Virus e terapia genica

Virusi: una panoramica

I virus rappresentano la classe di microrganismi più abbondante sulla Terra. Sono parassiti intracellulari obbligati, cioè possono sopravvivere soltanto in una cellula ospite. Il loro potenziale infettivo è soggetto a variabilità: ci sono, ad esempio, virus che hanno la capacità di infettare tutti i tipi di cellule, tra cui cellule eucariotiche, funghi e batteri.

La scoperta dei virus

La scoperta dei virus avvenne verso la fine dell’Ottocento, grazie all’invenzione di un filtro, dotato di pori molto piccoli. Il diametro di questi pori era tale che lo strumento non permetteva il passaggio di nessuna cellula, nemmeno dei batteri. Fu un biologo russo, che stava effettuando degli studi sulla pianta di tabacco per capire l’origine della malattia da cui era affetta, a farne la scoperta. Utilizzando questo filtro, si accorse che l’agente infettante riusciva a passare attraverso i pori. Da questa osservazione, dedusse che si doveva trattare, per forza di cose, di un patogeno più piccolo dei batteri.

In realtà, lo studio dei virus è continuato nei decenni successivi, per tutto il secolo scorso. La loro struttura è stata chiarificata grazie all’invenzione del microscopio elettronico, avvenuta negli anni ’30. Gli studi effettuati hanno permesso di individuare diverse migliaia di tipologie di virus.

I virus e l'albero della vita

I virus non possono essere collocati nell’albero della vita. Tutt’oggi, in realtà, è ancora aperto un dibattito sulla possibilità di considerare i virus come viventi. Infatti, presentano delle caratteristiche che li accomunano agli altri organismi viventi. Ad esempio, possiedono un materiale genetico costituito spesso da DNA. Tuttavia, di norma, non vengono considerati vivi, perché non presentano un metabolismo.

Si è inoltre notato che si sono evoluti in maniera molto eterogenea e possiedono morfologie e caratteristiche variabili gli uni dagli altri. Infatti, non è possibile individuare un antenato comune a tutte le classi di virus e, conseguentemente, sono difficili da classificare.

Struttura e caratteristiche dei virus

Alcuni virus presentano un patrimonio genetico costituito da RNA. Questa caratteristica è peculiare, perché infrange, in parte, il dogma centrale della biologia molecolare. Sia il DNA che l’RNA possono essere a singolo o doppio filamento. Mentre un batterio ha un diametro compreso tra 1-3 micron, normalmente i virus sono più piccoli di almeno un ordine di grandezza. Il Coronavirus, ad esempio, presenta un diametro di 0.1-0.5 micron. Dato che le varie classi sono molto eterogenee, ci saranno sicuramente virus di dimensioni inferiori e altri che, invece, si possono paragonare ad una cellula batterica per la loro estensione.

L’importanza dello studio dei virus dipende soprattutto dal fatto che essi sono responsabili di diverse patologie. Qualunque organo o tessuto può essere infatti bersaglio della loro infettività. Quando ci si riferisce ad un’unità di virus, non si può parlare di una cellula virale, ma di una particella virale. Infatti, non presentano una costituzione analoga alle cellule. Possono avere un rivestimento derivante dalla membrana cellulare, ma, di fatto, sono normalmente costituiti da proteine e acidi nucleici. L’involucro proteico che delimita il virus prende il nome di capside.

Non presentano un proprio metabolismo, perciò possono riprodursi soltanto all’interno di cellule viventi. Non possiedono infatti un comparto enzimatico tale da permettere un’attività biosintetica che sostenga la loro sopravvivenza. Conseguentemente, sfruttano il metabolismo della cellula.

Specificità e trasmissione dei virus

Sono trasmissibili e hanno una specificità di ospite. Ciò vuol dire che ogni virus ha la capacità di infettare un particolare tipo di ospite, come una cellula eucariote umana oppure una cellula batterica. Nel caso dei virus umani, si osserva spesso una caratteristica, che prende il nome di tropismo. Questo termine indica la capacità del virus di infettare un particolare tipo cellulare, nell’ambito di uno specifico tessuto. Questa peculiarità è determinata dalle proteine che costituiscono il capside o l’envelope. Ad esempio, nel caso del Coronavirus, la proteina Spike dell’envelope determina il tropismo per quelle cellule che presentano un recettore, a cui si possa legare. Sono inoltre resistenti a condizioni fisiche estreme, come temperature elevate.

