Vettori non virali, Tecnologie per terapia genica e cellulare

I vettori virali sfruttano le caratteristiche dei virus, il transgene è iperespresso grazie alla replicazione vi-

rale. È difficile pensare di introdurre forzatamente il DNA in qualcosa di non virale. Si deve infatti superare

la membrana plasmatica e le varie difese base della cellula. Bisogna anche tener conto della membrana nu-

cleare.

Il trasferimento genico in sistemi non virali prevede il precedente impacchettamento del DNA, successiva-

l'ingresso nella cellula, l’eventuale rilascio dalle vescicole lisosomiali, il trasporto nel nucleo e

mente ed

infine l’espressione del gene. Il DNA deve quindi essere protetto per facilitare l’endocitosi. La scelta del

vettore dipenderà dal tipo di applicazione.

Le barrire dei vettori non virali possono essere sia cellulari che extracellulari:

 Alle cellulari appartengono: membrana citoplasmatica, membrana nucleare, lisosomi ed endonucleasi

 Alle extracellulari appartengono: barriera ematoencefalica, sistema immunitario e fluidi corporei

PLASMIDI NUDI l’effi-

I plasmidi nudi devono avere forti promotori virali. Non sono vettori virali, quindi non sono tossici,

cienza è bassa perché la durata del transgene nel tempo è bassa. La somministrazione è locale, si nota

efficacia clinica solo quando sono necessarie basse dosi di transgene. I plasmidi nudi non sono incorporati

in un sistema virale, è il cDNA del transgene da esprimere.

Le applicazioni dei plasmidi nudi possono essere collegate a:

 Vaccini

 Espressione di molecole ad alta bioattività (ormoni)

 Terapia locale (tumori)

Precipitazione con fosfato di calcio

Protocollo eseguito nel 1973 da Graham e van der Eb che provarono ad introdurre il DNA tramite precipita-

zione con fosfato di calcio.

Il DNA viene mescolato ad una soluzione di CaCl e aggiunto ad una soluzione fisiologica contenente tam-

2

pone fosfato. Si forma quindi un precipitato formato da fosfato di calcio e DNA (il DNA deve essere impac-

chettato in qualcosa che lo difende) che viene messo in contatto con le cellule da transfettare. I precipitati sono

incorporati in alcune cellule per endocitosi.

Questa metodologia è semplice ma non applicabile in terapia genica in quanto, pur essendo un sistema eco-

efficienza bassa ed un’elevata citotossicità,

nomico, ha una non funziona con tutti i tipi cellulari (ad esempio

non funziona con i linfociti).

Per permettere alle cellule di incorporare il DNA si possono usare dei tensioattivi che alterano la membrana

può essere destabilizzata temporaneamente per permettere appunto l’ingresso del transgene.

plasmatica che

Sono sostanze di natura cationica, ma non hanno applicazioni in campo terapeutico in quanto sono molto

tossici.

Il primo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA in una cellula eucariotica è stato il destrano. È

un polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dieti-

DNA e mediare l’ingresso attraverso le membrane. Le cellule vengono

lamminoetile) è in grado di legare il

preparate mediante shock osmotico con glicerolo o DMSO e shock termico (portando la temperatura al di

sopra dei 37°C e circa ai 60-65°C) per pochi minuti. Ha lo svantaggio di poter essere usato solo per transfezioni

transienti, ma risulta comunque un metodo molto semplice.

METODI NON VIRALI

Attualmente ci sono tre metodi non virali:

 Metodi fisici

 Metodi chimici

 Metodi biochimici

Metodi fisici

 Pressione idrodinamica

 Metodo balistico

 Elettroporazione

Pressione idrodinamica

La pressione idrodinamica (idroporazione) è limitata ai modelli animali (topi per lo più). Si iniettano grossi

volumi di DNA di nostro interesse in modo rapido. Il sistema è ampiamente utilizzato per il gene delivery

(consegna) epatico, con alta efficienza anche il cellule muscolari e renali. Questo sistema ha quindi alta effi-

cienza di trasduzione a livello epatico. Nel modello murino si inietta il DNA nella vena caudale o cava della

DNA pari all’8-9%

coda per 5 secondi con un volume di del peso corporeo.

La somministrazione elevata porta cambi nella pressione venosa e nella funzione cardiaca. La funzione car-

diaca, dopo aver subito un’accelerazione, si stabilizza dopo un po’, la pressione venosa, dopo aver subito un

L’innalzamento del picco pressorio porta difetti nella membrana degli epatociti

picco, si stabilizza. con

formazione di pori di membrana che potrebbero spiegare il meccanismo di ingresso del DNA negli epa-

tociti.

Questo metodo è usato nel topo e nel ratto per esprimere proteine di valore terapeutico come fattori emofilici,

Questa tecnica non è applicabile all’uomo

antitripsine, citochine, fattori di crescita epatici, eritropoietina.

in quanto dovrebbero essere iniettati circa 7/8 litri di soluzione ad alta velocità, un volume di molte volte

superiore a quello che un uomo può tollerare.

L’idroporazione aumenta l’efficienza di espressione del transgene. Si parla di pseudoidrodinamica appli-

L’obiettivo è aumentare

cabile agli scimpanzé, con rilascio di helper-dependent. il delivery epatico. A li-

vello della vena cava inferiore epatica sono posti 2 cateteri portando uno scombussolamento del flusso con

aumento della pressione intraepatica. Si ha una destabilizzazione della membrana, dopo 30 minuti sono ri-

mossi i cateteri e sono somministrati HD-Ad con iniezione sistemica.

