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ANALISI QUANTITATIVA CULTURE DEPENDENT
Nel momento in cui si parte con un’analisi quantitativa il primo step è quello di fare una
preparazione del campione, sia nel caso in cui si parli di campione solido che di campione liquido
(differente tra campione solido e liquido). La seconda fase è quella di diluire il campione, e
definire quali diluizioni effettuare per arrivare ad un carico microbico contabile in piastra (massimo
200 UFC in una piastra da 90): è possibile alla fine dell’analisi microbiologica determinare quante
colonie sono presenti nella piastra per risalire al numero di cellule iniziali. Il terzo step è quello di
scelta del terreno e l’inoculo dell’aliquota di campione nel mezzo agarizzato appropriato; si va ad
incubare la piastra in modo tale da far crescere le cellule lasciando il tempo per formare le colonie
alle opportune condizioni di crescita. L’ultimo step è quello di quantificazione delle colonie.
Ci sono dei fattori che vanno tenuti in considerazione, ovvero una analisi quantitativa può essere
come descritta, ma anche analisi effettuate attraverso procedure di arricchimento per determinare
la carica microbica di patogeni: in questo caso non si determinano le colonie ma l’assenza o la
presenza di un patogeno in un alimento (es: assenza di Listeria in 25g di alimento). La tipologia
del dato più frequente è il numero di UFC per mL o grammo di campione, ma anche un dato
quantitativo può essere presenza o assenza di patogeni in una aliquota di campione. Anche il
metodo di preparazione del campione deve essere tenuto in considerazione, a seconda che si
parli di campione liquido (dove è possibile analizzare una aliquota del tal quale) o solido dove si
ha la necessità di almeno una diluizione: si hanno poi protocolli specifici per campioni bifasici o
per alimenti specifici. Il metodo di analisi è differente a seconda della tipologia che si vuole
ottenere: il metodo delle diluizioni viene effettuato quando si vuole andare a fare una analisi
quantitativa contando il numero di UFC, mentre il metodo di arricchimento del terreno viene
solitamente fatto per andare a valutare la presenza o l’assenza del patogeno nell’alimento. In
funzione del terreno che si utilizza si possono ricercare microflore diverse: si utilizzano terreni
generici per la ricerca di gruppi di microorganismi, oppure elettivi, selettivi o differenziali che
permettono in modo specifico di ricercare microorganismi appartenenti a particolari generi
microbici restringendo l’analisi al genere o famiglia.
Enrico Masotto 10
TECNICHE MICROBIOLOGICHE
Tipologia di dato
Il dato può essere espresso in due modi differenti, e richiede metodiche analitiche a loro volta
differenti:
DATO QUANTITATIVO ESPRESSO IN UFC/g O Log O UFC/mL: dalle colonie attraverso la
• formula della media pesata si risale al quantitativo presente e si esprime il dato in UFC/g. Il
numero delle unità formanti colonie nel campione in esame viene riferito all’unità di peso (UFC/
g) o di volume (UFC/mL) e viene dedotto dal calcolo combinato del numero delle colonie
isolate e contabili presenti in una determinata piastra:
∑c è la somma di tutte le colonie contate in tutte le piastre contabili. Na è il numero di piastre
della prima diluizione contabile (analisi in singolo, doppio, triplo, …), nb è il numero delle piastre
della seconda diluizione contabile e d è il fattore della prima diluizione contabile. Qui viene
riportato un esempio di calcolo:
PRESENZA/ASSENZA: non viene fornito un dato quantitativo. Nel caso di microorganismi
• presenti in piccole quantità (es: patogeni) occorre arricchire, ovvero facilitare la loro
moltiplicazione prima di andare a valutarne la loro presenza/assenza.
Enrico Masotto 11
TECNICHE MICROBIOLOGICHE
Un esempio molto semplice è riferibile al Regolamento (CE) per i criteri microbiologici 2073/2005:
In questo caso si intende per “n” il numero di unità campionarie (es: 10 campioni analizzati per un
solo lotto), per “c” il numero di questi campioni per i quali è consentito superare il limite inferiore
(m) o essere compreso tra M (limite superiore) ed m (limite inferiore). In questi esempi descritti c è
sempre 0 perchè i limiti da regolamento sono molto restrittivi.
Occorre, tuttavia, chiarire la sensibilità del metodo culture dependent, ovvero:
Se non ho nessuna colonia in piastra, come esprimo il risultato?
•
esempio: “determinazione della carica microbica totale CMT” in latte in polvere. Secondo la G.U.
13/10/1978 i requisiti in CMT di un latte in polvere (UFC/g di polvere che viene ricostituita 1:10)
sono ≤ 10 . Si decide di allestire quindi le diluizioni dalla -3 alla -5. Dopo incubazione si vede che
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in nessuna piastra delle tre diluizioni si hanno colonie (ovvero non è stato individuato un range di
diluizioni appropriato). Si definisce, in questo modo, che la CMT del latte in polvere è inferiore al
10 UFC/g.
3
Qual è la concentrazione limite che posso determinare?
•
Dipende dal tipo di campione (solido/liquido) e dal tipo di semina impiegato (inclusione/
spatolamento). Il tipo di campione può essere:
- SOLIDO: deve essere sempre omogeneizzato quindi deve essere diluito affinché le cellule
microbiche possano essere estratte dalla matrice solida e trasferirsi nella fase acquosa
(diluente). Solitamente si effettua mediante uno “stomacher”. Si passa sempre da una
diluizione 1:10, non è possibile analizzare il campione tal quale.
