Tossicologia applicata - Modulo III

Tossicologia applicata Modulo 3

Prof.ssa Fabiana Morroni

Introduzione alla tossicologia applicata

La tossicologia applicata rientra nel percorso di sviluppo di un nuovo farmaco. Il percorso di sviluppo di un farmaco inizia con la scoperta e la selezione delle molecole (= discovery). Seguono gli studi preclinici (svolti in vivo, sull’animale) che rappresentano la focalizzazione della tossicologia e cioè ciò che precede la prima somministrazione sull’uomo. Viene poi richiesta l’autorizzazione di sperimentazione sull’uomo con la presentazione del comma L all’AIFA, EMA e IIS e infine inizia la sperimentazione clinica. Nel caso in cui il farmaco sia già in commercio ma necessiti di revisione, allora la richiesta non viene fatta all’IIS ma al Ministero della Salute. Infine, si ha la fase 4 che consiste nella farmacovigilanza dove il farmaco viene controllato da quando è immesso sul mercato fino a quando (in alcuni casi) verrà ritirato dal mercato.

Percorso di sviluppo del farmaco

Alcune fasi si sovrappongono poiché il brevetto ha un termine e se così non fosse si arriverebbe all’immissione in commercio in un tempo superiore alla durata del brevetto e quindi arriverebbe in commercio l’equivalente prima del farmaco brevettato che non avrebbe nessun vantaggio a livello economico. La durata del drug discovery è di circa 12 anni ed è un processo ad imbuto; si parte da moltissime molecole per arrivare ad un prototipo (composto che potenzialmente potrà essere il futuro farmaco). Per la pre-clinica si impiegano 2-3 anni di sperimentazione, e si impiega un 30% delle risorse messe a disposizione per avere un nuovo farmaco. La maggior parte degli studi, un 30-40% delle volte, termina proprio dal passaggio da pre-clinica a fase I clinica = grande collo di bottiglia dove la maggior parte dei composti subisce un freno perché la fase I clinica si fa su volontari sani e si va a valutare la farmacocinetica e la tollerabilità (l’efficacia si valuterà in fase II su pazienti non sani) = seppur nell’uomo vengano utilizzate dosi più basse di quelle utilizzate nell’animale, il passaggio di specie comporta comparsa di effetti tossici, il farmaco non viene assorbito o metabolizzato = la maggior parte dei composti termina la sua corsa a questo livello.

Fasi cliniche

• Fase I: studi in volontari sani
• Fase II: studi in pazienti
• Fase III: studi su larga scala

Una volta terminata la fase 3 si fa domanda di autorizzazione all’immissione in commercio e una volta ottenuta inizia la fase 4 o farmacovigilanza.

Obiettivi delle varie fasi

• Preclinica: fase che interessa a noi come tossicologia applicata e l’obiettivo è valutare la tossicità e l’effetto farmacologico nell’animale. Si impiegano 1-2 anni ed il 30-40% delle risorse
• Fase 1: effetti tossici e farmacologici sull’uomo
• Fase 2: indagine clinica sull’efficacia
• Fase 3: valutazione di efficacia e tollerabilità su larga scala
• Fase 4: farmacovigilanza per conoscere gli effetti indesiderati a 360°

Obiettivi della ricerca pre-clinica

• Individuazione di una molecola dotata di attività farmacologica
• Valutazione delle caratteristiche (stabilità, durata d’azione)
• Individuazione della formulazione per una via o più vie di somministrazione = biodisponibilità
• Valutazione della sicurezza (interessa a noi per quanto riguarda la tossicologia) = deve essere sicura e la tollerabilità deve essere buona, se non ottima

Tale sperimentazione è fondamentale per poter poi procedere al trattamento nell’uomo. Va eseguita attenendosi attentamente e rigorosamente alle norme emanate dalle istituzioni pubbliche e prevede l’utilizzo di animali per la sperimentazione dei farmaci. Non esiste alcuna specie che sia del tutto simile all’uomo. La scelta della specie animale può essere influenzata da considerazioni di natura logistica, quali: facilità di allevamento e stabulazione, velocità di crescita e sviluppo, facilità di manipolazione nel corso dell’esperimento (di solito si utilizzano i ratti poiché piccoli, docili, gravidanza di 21 giorni e 10 piccoli per nidiata).

