Vettori per terapia genica, Tecnologie per terapia genica

2. VETTORI PER LA TERAPIA GENICA

La terapia genica consiste nell’introduzione di un transgene in una cellula allo scopo di correggere un

errore innato del metabolismo, fornire una nuova funzione cellulare o per neutralizzare il prodotto di

una cellula.

I vettori in terapia genica sono sia virali che non virali, tra quelli virali troviamo:

 Adenovirus

 Retrovirus

 Virus adeno-associati

 Lentivirus (derivati da HIV)

 Herpesvirus

Mentre tra i vettori non virali troviamo:

 Plasmidi nudi

 Elettroporazione in vivo

 Liposomi

 Amine, proteine cariche positivamente

I virus sono i più usati in quanto infettano facilmente le cellule, il vettore si ottiene modificando il virus di

partenza, ossia il wild-type.

La capacità di un vettore è la capienza nell’accogliere sequenze geniche, è maggiore negli adenovirus

rispetto agli adeno-associati.

ADENOVIRUS ’50

Gli adenovirus sono stati isolati nei primi anni da adenoidi umane ed appartengono alla famiglia degli

è la capienza nell’accogliere

Adenoviridae. Hanno un genoma di 36kb di DNA a doppio filamento (la capacità

sequenze geniche) ed infettano principalmente cellule post-mitotiche in tessuti altamente differenziati,

anche cellule quiescenti (hanno ampio spettro). Sono suddivisi in 3 generi diversi e 6 sottogruppi ognuno

dei quali ha diversi sierotipi, alcuni dei sierotipi causano tumorigenesi (A e B sono sottogruppi con poten-

ziale oncogenico). Gli adenovirus sono responsabili di raffreddore, influenza ed infezioni polmonari.

In terapia genica umana sono spesso usati i virus di sottogruppo C e sierogruppo 2 e 5 (C adeno 5) che

possono portare congiuntivite e raffreddore.

L’adenovirus ha un capside organizzato in esoni e pentoni con fibre deputate al riconoscimento recettoriale.

Il capside ha forma icosaedrica, quindi con 12 vertici ed è responsabile della tossicità. È formato da esoni

che danno architettura al capside mentre ai vertici sono posizionati i pentoni (che sono delle proteine) dai

quali protrudono le fibre (glicoproteine con porzione terminale sferica). I pentoni determinano un effetto

citopatico (cambiamenti morfologici di una cellula infettata da un virus) ma è la fibra il componente

più tossico ed è anche responsabile della risposta immunitaria. La fibra, alla sua estremità, possiede una

pallina, chiamata Knob che è responsabile della prima interazione tra il virus e la cellula bersaglio. Il

μ

DNA è contenuto nel core ed avvolto in proteine hyston like come V, VII e (mu). Sono presenti anche le

proteine cemento come le VIII associate alla base della struttura. Il capside protegge il genoma. Una parti-

cella adenovirale misura circa 80 nm, è quindi molto più piccola di un macrofago.

Quindi la struttura di un adenovirus è formata da un capside formato a sua volta da: esone, pentone, fibra, e

μ,

proteine VI, VIII, IX, IIIa; mentre il core è formato da proteine hyston like come TP, proteine V e VII e da

dsDNA di 36 Kb.

In uno schema linearizzato di dsDNA è possibile riconoscere due sequenze ITR (inverted terminal repeats)

ψ

che sono origini di replicazione. A destra di ITR è presente (psi) che rappresenta un segnale di im-

pacchettamento per impacchettare il genoma nel capside virale, E ed L (early e late) che sono geni della

Per creare il vettore bisogna rimuovere qualcosa del genoma dell’adenovirus in quanto

fase veloce e tardiva.

il genoma totale deve avere grandezze definite, alcune cose possono essere rimosse, altre no (le sequenze

ITR non possono essere rimosse).

Infezione adenovirale

L’entrata del virus nella cellula bersaglio è suddiviso in due interazioni:

 Nella prima interazione la porzione Knob della fibra interagisce con il recettore car della cellula

 Nella seconda interazione la regione RGD del pentone interagisce con alcune integrine di membrana

β α β

(α o )

5 3 5 5

L’entrata del virus nella cellula bersaglio dipende quindi dal recettore della cellula bersaglio stessa.

l’endocitosi mediata da clatrina.

Dopo la seconda interazione si verifica Questo è un meccanismo classico

di internalizzazione di C5 e C2. I sierotipi 2 e 5 ultimamente hanno sviluppato immunità nella popolazione

umana, quindi sono stati sviluppati altri virus.

Geni della fase early

I geni della fase early (o precoci) si possono eliminare e sono:

 E1A: che codifica per due proteine

o Stimolazione della cellula ospite ad entrare in fase S (stimolano la replicazione)

o Regolatore trascrizionale

 E1B: Fattore di trascrizione

 E2A: DNA-binding protein

 E2B: DNA polimerasi

 dell’ospite (7 proteine)

E3: Evasione dal sistema immunitario

 E4: metabolismo virale (6 proteine)

Le ITR servono invece per la replicazione del DNA che è indipendente dal suo impacchettamento in quanto

avviene dopo. Possono esserci da 10'000 a 100'000 copie di DNA virale per cellula.

