Virus e terapia genica

RETROVIRUS

Retrovirus sono una delle famiglie di virus più studiate. Nel 2008, Hausen, Barré-Sinoussi e Montagnier hanno vinto il premio Nobel per la medicina, per la ricerca su due virus molto importanti per la specie umana, ovvero il Papilloma virus e l'HIV.

L'HPV è un virus a DNA a doppio filamento, mentre l'HIV è un retrovirus, della famiglia dei lentivirus.

I retrovirus erano precedentemente divisi in tre sottofamiglie, sulla base della patogenicità. Questa distinzione è abbastanza antiquata e presenta:

• oncovirus: causano tumori
• lentivirus: causano compromissione del sistema immunitario
• spumavirus: retrovirus con scarso potere patogeno, che si chiamano così, perché hanno capacità di indurre una degenerazione delle cellule infettate, che assumono una forma simile a vacuoli e aspetto spumoso

Attualmente si classificano sette generi di retrovirus, che sono:

• alpha-retrovirus: comprende il virus

degli uccelli● beta-retrovirus: indurre tumore nei topi● gamma-retrovirus: indurre tumore nei topi● delta-retrovirus: comprende la leucemia bovina e l'HTLV● epsilon-retrovirus● lentivirus: comprende l'HIV● spumavirus Questi sette gruppi possono essere ulteriormente classificati in due gruppi separati, quali retrovirus semplici, nel caso di alpha, beta e gamma, e retrovirus complessi, nel caso delta, epsilon, lentivirus e spumavirus. Questa suddivisione è basata soprattutto sul genoma. Il virione del retrovirus ha un diametro di circa 100-120 nm, una forma sferica ed è circondato da un envelope. L'envelope è formato da una membrana, che deriva dalla cellula infettata, e proteine virali. Il genoma è costituito da due catene identiche di RNA a singolo filamento a polarità positiva. La dimensione è variabile, ma in media sono presenti circa 9 kb. Una delle caratteristiche principali dei retrovirus è la presenza della

trascrittasi inversa, un enzima caratteristico, che ha la funzione di DNA polimerasi RNA dipendente. Inoltre, è presente anche l'integrasi, un enzima che permette l'integrazione del DNA virale nel genoma ospitante.

Tutti i retrovirus presentano un'organizzazione del genoma caratteristica. In particolare, ogni retrovirus, che sia semplice o complesso, contiene tre geni importanti, codificanti per poliproteine, che vengono poi sintetizzate durante il ciclo di replicazione virale:

• GAG: codifica per proteine strutturali, quindi del capside, della matrice e del nucleocapside
• POL: codifica per enzimi virali, quali trascrittasi inversa, integrasi e proteasi
• ENV: codifica per le proteine transmembrana dell'envelope

Esistono poi delle sequenze laterali, sequenze ripetute, che hanno varie funzioni:

• sono importanti per l'integrazione virale all'interno del genoma dell'ospite
• stimolano la trascrizione virale

Inoltre, vi è un'altra sequenza,

detta di packaging (P), importante, perché permette l'inserimento del RNA virale nei virioni, quando questi sono prodotti durante la replicazione virale. Questa struttura è importante anche per l'ingegnerizzazione dei retrovirus a scopo terapeutico. I retrovirus possono, infatti, essere ingegnerizzati, in quanto sono un meccanismo molto sofisticato di trasferimento di una sequenza di DNA o di un gene in una cellula. Possono quindi essere sfruttati con scopo terapeutico, attraverso la terapia genica.

L'ingegnerizzazione dei retrovirus deve innanzitutto renderli del tutto inoffensivi. Sono stati creati in laboratorio dei geni che contengono solo la sequenza che si vuole trasferire, senza più le caratteristiche patologiche. Il virus non ha quindi più la capacità di replicarsi, ma solo di trasferire il gene che trasporta nella cellula. Per fare ciò viene sfruttato, appunto, il sistema di packaging.

Inoltre, sono stati creati dei vettori

auto inattivanti, che sono in grado di eliminare ogni rischio di creare delle particelle virali infettive.

