Tecniche microbiologiche - Appunti
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non dannosi, presenti
nelle materie prime,
dove non
autoctoni contribuiscono
all’ottenimento e/o
conservazione del
prodotto finito
non dannosi ma in grado di
causare, se presenti in alto
numero, alterazioni alteranti
organolettiche, incidendo
sulla conservabilità del
prodotto
(Pseudomonadaceae,
micrococchi, lieviti, muffe)
non patogeni, ma ma con lo
stesso habitat e caratteristiche
indici di dei patogeni
contaminazione (più numerosi e più facilmente
rilevabili: stafilococchi,
Escherichia
coliformi fecali
coli
)
Sicurezza microrganismi negativi
patogeni
Salmonella spp. Staphylococcus aureus
Shigella spp. Bacillus cereus
Listeria
monocytogenes Clostridium botyulinum
E. coli
enteropatogeno Produzione di
Vibrio cholereae tossine
nell’alimento o
nell’organismo
Presenza
nell’alimento o (carica)
nell’organismo
(carica e
suscettibilità
dell’ospite)
Identificazione dei microrganismi
Isolamento da matrici complesse
*Terreno complesso
*Terreno selettivo
*Terreno di arricchimento
*Condizioni colturali
Mantenimento in coltura coltura pura
Studio
*Conta totale
*Conta selettiva
*Riconoscimento In quale ordine disporre le
FENOTIPO tessere del puzzle
HABITAT ?
FILOGENESI
GENOTIPO INNOVATIVO
TRADIZIONALE
1. Habitat 1. Habitat
2. Fenotipo 2. Filogenesi
3. Genotipo 3. Genotipo
4. Fenotipo
Criteri di identificazione tradizionale
Fenotipo Macromorfologia
Micromorfologia
Reazione di Gram
Metabolismo energetico
Esigenze nutrizionali
Esigenze colturali
Pattern enzimatico
Caratteristiche
strutturali
Genotipo Omologia
DNA/DNA
La specie batterica
Insieme di ceppi isolati in
habitat diversi ed in tempi
diversi che posseggono:
•una elevata similarità
fenotipica, con almeno una
proprietà distintiva nei confronti
delle altre specie
•una elevata omologia genetica
(riassociazione molecolare
DNA/DNA >70%)
•una elevata omologia
filogenetica (omologia di
sequenza del gene codificante
per rRNA 16S >98%)
Per ogni specie batterica descritta
esiste un ceppo di riferimento o ceppo
type, mantenuto in collezioni
internazionali
Criteri di identificazione innovativa
Impiego di tecniche di
indagine genetica, basate
sulla possibilità di PCR
amplificare in breve (Polymerase
tempo, regioni specifiche chain reaction)
del cromosoma batterico
Studi filogenetici e genetici
Appartenenza alla specie in
tempi ridotti ed in modo
specifico, anche per un numero
elevato di isolati da
identificare
Le caratteristiche fenotipiche vengono
studiate in un secondo tempo, solo sugli
isolati di interesse, per permetterne il
riconoscimento a livello di biotipo
DNA
Il codice genetico 64 possibili triplette
Codone AA Codone AA
UUU Fenilalanin ACU Treonina
a
UUC Fenilalanin ACC Treonina
a
UCU Serina ACG Treonina
UCC Serina ACA Treonina
UCG Serina GGU Glicina
UCA Serina GGC Glicina
CCU Prolina GGG Glicina
CCC Prolina GGA Glicina
CCG Prolina CAU Istidina
CCA Prolina CAC Istidina
Alcuni AA sono specificati da più di un codone DEGENERAZIONE DEL CODICE
GENETICO per minimizzare gli
effetti delle mutazioni
C
TC CA
TA
TT T AA
T
TA AC
TA TC
CG G CG
AG GG
T TA
GT
TA AC
INIZIO ATG GTG TTG CTG
STOP TAA TAG TGA
Promotore della trascrizione
GENE OPERONE
Schema di lettura aperto: Open Reading Frame
ORF
gene proteina
Operone ribosomale
PROMOTORE Ribosomal Binding
Site = RBS
GAGG
AAGG
GGA
GGAG
AGGA
Come possiamo sfruttare in laboratorio le
conoscenze sul DNA?
Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche
1° Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica
2°
3° Visualizzazione per via elettroforetica
Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione
4° molecolare DNA/DNA
5° Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma
Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione
6° dello studio molecolare delle porzioni amplificate
Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche
1°
Raccolta e lavaggio delle cellule
Risospensione in tampone + saccarosio (6%)
Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per
30 min)
Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%
Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi:
fenolo, CHF/isoamilico
Centrifugazione e raccolta del surnatante
Fase acquosa contenente il DNA Interfase
Solvente
Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante
Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi
Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH
Scioglimento del DNA in tampone
Quantificazione
2° Il DNA ha un massimo di
assorbimento a 260 nm
1 OD = 50 µg/ml
260nm
3° Visualizzazione per via
elettroforetica
una molecola carica posta all’interno di un
¾
campo elettrico migra in direzione del polo di
carica opposta
in un gel costituito da un polimero organico
¾
molecole di dimensioni diverse (ma di uguale
carica) migrano con velocità diverse, perché le
molecole di dimensioni maggiori incontrano
maggiore resistenza tra le maglie di un gel
È così possibile visualizzare il DNA facendolo
migrare all’interno di un supporto solido (gel) e
colorandolo opportunamente
I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:
Tampone : crea continuità nella vaschetta
AGAROSIO: polimero che costituisce il gel
Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la
corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da
inserire nelle taschine del gel
BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi
azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’
LA STRUMENTAZIONE
DELL’ELETTROFORESI:
1) ALIMENTATORE:
crea la differenza di
potenziale POLO -
2) VASSOIO e ] bande di DNA
VASCHETTA
ELETTROFORETICA
:
vi si alloggia il gel,
vi si instaura il
campo elettrico POLO +
VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A
LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)
Curva di denaturazione termica del DNA
Il DNA si denatura per effetto
del calore = si rompono i legami H
e si separano i due filamenti
Per l’EFFETTO IPERCROMICO delle
basi nucleotidiche, all’aumentare della
separazione dei due filamenti aumenta
OD
la 260nm
Identificazione tassonomica: %GC e
4° riassociazione molecolare DNA/DNA
% G+C
Nelle stesse condizioni
operative
(concentrazione salina,
concentrazione di
DNA) il Tm è funzione
del % G+C
> % G+C (3 legami H) > Tm
% GC = %GC + 2,08 (Tm – Tm )
X STD STD
X
Funzione della
Calcolato chimicamente concentrazione salina
E. coli
(es. strain B ha
%GC =50,9)
Il processo di denaturazione e
riassociazione del DNA, in condizioni
controllate è REVERSIBILE
La denaturazione è La riassociazione è
favorita a T > Tm e favorita a T < Tm e ad
a bassa conc. salina alta conc. salina
Allora possiamo calcolare
indirettamente la % di omologia
tra i DNA di due ceppi
attraverso una riassociazione
molecolare per via
spettrofotometrica
Metodologia di ibridazione per via
spettrofotometrica
Condizioni operative e strumentali:
Tampone di ibridazione a elevata forza ionica (es.
5x, cioè 5 volte concentrato)
T di riassociazione Tr=Tm – 25°C (alle condizioni
di forza ionica del saggio)
Spettrofotometro con lettura simultanea di almeno
4 cuvette, dotato di riscaldamento programmato
e software specifico
Estrazione, purificazione e dosaggio del DNA
1 dai ceppi A e B
2 Rottura del DNA in frammenti
Calcolo del Tr in tampone 5x (media
3 dei due Tm ottenuti nelle condizioni
del saggio)
4 Allestimento del saggio
•Introdurre nella cuvetta 1 75 µg (corrispondenti a
1,5 OD ) di DNA A
260nm
•Introdurre nella cuvetta 2 75 µg di DNA B
•Introdurre nella cuvetta 3 37,5 75 µg di DNA A
e 37,5 75 µg di DNA B
•Step di denaturazione: impostare allo
spettrofotometro una T di 98°C per 5-7 min
•Step di riassociazione: impostare Tr calcolato per
30-40 min % riassociazione
OD
260 nm
OD Tr=0. 50%
OD iniz. h
DESCRIZIONE APPUNTO
Appunti di Tecniche microbiologiche per l'esame della professoressa Fortina su: saggi microbiologici per la determinazione e la rilevazione di microrganismi in matrici alimentari complesse, progettazione ed esecuzione di protocolli sperimentali per una corretta identificazione fenotipica e genotipica dei microrganismi Studi di genetica batterica per la messa a punto di interventi mirati sul genoma di microrganismi utili.
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher stylerock87 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Tecniche microbiologiche e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Fortina Maria Grazia.
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