Studi preclinici richiesti

• Qualità del processo di produzione (processo di produzione purezza)
• Farmacodinamica (studi in vitro e in vivo)
• Sicurezza d’uso (tossicologica e farmacologica)
• Farmacocinetica (studi in vitro)

Autorizzazione all’Immissione in Commercio (AIC)

Per essere impiegato un medicinale deve ottenere l’AIC, attraverso una procedura che ne accerti l’efficacia e la sicurezza. L’autorizzazione è rilasciata dai Ministeri della Salute oppure da Enti governativi (Agenzie) a ciò preposti.

• Negli USA: Food and Drug Administration (FDA)
• In Europa: European Medicines Agency (EMA)
• In Italia: Il Ministero della Salute e in particolare la nuova Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA)
• Nel Regno Unito (UK): la Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (MHRA)

Organizzazione di un laboratorio di tossicologia

I laboratori devono essere organizzati al fine di facilitare la sperimentazione in condizioni di sicurezza. Devono esistere servizi disponibili che consistono in aree separate (microbiologia, colture cellulari e tessuti, biochimica, stabulario, istopatologia). Le attrezzature di base ed i servizi per la preparazione di terreni colturali, lavaggio della vetreria, conservazione dei composti chimici, devono essere nelle vicinanze immediate dei laboratori. A causa del potenziale rischio derivante dai composti chimici, è essenziale che il personale dei laboratori, gli eventuali visitatori e l’ambiente siano protetti, confinando questi materiali mediante l’applicazione di procedure sperimentali definite, aree designate per l’uso specifico, e sistemi di controllo e di decontaminazione.

Rischio chimico

Il rischio chimico è connesso all’uso professionale di sostanze o preparati impiegati nei cicli di lavoro, che possono essere intrinsecamente pericolosi o risultare pericolosi in relazione alle condizioni di impiego.

Sistema GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals)

Il sistema GHS nasce come un programma volontario mondiale di armonizzazione della Classificazione ed Etichettatura delle Sostanze Pericolose. Assicura che le informazioni sui pericoli associati ai prodotti chimici siano le stesse in tutto il mondo.

• Non ridurre i livelli di protezione per salute umana e ambiente
• Classificazione basata sulle proprietà intrinseche (pericolo non più rischio)
• Tutti i sistemi normativi dovranno essere modificati
• I criteri ed i valori limite che definiscono categorie e classi di pericolo saranno uguali per ogni tipo di regolamentazione

Il regolamento incorpora i criteri di classificazione ed etichettatura, i simboli e le avvertenze concordate a livello globale (GHS), pur mantenendo una continuità con la normativa europea. Permette l’applicazione del sistema GHS all’interno della Comunità Europea. I pittogrammi identificano le “Classi di pericolo”:

• Fisici (16 classi)
• Per la salute (10 classi)
• Per l’ambiente (2 classi)

Sottogruppi di classi indicano l’intensità del pericolo.

Frasi H e Frasi PH, indicazioni di pericolo

Le frasi H, da hazard cioè azzardo, indicano il pericolo associato ai composti chimici. Ad ogni indicazione di pericolo corrisponde un codice alfanumerico composto dalla lettera H seguita da 3 numeri, il primo numero indica il tipo di pericolo (H2 = pericoli chimico-fisici, H3 = pericoli per la salute, H4 = pericoli per l’ambiente), i due numeri successivi corrispondono all’ordine sequenziale di definizione.

Le frasi P, da prudenza, rappresentano i consigli di prudenza. Ad ogni consiglio di prudenza corrisponde un codice alfanumerico composto dalla lettera P seguita da 3 numeri, il primo numero indica il tipo di consiglio (P1 = carattere generale, P2 = prevenzione, P3 = reazione, P4 = conservazione, P5 = smaltimento), i due numeri successivi corrispondono all’ordine sequenziale di definizione.

Codici di indicazione di pericolo

• H200: Esplosivo instabile.
• H201: Esplosivo; pericolo di esplosione di massa.
• H202: Esplosivo; grave pericolo di proiezione.
• H203: Esplosivo; pericolo di incendio, di spostamento d'aria o di proiezione.
• H204: Pericolo di incendio o di proiezione.
• H205: Pericolo di esplosione di massa in caso d'incendio.
• H220: Gas altamente infiammabile.
• H300: Letale se ingerito.
• H301: Tossico se ingerito.
• H302: Nocivo se ingerito.
• H304: Può essere letale in caso di ingestione e di penetrazione nelle vie respiratorie.
• H400: Molto tossico per gli organismi acquatici.
• H410: Molto tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata.
• H411: Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata.

