Tecniche microbiologiche - Appunti

Microrganismi positivi e negativi

Tipologie di microrganismi

Microrganismi autoctoni
Inerti
Alteranti
Indici di contaminazione

Qualità dei microrganismi positivi

Contribuiscono alla tipicità dell’alimento e sono protagonisti del processo produttivo:

• Batteri lattici: Lactobacillus helveticus, L. bulgaricus, Lactococcus lactis, L. cremoris, Streptococcus thermophilus
• Lieviti: Saccharomyces cerevisiae
• Muffe: Penicillium roqueforti, P. camemberti

Indicatori della qualità tecnologica

Non dannosi, presenti nelle materie prime, dove i microrganismi autoctoni contribuiscono all’ottenimento e/o conservazione del prodotto finito. Non dannosi ma in grado di causare, se presenti in alto numero, alterazioni organolettiche, incidendo sulla conservabilità del prodotto (Pseudomonadaceae, micrococchi, lieviti, muffe).

Indici di contaminazione

Non patogeni ma con lo stesso habitat e caratteristiche dei patogeni (più numerosi e più facilmente rilevabili: stafilococchi, Escherichia coli coliformi fecali).

Sicurezza e microrganismi negativi

Patogeni: Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Shigella spp., Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, E. coli enteropatogeno, Vibrio cholerae.

Producono tossine nell’alimento o nell’organismo. La loro presenza nell’alimento (carica) o nell’organismo dipende dalla carica e dalla suscettibilità dell’ospite.

Identificazione dei microrganismi

Isolamento da matrici complesse:

• Terreno complesso
• Terreno selettivo
• Terreno di arricchimento
• Condizioni colturali

Mantenimento in coltura pura per studio:

• Conta totale
• Conta selettiva
• Riconoscimento fenotipico

Criteri di identificazione tradizionale

Fenotipo:

• Macromorfologia
• Micromorfologia
• Reazione di Gram
• Metabolismo energetico
• Esigenze nutrizionali
• Esigenze colturali
• Pattern enzimatico
• Caratteristiche strutturali

Genotipo:

• Omologia DNA/DNA

La specie batterica

Insieme di ceppi isolati in habitat diversi ed in tempi diversi che posseggono:

• Una elevata similarità fenotipica, con almeno una proprietà distintiva nei confronti delle altre specie
• Una elevata omologia genetica (riassociazione molecolare DNA/DNA >70%)
• Una elevata omologia filogenetica (omologia di sequenza del gene codificante per rRNA 16S >98%)

Per ogni specie batterica descritta esiste un ceppo di riferimento o ceppo type, mantenuto in collezioni internazionali.

Criteri di identificazione innovativa

Impiego di tecniche di indagine genetica, basate sulla possibilità di amplificare in breve tempo, regioni specifiche del cromosoma batterico (Polymerase chain reaction - PCR).

Studi filogenetici e genetici permettono l'appartenenza alla specie in tempi ridotti ed in modo specifico, anche per un numero elevato di isolati da identificare. Le caratteristiche fenotipiche vengono studiate in un secondo tempo, solo sugli isolati di interesse, per permetterne il riconoscimento a livello di biotipo.

Il codice genetico

64 possibili triplette:

• UUU Fenilalanina, UUC Fenilalanina
• UCU Serina, UCC Serina, UCA Serina, UCG Serina
• CCU Prolina, CCC Prolina, CCG Prolina, CCA Prolina
• ACU Treonina, ACC Treonina, ACG Treonina, ACA Treonina
• GGU Glicina, GGC Glicina, GGA Glicina, GGG Glicina
• CAU Istidina, CAC Istidina

Alcuni AA sono specificati da più di un codone. Degenerazione del codice genetico per minimizzare gli effetti delle mutazioni.

Come sfruttare le conoscenze sul DNA in laboratorio?

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche:

1. Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica
2. Visualizzazione per via elettroforetica
3. Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione molecolare DNA/DNA
4. Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma
5. Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione dello studio molecolare delle porzioni amplificate

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche:

1. Raccolta e lavaggio delle cellule
2. Risospensione in tampone + saccarosio (6%)
3. Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per 30 min)
4. Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%
5. Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilico
6. Centrifugazione e raccolta del surnatante
7. Fase acquosa contenente il DNA Interfase Solvente
8. Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante
9. Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi
10. Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH
11. Scioglimento del DNA in tampone