Terapia genica - Vettori Virali

3. VETTORI VIRALI

CARATTERISTICHE PRINCIPALI

I vettori virali sono di vario tipo:

 Retrovirus: possono infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale

 sono virus derivati dall’HIV,

Lentivirus: possono infettare cellule quiescenti e si integrano in ma-

niera casuale

 Adenovirus: espressione ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immuni-

tarie

 Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito-specifica ed espressione stabile nel tempo, diffi-

coltà nel produrli ad alto titolo (sono piccoli e non patogenetici)

 Herpes Simplex: infezione selettiva sui neuroni ma importanti effetti citotossici

I vettori virali si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma dei diversi tipi di virus, sotto il con-

trollo di un promotore forte. Il virus viene reso incapace di riprodursi autonomamente per evitare la diffu-

sione di virus ricombinanti (difettivo). Il genoma viene ingegnerizzato con tecniche di DNA ricombinante e

transfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le particelle virali ricombinanti (linee di packaging).

Queste complementano i difetti introdotti nel genoma.

Il principale vantaggio consiste nell’elevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule). Gli svan-

taggi di questo tipo di vettori sono dovuti alla possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombina-

zione con eventuali virus già presenti nell’ospite, mutagenesi inserzionale (per quelli che integrano in

maniera casuale nel genoma), capacità limitata, reazioni immunitarie, costi elevati.

Virus difettivi: possono essere prodotti solo in particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del

virus. La loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate:

1. Costruzione del genoma ricombinante

2. Transfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali

3. Raccolta ed analisi del virus

VIRUS ADENO-ASSOCIATI (AAV)

Gli adeno-associati appartengono ai Parvovirus, scoperti in primo luogo come contaminanti di preparazioni

di un virus helper (per esempio Adenovirus) per l’infezione produttiva.

di Adeno, richiedono la presenza

Sono stati caratterizzati 11 sierotipi, si lavora principalmente sul AAV-2 e ad oggi non sono stati associati

a nessuna patologia, caratteristica ideale per derivarne un vettore di terapia genica.

Il suo genoma è organizzato in un unico filamento di 5Kb di cui 145bp su entrambi i lati ci sono ripetizioni

REP (deputato alla replicazione del DNA e all’integra-

terminali che corrispondono alle ITR. Possiede 2 geni

zione) e CAP (deputato alle proteine del capside VP1-VP2-VP3), ha una simmetria icosaedrica. La loro in-

tegrazione è sito-specifica e precisamente sul braccio q 13.3 del cromosoma 19.

Per fare di un virus adeno-associato un vettore vengono deleti i geni REP e CAP in favore del cDNA di

interesse. In ogni caso non sarà possibile inserire nel vettore segmenti più lunghi di 4,7Kb.

Gli adeno-associati non sono in grado di replicare autonomamente.

Se un virus infetta la cellula nella quale si è integrato l’adeno-associato allora que-

sto si replicherà altrimenti resta in latenza. Per produrre adeno-associati viene fatta

infettare una cellula con l’adeno-associato più un virus (adenovirus) più un plasmide che

porti i geni REP e CAP (viene quindi amplificato coinfettando cellule, non è facile pro-

durre AAV). A differenza degli adenovirus, i quali vengono centrifugati in gradiente di

CsCl, questi verranno sottoposti a cromatografia di affinità con eparina.