Codici di consigli di prudenza

• P101: In caso di consultazione di un medico, tenere a disposizione il contenitore o l'etichetta del prodotto.
• P102: Tenere fuori dalla portata dei bambini.
• P103: Leggere l’etichetta prima dell’uso.
• P201: Procurarsi le istruzioni prima dell’uso.
• P202: Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze.
• P210: Tenere lontano da fonti di calore/scintille/fiamme libere/superfici riscaldate - Non fumare.
• P211: Non vaporizzare su una fiamma libera o altra fonte di ignizione.
• P220: Tenere/conservare lontano da indumenti/materiali combustibili.
• P310: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI o un medico.
• P311: Contattare un CENTRO ANTIVELENI o un medico.
• P312: In caso di malessere, contattare un CENTRO ANTIVELENI o un medico.
• P313: Consultare un medico.
• P403: Conservare in luogo ben ventilato.
• P404: Conservare in un recipiente chiuso.
• P405: Conservare sotto chiave.
• P406: Conservare in recipiente resistente alla corrosione/provvisto di rivestimento interno resistente.
• P407: Mantenere un intervallo d’aria tra gli scaffali.
• P501: Smaltire il prodotto/recipiente in...

Scheda di sicurezza

1. Identificazione preparato/produttore
2. Composizione/informazioni sui componenti
3. Identificazione dei pericoli
4. Misure primo soccorso
5. Misure antincendio
6. Misure per fuoriuscita accidentale
7. Manipolazione e stoccaggio
8. Controllo esposizione/protezione individuale
9. Proprietà fisiche/chimiche
10. Stabilità e reattività
11. Informazioni tossicologiche
12. Informazioni ecologiche
13. Considerazioni sullo smaltimento
14. Informazioni sul trasporto
15. Informazioni sulla regolamentazione
16. Altre informazioni

Rischio biologico

Il rischio biologico riguarda l'esposizione ad agenti biologici. Un agente biologico è qualsiasi microrganismo, coltura cellulare, ed endoparassita umano che potrebbe provocare infezioni, allergie o intossicazioni.

Classificazione degli agenti biologici

• Infettività: capacità di sopravvivere alle difese dell’ospite e di moltiplicarsi in esso
• Patogenicità: capacità di produrre malattia a seguito di infezione
• Trasmissibilità: capacità di essere trasmesso da un soggetto portatore o malato ad un soggetto non infetto
• Neutralizzabilità: disponibilità di efficaci terapie, profilassi per prevenire la malattia

Azione degli agenti biologici: azione infettiva (protozoi, virus, muffe e lieviti), azione allergizzante (actinomiceti termofili, da microfunghi come Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Aureobasidium, ecc), protozoi (Naegleria gruberi, Acanthamoeba ecc) o metaboliti microbici, e azione tossica (da metaboliti quali endotossine, micotossine).

Classificazione degli agenti biologici in funzione della loro pericolosità

• Gruppo 1 = scarsamente patogeni
• Gruppo 2 = possono causare malattia; rischio limitato di diffusione in comunità, di norma disponibili misure profilattiche e terapeutiche
• Gruppo 3 = altamente patogeni; serio rischio per i lavoratori: possono propagarsi nella comunità, di norma disponibili misure profilattiche e terapeutiche
• Gruppo 4 = altamente patogeni ed infettanti; serio rischio per i lavoratori - elevato rischio di propagazione in comunità; di norma non disponibili misure profilattiche e terapeutiche

È importante distinguere: Uso deliberato → quando gli agenti biologici vengono deliberatamente introdotti nel ciclo lavorativo per esservi trattati, manipolati o trasformati ovvero per sfruttarne le proprietà biologiche a qualsiasi titolo. Esposizione potenziale → quando si determina la presenza di agenti biologici, anche di gruppo 4, non orientata ad un vero e proprio uso, mancando il deliberato intento di farne oggetto dell’attività lavorativa.

