Tecniche microbiologiche - Appunti

non dannosi, presenti

nelle materie prime,

dove non

autoctoni contribuiscono

all’ottenimento e/o

conservazione del

prodotto finito

non dannosi ma in grado di

causare, se presenti in alto

numero, alterazioni alteranti

organolettiche, incidendo

sulla conservabilità del

prodotto

(Pseudomonadaceae,

micrococchi, lieviti, muffe)

non patogeni, ma ma con lo

stesso habitat e caratteristiche

indici di dei patogeni

contaminazione (più numerosi e più facilmente

rilevabili: stafilococchi,

Escherichia

coliformi fecali

coli

)

Sicurezza microrganismi negativi

patogeni

Salmonella spp. Staphylococcus aureus

Shigella spp. Bacillus cereus

Listeria

monocytogenes Clostridium botyulinum

E. coli

enteropatogeno Produzione di

Vibrio cholereae tossine

nell’alimento o

nell’organismo

Presenza

nell’alimento o (carica)

nell’organismo

(carica e

suscettibilità

dell’ospite)

Identificazione dei microrganismi

Isolamento da matrici complesse

*Terreno complesso

*Terreno selettivo

*Terreno di arricchimento

*Condizioni colturali

Mantenimento in coltura coltura pura

Studio

*Conta totale

*Conta selettiva

*Riconoscimento In quale ordine disporre le

FENOTIPO tessere del puzzle

HABITAT ?

FILOGENESI

GENOTIPO INNOVATIVO

TRADIZIONALE

1. Habitat 1. Habitat

2. Fenotipo 2. Filogenesi

3. Genotipo 3. Genotipo

4. Fenotipo

Criteri di identificazione tradizionale

Fenotipo Macromorfologia

Micromorfologia

Reazione di Gram

Metabolismo energetico

Esigenze nutrizionali

Esigenze colturali

Pattern enzimatico

Caratteristiche

strutturali

Genotipo Omologia

DNA/DNA

La specie batterica

Insieme di ceppi isolati in

habitat diversi ed in tempi

diversi che posseggono:

•una elevata similarità

fenotipica, con almeno una

proprietà distintiva nei confronti

delle altre specie

•una elevata omologia genetica

(riassociazione molecolare

DNA/DNA >70%)

•una elevata omologia

filogenetica (omologia di

sequenza del gene codificante

per rRNA 16S >98%)

Per ogni specie batterica descritta

esiste un ceppo di riferimento o ceppo

type, mantenuto in collezioni

internazionali

Criteri di identificazione innovativa

Impiego di tecniche di

indagine genetica, basate

sulla possibilità di PCR

amplificare in breve (Polymerase

tempo, regioni specifiche chain reaction)

del cromosoma batterico

Studi filogenetici e genetici

Appartenenza alla specie in

tempi ridotti ed in modo

specifico, anche per un numero

elevato di isolati da

identificare

Le caratteristiche fenotipiche vengono

studiate in un secondo tempo, solo sugli

isolati di interesse, per permetterne il

riconoscimento a livello di biotipo

DNA

Il codice genetico 64 possibili triplette

Codone AA Codone AA

UUU Fenilalanin ACU Treonina

a

UUC Fenilalanin ACC Treonina

a

UCU Serina ACG Treonina

UCC Serina ACA Treonina

UCG Serina GGU Glicina

UCA Serina GGC Glicina

CCU Prolina GGG Glicina

CCC Prolina GGA Glicina

CCG Prolina CAU Istidina

CCA Prolina CAC Istidina

Alcuni AA sono specificati da più di un codone DEGENERAZIONE DEL CODICE

GENETICO per minimizzare gli

effetti delle mutazioni

C

TC CA

TA

TT T AA

T

TA AC

TA TC

CG G CG

AG GG

T TA

GT

TA AC

INIZIO ATG GTG TTG CTG

STOP TAA TAG TGA

Promotore della trascrizione

GENE OPERONE

Schema di lettura aperto: Open Reading Frame

ORF

gene proteina

Operone ribosomale

PROMOTORE Ribosomal Binding

Site = RBS

GAGG

AAGG

GGA

GGAG

AGGA

Come possiamo sfruttare in laboratorio le

conoscenze sul DNA?

