta.
  • Apoptosi delle cellule infette, contribuisce alla risoluzione dell'infezione.

Difesa dalle infezioni virali

Barriere naturali

• Barriere fisiche e chimiche.
• Mucose, principale porta d'ingresso; meccanismi di difesa:
  • Strato di muco, intrappola i virioni.
  • Flora microbica: inattiva i patogeni, compete per i siti di legame, mantiene una risposta immunitaria appropriata.
  • pH acido dello stomaco e della vagina.
  • Bile ad azione detergente.

Immunità innata

• Principali responsabili: fattori solubili e cellule.
• Febbre rende inefficiente la replicazione virale.
• Interferone: difesa attiva nei confronti delle infezioni antivirali; agisce prima dello sviluppo della risposta adattativa.
• Tre diversi interferoni.
  • a- Interferone (tipo 1), prodotto dai leucociti; gene su cromosoma 9.
  • b- Interferone (tipo 1), prodotto dai fibroblasti e dalle cellule epiteliali; gene su cromosoma 9.
  • g- Interferone (tipo 2), prodotto dalle cellule T e dalle cellule NK; gene su cromosoma 12.

• Meccanismo d'azione dell'interferone di tipo 1:

• Produzione da parte di una cellula infetta, in seguito al legame del virus con TLR.
• Rilascio nell'ambiente extracellulare e agisce sulle cellule adiacenti.
• Induce rilascio di proteine antivirali.
• Ribonucleasi: degrada RNA.
• Proteine chinasi: fosforila e inattiva il fattore d'inizio della sintesi proteica.
• Proteine antivirali inattive, si attivano quando legano RNA a doppio filamento.
• Stato antivirale di 2-3 giorni: sufficiente a non portare a morte la cellula.
• Attività antivirale aspecifica: può inibire la replicazione di tutti i virus.
• Altri effetti protettivi:
  • Attiva le cellule NK.
  • Aumenta il potenziale antivirale dei macrofagi.
  • Effetti collaterali: dolori muscolari, febbre e malessere.

Immunità acquisita

• Immunità acquisita:
  • Naturalmente o artificialmente.
  • Attivamente o passivamente.
• Immunità naturale attiva: infezione.
• Immunità naturale passiva: trasferimento di anticorpi dalla madre al figlio, IgG dalla placenta e IgA dal colostro.
• Immunità artificiale attiva: vaccinazione.
• Immunità artificiale passiva: siero immune, fornisce protezione immediata, ma temporanea, inoltre possibile trasmissione di altri patogeni e reazioni allergiche.

Vaccini

• Stimolazione dei linfociti B e T, usati nella profilassi delle infezioni.
• Vaccini a virus ucciso:
  • Patogenicità eliminata.
  • Vantaggi:
    • Sufficiente risposta umorale.
    • Impossibilità di mutazione.
    • Possibilità di somministrazione a immunodepressi.
  • Svantaggi:
    • Necessità di diversi richiami.
    • Uso di adiuvanti per potenziare immunogenicità.
    • Immunità relativamente breve.
    • Assenza di immunità mucosale.
  • Esempi:
    • Alcuni antinfluenzali.
    • Poliomielite di Salk (IPV).
• Vaccini a virus attenuato:
  • Riproduzione dell'infezione naturale.
  • Vantaggi:
    • Ottima risposta umorale e mucosale.
    • Buona risposta cellulare.
    • Necessario minor numero di richiami.
    • Immunità a lunga durata.
  • Svantaggi:
    • Difficoltà di conservazione.
    • Impossibilità di somministrazione a immunodepressi.
    • Possibile reversione alla forma virulenta.
  • Esempi:
    • MMR (morbillo, parotite, rosolia).
    • Poliomielite di Sabin (OPV).
• Vaccini a subunità: contengono glicoproteine o proteine virali di superficie, sono quelli contro influenza, epatite B e papillomavirus.
• Vaccini antivirali obbligatori in Italia: poliomielite IPV ed epatite B, somministrati al 3^o mese d'età.