Virione

Il termine virione indica una particella virale, costituita da due componenti:

• Genoma o core virale, che è variabile, infatti, può essere formato da DNA o RNA. Inoltre, può presentarsi:
  • In singola copia o in più copie
  • A singola o doppia elica
  • Lineare, circolare o segmentato, cioè sotto forma di frammenti
• Capside o core, cioè un involucro proteico che circonda e protegge il genoma. Si tratta generalmente di una struttura multimerica, ovvero costituita da diverse unità uguali tra loro. La singola unità costituente il capside prende il nome di capsomero. In alcuni casi, il capsomero ha la capacità di interagire con componenti presenti sulla superficie cellulare, fungendo da vero e proprio recettore.

Un’organizzazione di questo tipo è estremamente semplice, il che si traduce in dimensioni del genoma il più possibile ridotte. Sarà infatti sufficiente un unico gene, che codifica per tutte le proteine costituenti l’involucro proteico. L’insieme del genoma e del capside prende il nome di nucleocapside. Invece, in alcuni virus, si può trovare una terza componente, chiamata envelope. Si tratta di un rivestimento analogo alla membrana cellulare, infatti deriva dalla membrana dell’organismo ospite. È quindi costituito da fosfolipidi e glicoproteine. Le proteine costituenti l’envelope possono, però, essere comunque codificate dal genoma virale.

L’envelope presenta talora dei prolungamenti, detti peplomeri. Si tratta di proiezioni proteiche superficiali. Può contenere anche alcune glicoproteine virali, che fungono da recettori nei confronti delle cellule bersaglio. Sono sempre queste molecole a permettere il riconoscimento antigenico. Inoltre, l’envelope svolge anche una funzione protettiva e permette la penetrazione del virus all’interno della cellula ospite, tramite meccanismi di fusione.

Le proteine costituenti l’envelope possono avere quindi le seguenti funzioni:

• Aggancio
• Fusione
• Attività enzimatica
• Permettere la formazione di canali ionici
• Fungere da antigeni: ne costituisce un esempio la proteina Spike del Coronavirus

Il capside può presentarsi in varie simmetrie:

• Elicoidale: il genoma si avvolge a spirale attorno ad un asse centrale, attorno a cui si avvolgono le proteine del capside. Si tratta tendenzialmente di virus animali oppure di piante e sono sempre provvisti di envelope.
• Icosaedrica: il genoma è impacchettato all’interno del capside di forma icosaedrica, con cui non prende contatto. Questi virus hanno un capside costituito da due diverse proteine:
  • A cinque subunità, dette pentoni, localizzate a livello dei vertici
  • A sei subunità, denominate esoni, localizzate sulle facce dell’icosaedro
• Complessa: si contraddistinguono per dimensioni maggiori rispetto alle altre classi virali, sono stati tra i primi ad essere ampiamente studiati. Alcuni esempi si trovano nel virus responsabile del vaiolo, il poxvirus, e nei batteriofagi di grosse dimensioni come T4. I batteriofagi sono virus che infettano esclusivamente i batteri.

Si distinguono i virioni in due principali categorie:

• Virus nudi: tipologia più semplice, sono virioni costituiti esclusivamente da materiale genetico e capside.
• Virus rivestiti: sono circondati anche dall’envelope. Tra il capside e l’envelope, è presente uno spazio che può contenere proteine virali. I virus nudi sono normalmente più resistenti, in quanto l’envelope è suscettibile a sostanze chimiche, come l’alcol.

Esistono anche virus con un’organizzazione più semplice, i cosiddetti virus difettivi, che sono incapaci di replicazione autonoma e necessitano di virus helper per potersi dividere. Ne sono un esempio i virus adeno-associati, rilevanti nell’ambito della terapia genica. Virus e terapia genica vanno infatti di pari passo, perché essi vengono impiegati come vettori per inserire uno specifico gene terapeutico di interesse in un genoma.

Esistono anche i viroidi, responsabili di alcune malattie che colpiscono le piante. Sono costituiti da RNA a singolo filamento, circolare e nudo.

La replicazione virale

La replicazione virale avviene sempre all’interno della cellula bersaglio. Al di fuori della cellula, il virus ha una sopravvivenza variabile, da qualche minuto fino a diversi giorni, a seconda del tipo virale. I virus contengono enzimi indispensabili per il loro ciclo replicativo, che possono essere polimerasi o proteasi. Ovviamente, in questo processo, dipendono da complessi enzimatici resi disponibili dalla cellula infettata. Di fatto, per effettuare la replicazione, sovvertono il metabolismo cellulare.