Geni della fase late

La trascrizione dei geni della fase late (da L1 a L5) è attivata quando termina la trascrizione dei geni della fase

precoce e permettono la sintesi di tutte le strutture del capside. La cellula subisce cambiamenti morfologici

grazie ai geni della fase tardiva.

Il Major Late Promoter (MLP) è attenuato durante la fase early ed è attivo dopo la replicazione del DNA.

contribuiscono all’incapsidamento mediato dall’interazione con segnali di packaging

I geni della fase late

all’estremità sinistra, cambiamenti delle infrastrutture nucleari, permeabilizzazione della membrana nucleare,

disintegrazione della membrana plasmatica della cellula ospite.

UTILIZZI

I vettori adenovirali infettano cellule post-mitotiche di tessuti altamente differenziati, ed infettano so-

prattutto epatociti dopo somministrazione endovenosa. I vettori adenovirali possono essere preparati ad

12

alto titolo (10 units/ml) e possono contenere cassette di espressione di grosse dimensioni (fino a 36 Kb). Gli

è transiente e i livelli di espressione

adenovirus non integrano nel DNA della cellula ospite (l’espressione

sono più bassi, si evita mutagenesi inserzionale).

TIPI DI VETTORI ADENOVIRALI

I vettori adenovirali possono essere di vari tipi:

 Vettori adenovirali di prima generazione (FG-Ad)

 Vettori adenovirali di seconda generazione

 Vettori adenovirali helper-dependent

Vettori adenovirali di prima generazione

I vettori adenovirali di prima generazione portano delezioni delle regioni E1/E3 (o anche entrambi) al cui

posto vengono inseriti i transgeni.

Sono vettori RDA (replicant deficient adenovirus) ossia deficienti per la replicazione, anche se manca

un solo gene tra E1 ed E3 non sono capaci di replicare. La funzione di E1 è fornita dalle cellule HEK

(human embrional kidney, embrionali di rene umano) 239 (due nove tre) che sono cellule permissive (o di

packaging). Le HEK 293 sono linee cellulari non staminali immortalizzate per il gene E1, nel loro genoma

è quindi inserito il gene adenovirale E1 e lo esprimono costitutivamente. Il vettore quindi si replica nelle 293.

I vettori adenovirali di prima generazione hanno assenza di replicazione in vivo.

ΔE1

Nel vettore (mancante di E1), al posto di E1, è stato inserito il gene terapeutico mentre le cellule permis-

sive 293 esprimono la funzione mancante all’adenovirus. Se il vettore è mancante anche di E3 si usano deri-

vate delle 293 che esprimono costitutivamente E1 ed E3

Gli svantaggi di questi vettori sono che non si integrano nel genoma, hanno tutto del virus tranne E1 quindi

sono tossici, hanno bassa durata di espressione del transgene, alta tossicità epatica e limitata durata di espres-

sione. Inoltre questi vettori possono avere fenomeni di ricombinazione con le 293 tornando ad essere

wild-type (tramite ricombinazione omologa) diventando quindi RCA (replicant contenent adenovirus). RCA

non è più gestibile come vettore per terapia genica.

Per evitare la formazione di RCA si è passati alla seconda generazione dove son stati deleti più geni

delle fase precoce per abbassare la probabilità di formare RCA. Eventi di ricombinazioni sono statisticamente

più sfavoriti.

Vettori adenovirali di seconda generazione

I vettori adenovirali di seconda generazione, a differenza di quelli di prima generazione, hanno delezioni sia

nelle regioni E1/E3 sia nelle regioni E2 e/o E4. Eliminando più geni è sfavorito un evento di ricombinazione

che porta alla formazione di RCA. Le funzioni dei geni supplementari deleti (E2 e/o E4) si trovano nelle 293

derivate. Come i vettori di prima generazione anche questi non possono replicarsi in vivo (in assenza delle

cellule permissive) e si ha una perdita di contaminazione da RCA.

Gli svantaggi dei vettori adenovirali di seconda generazione sono bassi livelli di espressione in vivo, tossicità

C’è una bassa capacità sia nella prima che nella

epatica non ridotta e durata di espressione non migliorata.

seconda generazione. La tossicità è maggiore nella prima generazione e dai livelli di tossicità scaturiscono

livelli di espressione bassi. La tossicità immediata è dovuta alle proteine del capside. Sono utili nella terapia

ex-vivo in quanto il paziente non viene in contatto direttamente con i vettori.

Vettori adenovirali helper-dependent

Nella terza generazione si è pensato di creare un vettore di tipo helper-dependent i quali hanno deleto tutto

il genoma adenovirale tranne le due ITR che sono le origini di replicazione, quasi tutte le 36Kb sono state

eliminate. Non sono vettori capaci di replicare, in quanto son stati rimossi tutti i geni necessari alla replica-

zione, per potersi replicare hanno bisogno di vettori helper di prima generazione (quindi anche questi

sono vettori di tipo RDA). Rispetto ai vettori di prima e di seconda generazione sono più capienti. La rimo-

zione del virus helper avviene mediante il sistema Cre recombinasi.

In uno schema del DNA in forma linearizzata dell’adenovirus restano le due sequenze ITR (una a destra e

l’altra a sinistra) e il segnale ψ (psi) di packaging. Subito dopo questi elementi viene posizionato il DNA

stuffer che serve solo da riempimento e dà struttura allo scheletro per mantenere la dimensione minima di

impacchettamento, ed al centro sarà presente il gene terapeutico.