Farmaci antivirali

Bersagli dei farmaci antivirali

• Difficile individuare molecole che inibiscano i virus senza avere effetti sulla cellula.
• Farmaci antivirali: devono essere attivi almeno 100-1.000 volte sul virus rispetto alla cellula; indice terapeutico.
• Potenziali bersagli:
  • Fase di adsorbimento, molecole analoghe al recettore cellulare o all'antirecettore virale; esempio Enfuvirtide per HIV.
  • Fase di svestimento, stabilizzano le proteine capsidiche; esempio Arildone e Pleconaril per rhinovirus ed enterovirus o Amantadina e Rimantadina per virus influenzali.
  • RNA polimerasi, inibiscono il capping dell'mRNA; esempio Ribavirina.
  • Replicazione del genoma:
    • Analoghi nucleosidici: incorporati nel genoma dei virus in replicazione; esempio Aciclovir per HSV e AZT per HIV.
    • Inibitori non nucleosidici: si complessano con gli enzimi e li inattivano.
    • Proteasi, si complessano all'enzima e lo inattivano; esempio Ritonavir e Indinavir per HIV.
    • Traduzione delle proteine, esempio interferone per HCV e HBV.
  • Neuroaminidasi, impediscono il rilascio dei virioni in gemmazione, interferendo con l'azione della neuroaminidasi; esempi Zanamivir e Oseltamivir per virus influenzali.

Aciclovir

• Attivo solo sulle cellule infette, viene fosforilato dalla timidina chinasi virale.
• Impiegato limitatamente a virus che codificano per la propria timidina chinasi e non si servono di enzimi cellulari.
• Analogo nucleosidico, attivo sugli herpesvirus; analogo della guanosina.
• Trifosforilazione della molecola da parte di chinasi cellulari o virali.
• Incorporato dalla polimerasi nella catena di DNA nascente.
• Non possiede il sito di legame per altri nucleosidi, quindi termina la catena.
• Specificità:
  • Fosforilato dalla chinasi virale.
  • Affinità 10 volte maggiore per polimerasi virale rispetto a polimerasi cellulare.

Virologia speciale

Orthomyxoviridae

Caratteristiche e struttura

• Virus che causano influenza nell'uomo e in altri animali.
• Classificati in tre tipi (A, B e C) in base agli antigeni interni; tipo A ulteriormente classificato in base agli antigeni di superficie.
• Virus con envelope e capside a simmetria elicoidale.

Þ Proteine e glicoproteine:

• Proteina matrice M1: riveste internamente l'envelope.
• Proteina M2: proteina transmembrana con funzione di canale ionico.
• Glicoproteina HA (emoagglutinina): antirecettore virale, lega l'acido sialico e determina il tropismo cellulare; 80% degli antigeni di superficie.
  • Virus umani riconoscono acido sialico + galattosio, con legame 2,6 glicosidico.
  • Virus aviari riconoscono acido sialico + galattosio con legame 2,3 glicosidico.
• Glicoproteina NA (neuroaminidasi): taglia acido sialico e permette il distacco dei virioni neoformati; 20% degli antigeni di superficie.

• Genoma a RNA a polarità negativa, segmentato (7-8 segmenti): ognuno associato alla nucleoproteina NP e alla polimerasi.

• Segmenti 1, 2 e 3: codificano per PB2, PB1 e PA, che formano il complesso della polimerasi.
• Segmento 4: codifica per emoagglutinina HA.
• Segmento 5: codifica per nucleoproteina NP.
• Segmento 6: codifica per neuroaminidasi NA.
• Segmento 7: codifica per le proteine M1 e M2.
• Segmento 8: codifica per le proteine NS1 e NS2, che inibiscono la traduzione dell'mRNA cellulare e facilitano l'esportazione dell'RNA virale nel citoplasma.

• Forma variabile (pleomorfi) e sono relativamente grandi: circa 100 nm.

Þ Emoagglutinina. Serve per il legame del virus al recettore (acido sialico); presenta un sito fusogeno, che si attiva in seguito al legame della HA, permettendo l'entrata del virus nella cellula.

Þ Neuroaminidasi. Taglia l'acido sialico e serve per la liberazione dei virioni maturi, oltre che per il contatto con la superficie cellulare ricoperta di muco.

Þ Proteina M2. Forma un canale ionico e permette il distacco del nucleocapside dalla proteina matrice.

Replicazione

• Legame di HA ad acido sialico e ingresso del virus in un endosoma.

• Ambiente acido di endosoma provoca esposizione di sito fusogeno di HA: fusione dell'envelope con la membrana dell'endosoma.

• Formazione di canale protonico da parte di M2: pH