I virioni si possono osservare solo quando si trovano al di fuori della cellula. All’inizio del ciclo replicativo, quando il virus entra in contatto con la cellula, infatti, si dissocia, perdendo la sua caratteristica struttura tridimensionale. Soltanto poco prima della sua fuoriuscita dalla cellula, esso si presenta come un’unica struttura. L’osservazione dei virioni è stata possibile attraverso l’applicazione della tecnica della cristallografia.

Genoma e ciclo virale

Virus a RNA

I virus a RNA rappresentano un’eccezione in natura, perché sono gli unici organismi che non presentano un patrimonio genetico sotto forma di DNA. Anche i retrovirus rientrano in questa eccezione. Il genoma contiene le informazioni per la sintesi di un numero variabile di proteine virali, che può spaziare da un minimo di tre ad un massimo di alcune centinaia.

Le proteine codificate dai virus si distinguono in varie tipologie:

• Proteine funzionali, che permettono all’acido nucleico di replicarsi. Ne costituiscono un esempio la DNA o l'RNA polimerasi.
• Proteine strutturali, come quelle costituenti il capside o che si inseriscono nell’envelope.
• Proteine che alterano funzioni e strutture della cellula ospite.

Possiamo poi classificare le proteine sintetizzate dal genoma virale in:

• Precoci (early proteins): sono tipicamente quelle non strutturali, poiché sono le prime ad essere sintetizzate. Servono al virus per replicare il genoma.
• Tardive (late proteins): coincidono con le proteine strutturali.

I virus possono contenere anche proteine non strutturali, che aiutano la replicazione, ma non sono incorporate nel virione. L’informazione che codifica per esse è contenuta nel patrimonio genetico virale. Vengono infatti sintetizzate durante il ciclo di replicazione all’interno della cellula bersaglio. Si distinguono in diverse tipologie:

• Enzimi necessari per la sintesi e la replicazione del DNA
• Proteine che influenzano la fisiologia cellulare
• Proteine che sopprimono le difese immunitarie della cellula ospite

I virus a RNA si possono suddividere in due sottoclassi:

• A polarità positiva, in cui l’RNA virale funge direttamente da RNA messaggero e viene quindi trascritto immediatamente.
• A polarità negativa, nei quali il genoma virale funge da stampo per la sintesi dell’mRNA. Essi contengono un enzima RNA polimerasi-RNA dipendente.

I virus a DNA hanno tendenzialmente un’unica molecola di acido nucleico, mentre quelli a RNA possono avere più spesso un genoma segmentato.

Fasi del ciclo virale

Durante il ciclo virale, si possono identificare distinte fasi:

1. Periodo di latenza o eclisse, a seguito dell’infezione: scompaiono le particelle virali infettive, perché avviene la rimozione del capside ed il disassemblaggio del virus stesso. La fase di latenza corrisponde all’intervallo temporale in cui ha luogo la replicazione dell’acido nucleico e la sintesi delle proteine virali.
2. Fase di maturazione: il genoma e le proteine vengono assemblati.
3. Fase di rilascio: il numero di particelle infettanti aumenta repentinamente. La liberazione della progenie virale può avvenire con la contemporanea lisi della cellula. La durata del ciclo di replicazione è molto variabile, a seconda del tipo di virus e della cellula ospite.

Batteriofagi

I primi virus ad essere studiati sono i batteriofagi, ossia quelli che colpiscono i batteri. Nei virus di questo tipo esistono due tipi di cicli possibili:

1. Ciclo litico: il fago si attacca alla cellula ospite, rilascia DNA virale e inizia a replicarlo, successivamente vengono sintetizzate e assemblate le proteine virali e, per ultimo, avviene la lisi della cellula.
2. Ciclo lisogenico: dopo il rilascio del DNA virale all’interno della cellula, esso si incorpora nel genoma ospite. La cellula, perciò, inizierà a dividersi, portandosi dietro il DNA virale. In particolari condizioni di stress il genoma virale all’interno del DNA batterico viene exciso e avvia il ciclo litico.