Alcuni retrovirus contengono anche un gene analogo a quelli cellulari, più delle volte mutato in modo da indurre la trasformazione neoplastica della cellula infettata. Questo oncogene può essere in più, oltre ai geni virali, o essere al posto di un gene dei retrovirus. In quest'ultimo caso, il retrovirus che infetta la cellula causa la trasformazione neoplastica della cellula stessa, senza poi essere in grado di replicarsi all'interno dell'ospite.

Altri geni aggiuntivi possono essere:

• il gene che codifica per la proteina TAX, contenuta all'interno di una particolare classe di retrovirus, la quale funge da transattivatore, cioè può attivare la trascrizione del DNA virale e anche di geni cellulari
• il gene REV (per HIV) e REX (per HTLV), che codificano rispettivamente per le proteine REV e REX.

In particolare, REX è

un'altra proteina accessoria, che facilita l'mRNA virale fuori dal nucleo.

Trascrittasi inversa

La trascrittasi inversa è un enzima essenziale per la replicazione dei retrovirus e ha tre funzioni:

1. DNA polimerasi RNA dipendente
2. DNA polimerasi DNA dipendente, simile alla DNA polimerasi cellulare
3. RNAsi H, quindi è in grado di degradare l'RNASi trovano circa 30 molecole di trascrittasi inversa in ogni virione, anche se il numero è variabile. È notal'alta percentuale di errore, importante, perché facilita l'insorgenza di mutazioni. Ad esempio, l'HIV è un virus per il quale è molto difficile preparare un vaccino, perché muta molto spesso.

Le sequenze di basi ripetute ai due estremi di RNA del retrovirus, all'estremità 3' e al 5', hanno la caratteristica di essere retro trascritte. Quindi il provirus, ovvero la forma del genoma del virus integrato nel genoma dell'ospite,

non è del tutto uguale al genoma virale di partenza, ma è più lungo, perché queste regioni laterali vengono retro trascritte due volte.

Ciclo replicativo del retrovirus

Le fasi essenziali sono: attacco, fusione, trascrittasi inversa e integrazione del DNA virale nel genoma dell'ospite.

Il ciclo replicativo dei retrovirus inizia con i legami con i recettori della cellula ospite. Successivamente si verifica tutto il processo che porta alla formazione del DNA virale.

La trascrittasi inversa (RT) si associa a un tRNA-primer in 5' al primer binding site (PBS). Inizia così la retrotrascrizione e si forma un corto pezzo di DNA(-) di un centinaio di nucleotidi.

Quando l'enzima raggiunge l'estremità, l'attività RNAsica di RT degrada l'RNA appaiato come ibrido alla molecola di DNA in formazione. Rimane così esposto un piccolo tratto di DNA a singolo filamento (sequenza R) complementare al segmento presente

all'estremo 3'. Poi RT salta al 3' grazie alle sequenze complementari R e continua la sintesi del DNA(-) fino al PBS. Successivamente si riattiva la funzione di RNAsi H della trascrittasi inversa, che degrada la maggior parte dell'RNA virale, esclusa una zona centrale, ricca in purine (C-G). Qui inizia la sintesi del secondo filamento DNA(+) trascritto sullo stampo del DNA prodotto, che si arresta in 3'. Dopodiché RT salta di nuovo all'estremo 3' e il corto DNA(+) ibrida con il PBS in 5', dove continua la sintesi di DNA in entrambe le direzioni, sfruttando la complementarietà delle sequenze PBS. Così si ottiene un raddoppio delle estremità 3' e 5', e la formazione di LTR (Long Terminal Repeat) complete ad entrambe le terminazioni. La fase successiva è l'integrazione del DNA virale, del provirus, nel genoma dell'ospite. Alcuni retrovirus possono formare un complesso di pre-integrazione (PIC),