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche

1° Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica

2°

3° Visualizzazione per via elettroforetica

Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione

4° molecolare DNA/DNA

5° Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma

Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione

6° dello studio molecolare delle porzioni amplificate

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche

1°

Raccolta e lavaggio delle cellule

Risospensione in tampone + saccarosio (6%)

Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per

30 min)

Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%

Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi:

fenolo, CHF/isoamilico

Centrifugazione e raccolta del surnatante

Fase acquosa contenente il DNA Interfase

Solvente

Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante

Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi

Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH

Scioglimento del DNA in tampone

Quantificazione

2° Il DNA ha un massimo di

assorbimento a 260 nm

1 OD = 50 µg/ml

260nm

3° Visualizzazione per via

elettroforetica

una molecola carica posta all’interno di un

¾

campo elettrico migra in direzione del polo di

carica opposta

in un gel costituito da un polimero organico

¾

molecole di dimensioni diverse (ma di uguale

carica) migrano con velocità diverse, perché le

molecole di dimensioni maggiori incontrano

maggiore resistenza tra le maglie di un gel

È così possibile visualizzare il DNA facendolo

migrare all’interno di un supporto solido (gel) e

colorandolo opportunamente

I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:

Tampone : crea continuità nella vaschetta

AGAROSIO: polimero che costituisce il gel

Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la

corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da

inserire nelle taschine del gel

BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi

azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’

LA STRUMENTAZIONE

DELL’ELETTROFORESI:

1) ALIMENTATORE:

crea la differenza di

potenziale POLO -

2) VASSOIO e ] bande di DNA

VASCHETTA

ELETTROFORETICA

:

vi si alloggia il gel,

vi si instaura il

campo elettrico POLO +

VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A

LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)

Curva di denaturazione termica del DNA

Il DNA si denatura per effetto

del calore = si rompono i legami H

e si separano i due filamenti

Per l’EFFETTO IPERCROMICO delle

basi nucleotidiche, all’aumentare della

separazione dei due filamenti aumenta

OD

la 260nm

Identificazione tassonomica: %GC e

4° riassociazione molecolare DNA/DNA

% G+C

Nelle stesse condizioni

operative

(concentrazione salina,

concentrazione di

DNA) il Tm è funzione

del % G+C

> % G+C (3 legami H) > Tm

% GC = %GC + 2,08 (Tm – Tm )

X STD STD

X

Funzione della

Calcolato chimicamente concentrazione salina

E. coli

(es. strain B ha

%GC =50,9)

Il processo di denaturazione e

riassociazione del DNA, in condizioni

controllate è REVERSIBILE

La denaturazione è La riassociazione è

favorita a T > Tm e favorita a T < Tm e ad

a bassa conc. salina alta conc. salina

Allora possiamo calcolare

indirettamente la % di omologia

tra i DNA di due ceppi

attraverso una riassociazione

molecolare per via

spettrofotometrica

Metodologia di ibridazione per via

spettrofotometrica

Condizioni operative e strumentali:

Tampone di ibridazione a elevata forza ionica (es.

5x, cioè 5 volte concentrato)

T di riassociazione Tr=Tm – 25°C (alle condizioni

di forza ionica del saggio)

Spettrofotometro con lettura simultanea di almeno

4 cuvette, dotato di riscaldamento programmato

e software specifico

Estrazione, purificazione e dosaggio del DNA

1 dai ceppi A e B

2 Rottura del DNA in frammenti

Calcolo del Tr in tampone 5x (media

3 dei due Tm ottenuti nelle condizioni

del saggio)

4 Allestimento del saggio

•Introdurre nella cuvetta 1 75 µg (corrispondenti a

1,5 OD ) di DNA A

260nm

•Introdurre nella cuvetta 2 75 µg di DNA B

•Introdurre nella cuvetta 3 37,5 75 µg di DNA A

e 37,5 75 µg di DNA B

•Step di denaturazione: impostare allo

spettrofotometro una T di 98°C per 5-7 min

•Step di riassociazione: impostare Tr calcolato per

30-40 min % riassociazione

OD

260 nm

OD Tr=0. 50%

OD iniz. h

Appunti di Tecniche microbiologiche per l'esame della professoressa Fortina su: saggi microbiologici per la determinazione e la rilevazione di microrganismi in matrici alimentari complesse, progettazione ed esecuzione di protocolli sperimentali per una corretta identificazione fenotipica e genotipica dei microrganismi Studi di genetica batterica per la messa a punto di interventi mirati sul genoma di microrganismi utili.