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Estratto del documento

ANALISI QUANTITATIVA CULTURE DEPENDENT

Nel momento in cui si parte con un’analisi quantitativa il primo step è quello di fare una

preparazione del campione, sia nel caso in cui si parli di campione solido che di campione liquido

(differente tra campione solido e liquido). La seconda fase è quella di diluire il campione, e

definire quali diluizioni effettuare per arrivare ad un carico microbico contabile in piastra (massimo

200 UFC in una piastra da 90): è possibile alla fine dell’analisi microbiologica determinare quante

colonie sono presenti nella piastra per risalire al numero di cellule iniziali. Il terzo step è quello di

scelta del terreno e l’inoculo dell’aliquota di campione nel mezzo agarizzato appropriato; si va ad

incubare la piastra in modo tale da far crescere le cellule lasciando il tempo per formare le colonie

alle opportune condizioni di crescita. L’ultimo step è quello di quantificazione delle colonie.

Ci sono dei fattori che vanno tenuti in considerazione, ovvero una analisi quantitativa può essere

come descritta, ma anche analisi effettuate attraverso procedure di arricchimento per determinare

la carica microbica di patogeni: in questo caso non si determinano le colonie ma l’assenza o la

presenza di un patogeno in un alimento (es: assenza di Listeria in 25g di alimento). La tipologia

del dato più frequente è il numero di UFC per mL o grammo di campione, ma anche un dato

quantitativo può essere presenza o assenza di patogeni in una aliquota di campione. Anche il

metodo di preparazione del campione deve essere tenuto in considerazione, a seconda che si

parli di campione liquido (dove è possibile analizzare una aliquota del tal quale) o solido dove si

ha la necessità di almeno una diluizione: si hanno poi protocolli specifici per campioni bifasici o

per alimenti specifici. Il metodo di analisi è differente a seconda della tipologia che si vuole

ottenere: il metodo delle diluizioni viene effettuato quando si vuole andare a fare una analisi

quantitativa contando il numero di UFC, mentre il metodo di arricchimento del terreno viene

solitamente fatto per andare a valutare la presenza o l’assenza del patogeno nell’alimento. In

funzione del terreno che si utilizza si possono ricercare microflore diverse: si utilizzano terreni

generici per la ricerca di gruppi di microorganismi, oppure elettivi, selettivi o differenziali che

permettono in modo specifico di ricercare microorganismi appartenenti a particolari generi

microbici restringendo l’analisi al genere o famiglia.

Enrico Masotto 10

TECNICHE MICROBIOLOGICHE

Tipologia di dato

Il dato può essere espresso in due modi differenti, e richiede metodiche analitiche a loro volta

differenti:

DATO QUANTITATIVO ESPRESSO IN UFC/g O Log O UFC/mL: dalle colonie attraverso la

• formula della media pesata si risale al quantitativo presente e si esprime il dato in UFC/g. Il

numero delle unità formanti colonie nel campione in esame viene riferito all’unità di peso (UFC/

g) o di volume (UFC/mL) e viene dedotto dal calcolo combinato del numero delle colonie

isolate e contabili presenti in una determinata piastra:

∑c è la somma di tutte le colonie contate in tutte le piastre contabili. Na è il numero di piastre

della prima diluizione contabile (analisi in singolo, doppio, triplo, …), nb è il numero delle piastre

della seconda diluizione contabile e d è il fattore della prima diluizione contabile. Qui viene

riportato un esempio di calcolo:

PRESENZA/ASSENZA: non viene fornito un dato quantitativo. Nel caso di microorganismi

• presenti in piccole quantità (es: patogeni) occorre arricchire, ovvero facilitare la loro

moltiplicazione prima di andare a valutarne la loro presenza/assenza.

Enrico Masotto 11

TECNICHE MICROBIOLOGICHE

Un esempio molto semplice è riferibile al Regolamento (CE) per i criteri microbiologici 2073/2005:

In questo caso si intende per “n” il numero di unità campionarie (es: 10 campioni analizzati per un

solo lotto), per “c” il numero di questi campioni per i quali è consentito superare il limite inferiore

(m) o essere compreso tra M (limite superiore) ed m (limite inferiore). In questi esempi descritti c è

sempre 0 perchè i limiti da regolamento sono molto restrittivi.

Occorre, tuttavia, chiarire la sensibilità del metodo culture dependent, ovvero:

Se non ho nessuna colonia in piastra, come esprimo il risultato?

esempio: “determinazione della carica microbica totale CMT” in latte in polvere. Secondo la G.U.

13/10/1978 i requisiti in CMT di un latte in polvere (UFC/g di polvere che viene ricostituita 1:10)

sono ≤ 10 . Si decide di allestire quindi le diluizioni dalla -3 alla -5. Dopo incubazione si vede che

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in nessuna piastra delle tre diluizioni si hanno colonie (ovvero non è stato individuato un range di

diluizioni appropriato). Si definisce, in questo modo, che la CMT del latte in polvere è inferiore al

10 UFC/g.

3

Qual è la concentrazione limite che posso determinare?

Dipende dal tipo di campione (solido/liquido) e dal tipo di semina impiegato (inclusione/

spatolamento). Il tipo di campione può essere:

- SOLIDO: deve essere sempre omogeneizzato quindi deve essere diluito affinché le cellule

microbiche possano essere estratte dalla matrice solida e trasferirsi nella fase acquosa

(diluente). Solitamente si effettua mediante uno “stomacher”. Si passa sempre da una

diluizione 1:10, non è possibile analizzare il campione tal quale.

- LIQUIDO: può essere analizzato tal quale, ovvero un’aliquota del campione può essere

trasferita in piastra direttamente (inglobamento).