- LIQUIDO: può essere analizzato tal quale, ovvero un’aliquota del campione può essere
trasferita in piastra direttamente (inglobamento).
Enrico Masotto 12
TECNICHE MICROBIOLOGICHE
Preparazione del campione
Dipende, quindi, dal tipo di campione (solido/liquido) e dal tipo di semina impiegato (inclusione/
spatolamento).
INCLUSIONE O TECNICA DELLO
INGLOBAMENTO SPATOLAMENTO
In questo caso per ogni diluizione In questo caso, non si preleva 1mL di
apprezzabile si preleva 1mL della diluzione diluizione, ma 1 microlitro (0,1mL).
stessa, lo si inocula in una piastra e si L’aliquota, quindi, viene spatolata su
inserisce terreno liquido sterile. Una volte terreno agarizzato sterile già solidificato.
inoculato anche il terreno, si agita la piastra In questo caso, occorre quindi contare
con un movimento circolare ad 8. Occorre sempre una diluizione aggiuntiva, che si
quindi definire successivamente la soluzione ottiene prelevando non 1mL ma un
corrispondente alla piastra che si va a microlitro. Se, quindi, si preleva il
contare per inserirla nella formula della microlitro dalla diluizione -3, la piastra
media pesata. corrispondente in cui si ha lo
spatolamento sarà la -4.
Enrico Masotto 13
TECNICHE MICROBIOLOGICHE
CAMPIONE ALIMENTARE SOLIDO
Deve essere sempre omogeneizzato, ovvero a contatto con una soluzione diluente. Viene messo
in stomacher (omogeneizzatore peristaltico a pale). L’azione meccanica permette il passaggio dei
microorganismi nel diluente. Vengono pesati 10g di campione, diluiti 1:10. Non è possibile
analizzare il campione tal quale.
Il numero minimo di m.o. teoricamente rilevabili nel caso dell’analisi microbiologica di un
campione alimentare solido è pari a 10UFC/g con la tecnica per INCLUSIONE, in quanto il
campione è solido e si parte quindi sempre dalla diluizione -1 (la diluizione più bassa piastrabile è
la -1). Se l’alimento (campione solido) contiene meno di 10 cellule, queste, per effetto della
diluizione del campione non possono essere rilevate. Se il campione presenta almeno 10 cellule,
una cellula sarà presente nella prima diluizione del campione (1/10), e una volta che essa è
deposta nel substrato nutritivo, darà origine, dopo crescita alla temperatura ottimale di
incubazione ad una colonia visibile e quindi contabile. Tenendo contro della diluizione, il numero
di UFC/g sarà pari a 10.
Il numero minimo di m.o. teoricamente rilevabili nel caso dell’analisi microbiologica di un
campione alimentare solido è pari a 100UFC/g con la tecnica per SPATOLAMENTO. Poichè il
campione è solido si parte sempre dalla diluzione -1 (la diluizione più bassa piastrabile è la -1) ma
in quantità che viene piastra è 0,1mL, la decima parte quindi riuscirò a rilevare solo la quantità
uguale o maggiore a 100 cellule presenti nel campione iniziale (per poter vedere una colonia alla
-2).
CAMPIONE ALIMENTARE LIQUIDO
Possono essere analizzati tal quali, una aliquota del campione può essere trasferita in piastra
direttamente (inglobamento) o diluita 1:10 e trasferita (0,1mL) in piastra (per spatolamento).
Il numero di microorganismi teoricamente rilevabili nel caso dell’analisi microbiologica di un
campione alimentare liquido è pari a:
- 1 UFC/mL con la tecnica per INCLUSIONE;
- 10 UFC/mL con la tecnica per SPATOLAMENTO.
Infatti con entrambe le due tecniche di conteggio essendo il campione liquido posso utilizzare il
tal quale per le piastre.
Vi sono poi metodiche specifiche per
l’analisi di matrici complesse, come le
matrici bifasiche e specifici protocolli
di preparazione dei campioni in caso
di analisi specifiche (ad esempio
dettate dai regolamenti).
Esempi:
BURRO (protocollo di
campionamento secondo le norme
FIL IDF 122C:1996
Enrico Masotto 14
TECNICHE MICROBIOLOGICHE
GELATO
Metodo di analisi
La creazione di condizioni favorevoli ad un solo organismo o gruppo di organismi è noto come
ARRICCHIMENTO. Viene effettuato quando la concentrazione delle specie da ricercare è bassa
(meno di 100-500 cellule per grammo). L’arricchimento è possibile ottenerlo mediante due
tecniche:
Formulando substrati nutritivi (liquidi e solidi) in grado di migliorare la crescita di uno o un
• gruppo di microorganismi; se selettivo sono presenti antibiotici e coloranti a cui il
microorganismo da ricercare è resistente;
Selezionando condizioni di incubazione ad esso/essi favorevoli (temperatura, atmosfera, tempo).
•
Esempio: RICERCA DI SALMONELLA NEGLI ALIMENTI
La ricerca delle Salmonelle negli alimenti non è mai una conta, ma una valutazione di PRESENZA/
ASSENZA in una stabilita quantità di alimenti (25g o mL), e si basa su procedure di arricchimento.
Il metodo classico (Gazzetta Ufficiale 346 del 13/12/1978) consta di quattro fasi:
1. Fase di prearricchimento: 37°C per 24 ore, si effettua o in acqua peptonata tamponata a pH7,
latte scremato sterile più verde brillante 0,02% per il cacao e derivati.
2. Fase di arricchimento selettivo: a 42°C per 18-24 ore, si fa un trasferimento di 1 o 0,1mL di
prearricchimento in uno o più bordi contenenti sostanze selettive