Vettori non virali, Tecnologie per terapia genica e cellulare

Vettori non virali

I vettori virali sfruttano le caratteristiche dei virus, il transgene è iperespresso grazie alla replicazione virale. È difficile pensare di introdurre forzatamente il DNA in qualcosa di non virale. Si deve infatti superare la membrana plasmatica e le varie difese base della cellula. Bisogna anche tener conto della membrana nucleare.

Il trasferimento genico in sistemi non virali prevede il precedente impacchettamento del DNA, successivamente l'ingresso nella cellula, l’eventuale rilascio dalle vescicole lisosomiali, il trasporto nel nucleo ed infine l’espressione del gene. Il DNA deve quindi essere protetto per facilitare l’endocitosi. La scelta del vettore dipenderà dal tipo di applicazione.

Barriere dei vettori non virali

Le barriere dei vettori non virali possono essere sia cellulari che extracellulari:

• Alle cellulari appartengono: membrana citoplasmatica, membrana nucleare, lisosomi ed endonucleasi
• Alle extracellulari appartengono: barriera ematoencefalica, sistema immunitario e fluidi corporei

Plasmidi nudi

I plasmidi nudi devono avere forti promotori virali. Non sono vettori virali, quindi non sono tossici, l’efficienza è bassa perché la durata del transgene nel tempo è bassa. La somministrazione è locale, si nota efficacia clinica solo quando sono necessarie basse dosi di transgene. I plasmidi nudi non sono incorporati in un sistema virale, è il cDNA del transgene da esprimere.

Le applicazioni dei plasmidi nudi possono essere collegate a:

• Vaccini
• Espressione di molecole ad alta bioattività (ormoni)
• Terapia locale (tumori)

Precipitazione con fosfato di calcio

Protocollo eseguito nel 1973 da Graham e van der Eb che provarono ad introdurre il DNA tramite precipitazione con fosfato di calcio. Il DNA viene mescolato ad una soluzione di CaCl₂ e aggiunto ad una soluzione fisiologica contenente tampone fosfato. Si forma quindi un precipitato formato da fosfato di calcio e DNA (il DNA deve essere impacchettato in qualcosa che lo difende) che viene messo in contatto con le cellule da transfettare. I precipitati sono incorporati in alcune cellule per endocitosi.

Questa metodologia è semplice ma non applicabile in terapia genica in quanto, pur essendo un sistema economico, ha una bassa efficienza ed un’elevata citotossicità, non funziona con tutti i tipi cellulari (ad esempio non funziona con i linfociti).

Uso di tensioattivi

Per permettere alle cellule di incorporare il DNA si possono usare dei tensioattivi che alterano la membrana plasmatica che può essere destabilizzata temporaneamente per permettere appunto l’ingresso del transgene. Sono sostanze di natura cationica, ma non hanno applicazioni in campo terapeutico in quanto sono molto tossici.

Destrano

Il primo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA in una cellula eucariotica è stato il destrano. È un polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e mediare l’ingresso attraverso le membrane. Le cellule vengono preparate mediante shock osmotico con glicerolo o DMSO e shock termico (portando la temperatura al di sopra dei 37°C e circa ai 60-65°C) per pochi minuti. Ha lo svantaggio di poter essere usato solo per transfettazioni transienti, ma risulta comunque un metodo molto semplice.

Metodi non virali

Attualmente ci sono tre metodi non virali:

• Metodi fisici
• Metodi chimici
• Metodi biochimici