Virus animali

Il ciclo replicativo dei virus animali possiede fasi più complesse:

1. Fase di attacco: avviene grazie alle proteine dell’envelope o del capside.
2. Fase di penetrazione
   • Per endocitosi: innanzitutto avviene un legame tra il virus e un recettore della cellula ospite, e questo forma una vescicola endocitica, che consente l’ingresso del virus. All’interno della cellula viene poi rilasciato il capside. Volendo questa via può essere usata anche da virus con envelope, come nel caso del virus della rabbia.
   • Per fusione: un virus dotato di envelope si lega a specifici recettori sulla cellula. Poi il capside virale viene degradato nel citoplasma, l’acido nucleico virale viene replicato e vengono sintetizzate proteine. Le prime proteine saranno quelle utili ad aiutare la replicazione, e successivamente quelle utili alla sopravvivenza e al riconoscimento del virus, come le glicoproteine virali di superficie, che vengono trasportate all’esterno, verso la membrana plasmatica della cellula ospite. Nel frattempo si assembla il capside e, prima di uscire dalla cellula, il virus utilizza la membrana plasmatica della cellula come envelope.
3. Introduzione del genoma virale
4. Sintesi, assemblaggio e maturazione delle proteine
5. Rilascio delle particelle virali

Esiti infezione virale nei procarioti

• Infezione permissiva: le cellule infettate consentono la replicazione e avviene il rilascio di particelle virali.
• Infezione abortiva: le cellule infettate non producono materiale virale; avviene in cellule che non hanno enzimi e particolari componenti necessarie alla replicazione del virus.
• Infezioni restrittive: le cellule producono solo pochi virus, il genoma virale persiste con un’infezione latente oppure, nel caso dei virus oncogeni, porta all’immortalizzazione cellulare e, dunque, la cellula infettata viene trasformata e viene sovvertito il ciclo vitale.

Classificazione virale

I sistemi di classificazione sono diversi. I principali sono:

1. Classificazione ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses): ha identificato circa 6500 specie virali, che si dividono poi a loro volta in sottogruppi, e chiaramente è in continuo aggiornamento.
2. Classificazione Baltimore: prende il nome dall’immunologo che la propose e si basa sulla polarità dei genomi virali. Questo sistema divide in 7 principali gruppi i virus:
   • DNA a doppio filamento: trascrivono l’mRNA partendo direttamente dal DNA del virus.
   • DNA a singolo filamento: devono sintetizzare prima il filamento complementare, così da comporre la doppia elica e, infine, si ha la formazione dell’mRNA.
   • RNA a doppio filamento positivo/negativo: il filamento negativo viene utilizzato come stampo per l’mRNA.
   • RNA a singolo filamento positivo: viene usato direttamente l’RNA come stampo per l’mRNA.
   • RNA a singolo filamento negativo: utilizzano anch’essi il proprio filamento come stampo.
   • RNA a singolo filamento dotato di trascrittasi inversa: il genoma viene prima retrotrascritto in DNA ed integrato nel genoma cellulare.
   • DNA a doppio filamento dotato di trascrittasi inversa: concetto uguale ai precedenti ma con il DNA.

Nel 2020 è stato dato un premio Nobel per la scoperta del virus dell’epatite C, appartenente ai virus con genoma virale a singolo filamento di RNA, importantissimo per la patologia umana dell’epatite C, la quale può causare tumori. Ha un genoma composto da una decina di kb ed il genoma sintetizza per un’unica singola poliproteina, che viene poi tagliata in più proteine, che costituiranno tutte le proteine utili. Ha un ciclo replicativo che inizia per endocitosi.

Un altro esempio è il Corona Virus, a RNA positivo, con un diametro di 80-160 nm. Ha un genoma di 27kb e sintetizza sette proteine. Il suo nome deriva dall'aspetto dei virioni che, grazie alle glicoproteine superficiali, assume la forma di una corona. Queste glicoproteine rendono il virus più affine ad infettare le vie respiratorie. Questa porzione è stata quella studiata per lo sviluppo di un vaccino.

Prioni

Prioni è l’acronimo di PRoteinaceous Infectious ONly particle. Sono di fatto proteine che fungono da agenti patogeni. Nel concreto sono proteine che assumono una forma diversa dalla proteina funzionale, una sorta di isomero, e che dunque, perdendo funzionalità, divengono patogeni. Sono estremamente resistenti e, a contatto con la forma sana della proteina, convertono quest’ultima in quella patogena. Sono responsabili di patologie rare, ma molto letali, principalmente del cervello. Prima della loro identificazione si pensava che le malattie di questo tipo fossero causate da virus.