Cappe di sicurezza biologica

La maggior parte delle attività di laboratorio, quali la miscelazione, la frantumazione, l’agitazione, lo scuotimento di materiale infetto possono inavvertitamente generare aerosol pericolosi; essendo gli aerosol importanti fonti di infezione, si deve cercare di ridurne la formazione e dispersione al minimo. È buona norma eseguire queste operazioni in una cappa di sicurezza biologica di tipo appropriato. Le cappe agiscono come barriere per minimizzare il rischio di infezioni per via aerea impedendo la fuoriuscita di questi aerosol nell’ambiente di laboratorio e la loro inalazione da parte dei lavoratori.

Tipi di cappe di sicurezza biologica

Esistono tre tipi di cappe di sicurezza biologica: classe I, II, e III. La loro efficacia dipende dal flusso dell’aria, dalla capacità di contenimento, dall’integrità dei filtri HEPA (high efficiency particulate air filter) e, nel caso delle cappe I e II, dalla loro posizione nella stanza in relazione alle correnti di aria e ai movimenti del personale (vanno poste lontano dalle zone di passaggio e da correnti d’aria provenienti da porte, finestre ed all’impianto di aerazione).

Cappa di classe I

Una cappa di sicurezza biologica classe I è una cappa ventilata aperta frontalmente progettata per la protezione dell’operatore tramite un flusso d’aria entrante che non viene rimandata in circolo. È dotata di un filtro HEPA allo scarico per proteggere l’ambiente dalla fuoriuscita di microrganismi. Le cappe classe I possono essere usate con agenti biologici che presentino un rischio basso o moderato (gruppi di rischio 2 e 3); proteggono l’operatore da contaminanti presenti nella cappa, ma non proteggono dalla contaminazione i materiali situati all’interno della cappa stessa (la sterilità non è garantita!).

Cappa di classe II a flusso laminare verticale

È caratterizzata da un flusso d’aria in ingresso con filtrazione sia dell’aria aspirata sia di quella espulsa: il flusso laminare, proveniente dal sovrastante filtro HEPA, scende perpendicolarmente al piano di lavoro evitando di investire l’operatore. L’aria espulsa viene filtrata da un secondo filtro HEPA e, se è necessario farla ricircolare nello stesso locale, da un filtro supplementare a carbone attivo posto a valle del filtro HEPA, per trattenere eventuali frazioni gassose.

Assicurano un ambiente microbiologicamente puro nella cappa e protezione nei confronti dell’operatore:

• Tipo A: ricircolo del 70% dell’aria dopo passaggio attraverso filtri HEPA nella cabina ed immissione nell’ambiente previo passaggio attraverso HEPA del 30% dell’aria
• HEPA: rimuovono il 99.97% del particolato (fino a 0,3 nm). Sono inefficaci contro gas e vapori
• Filtri a carbone: abbattono composti volatili
• Tipo B: ricircolo del 30% dell’aria nella cabina ed emissione del 70%. L’emissione dovrebbe essere diretta fuori dal laboratorio e con filtri a carbone attivato

Cappa di classe III

Una cappa di sicurezza biologica classe III è una cappa ventilata totalmente chiusa che è a tenuta d’aria ed è mantenuta a pressione negativa. L’aria in ingresso passa per un filtro HEPA e quella in uscita passa per due filtri HEPA posti in serie. Il lavoro viene svolto con guanti a manica in gomma attaccati alla cappa.

Requisiti per i laboratori BL2

• Porte chiudibili
• Lavandino per lavare le mani
• Superfici facilmente lavabili, idrorepellenti e resistenti
• Cappa biologica di sicurezza (classe II)
• Illuminazione adeguata
• Lava-occhi
• Ricambio aria forzato senza ricircolo
• Disponibilità di un autoclave
• Raccolta differenziata dei rifiuti
• Separato da zone con rischi diversi (es: studi, accesso pubblico, etc.)

Colture cellulari e test di citotossicità

Colture cellulari

Le colture cellulari si utilizzano per test in vitro: cellule isolate dal loro ambiente e messe in condizioni di vivere all'interno di un sistema definito. Sono uno strumento fondamentale per studi biochimici, microbiologici, farmacologici e inoltre sono utili nella produzione di fattori di crescita, anticorpi monoclonali, vaccini, proteine ricombinanti in generale. Nel 1951 è stata messa in coltura la prima linea cellulare stabilizzata umana, di origine tumorale: la linea HeLa (dal nome della prima paziente). Conoscendo le caratteristiche delle colture è possibile apprezzarne i vantaggi offerti in vivo (ad esempio studi di tossicità sulla nostra specie, per la quale esistono evidenti problemi).