Metodi balistici

I metodi balistici consistono nella propulsione ad alta velocità di microparticelle rivestite di DNA, di solito

d’oro in un’ampia varietà di campioni biologici, dagli

o di tungsteno, organelli cellulari agli organi di mam-

L’efficienza dipende dai parametri fondamentali ossia

mifero in situ ed in vitro. si deve modulare la velocità,

è importante il rivestimento dei proiettili e bisogna accertarsi del numero di particelle che entrano nel tessuto.

μm

Le particelle hanno un diametro di 1-5 e sono sufficientemente piccole per attraversare la membrana

a 5 μg di DNA per mg d’oro.

cellulare senza creare danno misurabile e possono portare da 0,5

Il sistema della camera a vuoto accelera i microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio

posto in una camera sottovuoto.

Lo gene gun è un bombardamento con particelle d’oro o di tungsteno su cui è stato adsorbito il DNA. Lo

sparo è ottenuto con un’onda supersonica di elio all’interno della cartuccia, proietta fuori il

che passando

contenuto. Il DNA deve essere quindi proiettato e lo sparo si effettua localmente quando si vuole transfettare

una determinata zona.

Applicazioni

Il gene gun è utilizzato soprattutto nel trattamento del cancro (tumori accessibili, solidi), inserendo geni co-

vicino al sito del tumore per aumentare la risposta immune dell’organismo.

dificanti citochine

Altre applicazioni sono immunomodulazione e vaccinazioni a DNA.

Elettroporazione

L’elettroporazione consiste nell’applicazione di un campo elettrico per indurre una riorganizzazione

che consente l’introduzione del

strutturale transiente di una parte localizzata della membrana cellulare

Consiste quindi nell’applicazione di un

DNA. voltaggio alla cellula al fine di destabilizzare la membrana.

è direttamente sull’uomo dove è importante l’intensità di voltaggio,

Come tecnica nasce in vitro, quella in vivo

configurazione dell’elettrodo, il sito di rilascio. Questi parametri vanno valutati per ogni

la applicazione. È

necessario utilizzare un determinato range di voltaggio per evitare la distruzione della cellula.

Ci sono vari tipi di elettrodi: invasivi e non invasivi. Per quelli invasivi ci sono strumenti aghiformi che

entrano nel tessuto. I tessuti più accessibili son pelle e muscoli.

Gli elettrodi non invasivi sono a placche o a serpentina.

Esperimento in vivo

Nel muscolo tibiale di topo viene iniettato il DNA plasmidico contenente il gene per IL-5. Viene applicato un

range di voltaggio, ci sono vari gruppi sperimentali (ognuno costituito da minimo 5 topi). Dopo il voltaggio è

giorni dopo, l’espressione sierica di IL-5

somministrato con IL-5. Si è visto, per valutare il voltaggio ottimale

c’è la massima espressione sia tardiva che precoce

che dà livelli di transgene elevati e si è notato che a 100 volt

che l’espressione permane per oltre le 2 settimane. Con un voltaggio fissato si valuta se l’espressione

e di IL-5

è duratura (si valuta il time course). Per il time course si ha un solo gruppo sperimentale e gli animali non

vengono sacrificati.

Limiti dell’elettroporazione di distanza tra un elettrodo e l’altro, questo rende complicato

Il range efficace è di circa 1 cm transfettare zone

di tessuto estese, sono necessarie operazioni chirurgiche per inserire gli elettrodi in profondità in organi interni,

gli alti voltaggi possono causare danno tissutale irreversibile oltre ad influenzare la stabilità del DNA (a causa

dell’innalzamento della temperatura), l’influsso di Ca 2+ dovuto alla distruzione della membrana cellulare po-

trebbe indurre l’attivazione delle proteasi mediata da con conseguente danno tissutale. È necessaria un’ot-

2+

Ca

timizzazione di questa tecnica.

Metodi chimici

 Liposomi cationici

 Policationi come DEAE dextrano

 Complessi di polilisina

I liposomi inglobano il DNA formando strutture unicellulari ma hanno problemi di stabilità sia in vivo sia

in fase di preparazione/conservazione in quanto sono facilmente permeabili ai mezzi biologici e facilmente

riconosciuti e fagocitati dal sistema del reticolo endoteliale (il reticolo endoteliale fa parte del sistema immu-

nitario, è fatto da macrofagi, cellule di Kupffer e cellule reticolari). La presenza di PEG può marcare i lipo-

somi.

Per aumentare la stabilità in vivo dei liposomi è possibile aggiungere ai fosfolipidi naturali: colesterolo o

lipidi a catena alchilica lunga e satura che stabilizzano il doppio strato riducendo la possibilità di attacco da

parte delle lipoproteine ad alta densità. In questo modo c’è minore possibilità di adsorbimento da parte delle

L’assenza di

opsonine e quindi del riconoscimento delle cellule del SRE (sistema del reticolo endoteliale).

carica superficiale diminuisce la capacità di interazione con le cellule del SRE, la presenza di carica positiva

(talvolta anche negativa) facilita la cattura da parte dei macrofagi; liposomi superiori ai 200 nm sono più

facilmente riconosciuti e catturati dai macrofagi, liposomi inferiori ai 100 nm risultano stabili in vivo.

La stabilità dei liposomi dipende quindi dalla composizione del