Enrico Masotto 12

TECNICHE MICROBIOLOGICHE

Preparazione del campione

Dipende, quindi, dal tipo di campione (solido/liquido) e dal tipo di semina impiegato (inclusione/

spatolamento).

INCLUSIONE O TECNICA DELLO

INGLOBAMENTO SPATOLAMENTO

In questo caso per ogni diluizione In questo caso, non si preleva 1mL di

apprezzabile si preleva 1mL della diluzione diluizione, ma 1 microlitro (0,1mL).

stessa, lo si inocula in una piastra e si L’aliquota, quindi, viene spatolata su

inserisce terreno liquido sterile. Una volte terreno agarizzato sterile già solidificato.

inoculato anche il terreno, si agita la piastra In questo caso, occorre quindi contare

con un movimento circolare ad 8. Occorre sempre una diluizione aggiuntiva, che si

quindi definire successivamente la soluzione ottiene prelevando non 1mL ma un

corrispondente alla piastra che si va a microlitro. Se, quindi, si preleva il

contare per inserirla nella formula della microlitro dalla diluizione -3, la piastra

media pesata. corrispondente in cui si ha lo

spatolamento sarà la -4.

Enrico Masotto 13

TECNICHE MICROBIOLOGICHE

CAMPIONE ALIMENTARE SOLIDO

Deve essere sempre omogeneizzato, ovvero a contatto con una soluzione diluente. Viene messo

in stomacher (omogeneizzatore peristaltico a pale). L’azione meccanica permette il passaggio dei

microorganismi nel diluente. Vengono pesati 10g di campione, diluiti 1:10. Non è possibile

analizzare il campione tal quale.

Il numero minimo di m.o. teoricamente rilevabili nel caso dell’analisi microbiologica di un

campione alimentare solido è pari a 10UFC/g con la tecnica per INCLUSIONE, in quanto il

campione è solido e si parte quindi sempre dalla diluizione -1 (la diluizione più bassa piastrabile è

la -1). Se l’alimento (campione solido) contiene meno di 10 cellule, queste, per effetto della

diluizione del campione non possono essere rilevate. Se il campione presenta almeno 10 cellule,

una cellula sarà presente nella prima diluizione del campione (1/10), e una volta che essa è

deposta nel substrato nutritivo, darà origine, dopo crescita alla temperatura ottimale di

incubazione ad una colonia visibile e quindi contabile. Tenendo contro della diluizione, il numero

di UFC/g sarà pari a 10.

Il numero minimo di m.o. teoricamente rilevabili nel caso dell’analisi microbiologica di un

campione alimentare solido è pari a 100UFC/g con la tecnica per SPATOLAMENTO. Poichè il

campione è solido si parte sempre dalla diluzione -1 (la diluizione più bassa piastrabile è la -1) ma

in quantità che viene piastra è 0,1mL, la decima parte quindi riuscirò a rilevare solo la quantità

uguale o maggiore a 100 cellule presenti nel campione iniziale (per poter vedere una colonia alla

-2).

CAMPIONE ALIMENTARE LIQUIDO

Possono essere analizzati tal quali, una aliquota del campione può essere trasferita in piastra

direttamente (inglobamento) o diluita 1:10 e trasferita (0,1mL) in piastra (per spatolamento).

Il numero di microorganismi teoricamente rilevabili nel caso dell’analisi microbiologica di un

campione alimentare liquido è pari a:

- 1 UFC/mL con la tecnica per INCLUSIONE;

- 10 UFC/mL con la tecnica per SPATOLAMENTO.

Infatti con entrambe le due tecniche di conteggio essendo il campione liquido posso utilizzare il

tal quale per le piastre.

Vi sono poi metodiche specifiche per

l’analisi di matrici complesse, come le

matrici bifasiche e specifici protocolli

di preparazione dei campioni in caso

di analisi specifiche (ad esempio

dettate dai regolamenti).

Esempi:

BURRO (protocollo di

campionamento secondo le norme

FIL IDF 122C:1996

Enrico Masotto 14

TECNICHE MICROBIOLOGICHE

GELATO

Metodo di analisi

La creazione di condizioni favorevoli ad un solo organismo o gruppo di organismi è noto come

ARRICCHIMENTO. Viene effettuato quando la concentrazione delle specie da ricercare è bassa

(meno di 100-500 cellule per grammo). L’arricchimento è possibile ottenerlo mediante due

tecniche:

Formulando substrati nutritivi (liquidi e solidi) in grado di migliorare la crescita di uno o un

• gruppo di microorganismi; se selettivo sono presenti antibiotici e coloranti a cui il

microorganismo da ricercare è resistente;

Selezionando condizioni di incubazione ad esso/essi favorevoli (temperatura, atmosfera, tempo).

Esempio: RICERCA DI SALMONELLA NEGLI ALIMENTI

La ricerca delle Salmonelle negli alimenti non è mai una conta, ma una valutazione di PRESENZA/

ASSENZA in una stabilita quantità di alimenti (25g o mL), e si basa su procedure di arricchimento.

Il metodo classico (Gazzetta Ufficiale 346 del 13/12/1978) consta di quattro fasi:

1. Fase di prearricchimento: 37°C per 24 ore, si effettua o in acqua peptonata tamponata a pH7,

latte scremato sterile più verde brillante 0,02% per il cacao e derivati.

2. Fase di arricchimento selettivo: a 42°C per 18-24 ore, si fa un trasferimento di 1 o 0,1mL di

prearricchimento in uno o più bordi contenenti sostanze selettive

Dettagli
Publisher
A.A. 2019-2020
86 pagine
SSD Scienze agrarie e veterinarie AGR/16 Microbiologia agraria

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher enrico.97 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Tecniche microbiologiche e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli Studi di Parma o del prof Lazzi Camilla.