che conferisce ai retrovirus la capacità di infettare cellule quiescenti. I retrovirus che non hanno questa capacità possono infettare solo cellule in divisione, il nucleo è, infatti, reso permeabile. Il complesso di pre-integrazione è un complesso nucleoproteico, formato da materiale genetico virale e da proteine sia dell'ospite che virali. Questo ha la funzione di trasportare il DNA virale nel nucleo e integrarlo nel genoma dell'ospite. Nel caso dell'HIV, il complesso di pre-integrazione si forma dopo che il complesso di trascrizione inversa ha trascritto l'RNA virale in DNA. Il PIC è in grado di trasportare il DNA virale nel nucleo attraverso il sistema dei pori nucleari, senza interrompere l'involucro nucleare. Questo processo viene chiamato di trafficking. L'integrazione è catalizzata dall'integrasi, un enzima virale che coinvolge fasi sequenziali di rottura e unione di DNA. La prima fase è quella di una rottura.

Che forma delle sticky ends. Si ha poi la rottura del DNA dell'ospite e la riparazione dei gap, che porta alla formazione di provirus, affiancato da brevi ripetizioni di DNA caratteristiche di ciascun virus (di 4 o 5 paia di basi).

I retrovirus hanno anche dei siti di integrazione preferenziali. Ad esempio, l'MLV (Murine Leukemia Virus) si integra preferenzialmente vicino a siti di inizio della trascrizione, come le CpG islands. L'HIV si integra nel genoma dell'ospite preferenzialmente vicino a geni trascrizionalmente attivi, mentre altri non hanno necessariamente siti di integrazioni preferenziali.

Una volta che il DNA retrovirale è integrato, questo è in grado di trascrivere l'RNA virale, che viene trascritto dalla RNA polimerasi II dell'ospite, come trascritto primario. Chiaramente, una volta che il virus si è integrato come provirus nel genoma dell'ospite, utilizza il macchinario cellulare della trascrizione per trascrivere il

Il tuo genoma, che viene poi processato e impacchettato nei nuovi capsidi. Tropismo Il tropismo può essere di tre tipi: - tropismo di ospite (es. virus Myxoma, che infetta i conigli, ma non può infettare gli umani) - tropismo di tessuto (es. virus dell'influenza, che intacca il tessuto polmonare) - tropismo cellulare (es. HIV, che infetta cellule del sistema immunitario). Il tropismo è dato dal fatto che le proteine dell'envelope virale interagiscono con dei recettori presenti sulla membrana cellulare, i quali assumono il ruolo di determinanti molecolari. L'HIV, come altri lentivirus, utilizza preferenzialmente dei recettori delle chemochine. In particolare, utilizza i recettori CCR5 e CXCR4. CCR5 è molto espresso nei macrofagi, nei linfociti e nelle cellule dendritiche. L'HTLV utilizza GLUT1, un trasportatore del glucosio. Tumori associati I tumori sono malattie genetiche, in quanto sono associabili a anomalie cromosomiche e mutazioni. Inoltrele di un tumore possono essere descritte attraverso una serie di attributi comuni. Queste caratteristiche includono: - Dimensione delle cellule: le cellule tumorali possono essere più grandi o più piccole delle cellule normali. - Forma delle cellule: le cellule tumorali possono avere una forma irregolare o anomala rispetto alle cellule normali. - Nucleo delle cellule: il nucleo delle cellule tumorali può essere più grande, avere una forma irregolare o contenere anomalie genetiche. - Rapporto nucleo/citoplasma: il rapporto tra il nucleo e il citoplasma delle cellule tumorali può essere alterato rispetto alle cellule normali. - Velocità di divisione cellulare: le cellule tumorali possono dividersi più rapidamente delle cellule normali. - Invasività: le cellule tumorali possono invadere i tessuti circostanti e diffondersi in altre parti del corpo. - Angiogenesi: le cellule tumorali possono stimolare la formazione di nuovi vasi sanguigni per fornire nutrimento al tumore. - Metastasi: le cellule tumorali possono staccarsi dal tumore originale e diffondersi ad altre parti del corpo attraverso il flusso sanguigno o il sistema linfatico. Queste caratteristiche delle cellule tumorali sono importanti per la diagnosi e la classificazione dei tumori, nonché per la scelta del trattamento più appropriato.