Tecniche microbiologiche - Appunti

AGGA

Come possiamo sfruttare in laboratorio le

conoscenze sul DNA?

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche

1° Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica

2°

3° Visualizzazione per via elettroforetica

Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione

4° molecolare DNA/DNA

5° Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma

Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione

6° dello studio molecolare delle porzioni amplificate

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche

1°

Raccolta e lavaggio delle cellule

Risospensione in tampone + saccarosio (6%)

Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per

30 min)

Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%

Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi:

fenolo, CHF/isoamilico

Centrifugazione e raccolta del surnatante

Fase acquosa contenente il DNA Interfase

Solvente

Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante

Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi

Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH

Scioglimento del DNA in tampone

Quantificazione

2° Il DNA ha un massimo di

assorbimento a 260 nm

1 OD = 50 µg/ml

260nm

3° Visualizzazione per via

elettroforetica

una molecola carica posta all’interno di un

¾

campo elettrico migra in direzione del polo di

carica opposta

in un gel costituito da un polimero organico

¾

molecole di dimensioni diverse (ma di uguale

carica) migrano con velocità diverse, perché le

molecole di dimensioni maggiori incontrano

maggiore resistenza tra le maglie di un gel

È così possibile visualizzare il DNA facendolo

migrare all’interno di un supporto solido (gel) e

colorandolo opportunamente

I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:

Tampone : crea continuità nella vaschetta

AGAROSIO: polimero che costituisce il gel

Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la

corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da

inserire nelle taschine del gel

BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi

azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’

LA STRUMENTAZIONE

DELL’ELETTROFORESI:

1) ALIMENTATORE:

crea la differenza di

potenziale POLO -

2) VASSOIO e ] bande di DNA

VASCHETTA

ELETTROFORETICA

:

vi si alloggia il gel,

vi si instaura il

campo elettrico POLO +

VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A

LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)

Curva di denaturazione termica del DNA

Il DNA si denatura per effetto

del calore = si rompono i legami H

e si separano i due filamenti

Per l’EFFETTO IPERCROMICO delle

basi nucleotidiche, all’aumentare della

separazione dei due filamenti aumenta

OD

la 260nm

Identificazione tassonomica: %GC e

4° riassociazione molecolare DNA/DNA

% G+C

Nelle stesse condizioni

operative

(concentrazione salina,

concentrazione di

DNA) il Tm è funzione

del % G+C

> % G+C (3 legami H) > Tm

% GC = %GC + 2,08 (Tm – Tm )

X STD STD

X

Funzione della

Calcolato chimicamente concentrazione salina

E. coli

(es. strain B ha

%GC =50,9)

Il processo di denaturazione e

riassociazione del DNA, in condizioni

controllate è REVERSIBILE

La denaturazione è La riassociazione è

favorita a T > Tm e favorita a T < Tm e ad

a bassa conc. salina alta conc. salina

Allora possiamo calcolare

indirettamente la % di omologia

tra i DNA di due ceppi

attraverso una riassociazione

molecolare per via

spettrofotometrica

Metodologia di ibridazione per via

spettrofotometrica

Condizioni operative e strumentali:

Tampone di ibridazione a elevata forza ionica (es.

5x, cioè 5 volte concentrato)

T di riassociazione Tr=Tm – 25°C (alle condizioni

di forza ionica del saggio)

Spettrofotometro con lettura simultanea di almeno

4 cuvette, dotato di riscaldamento programmato

e software specifico

Estrazione, purificazione e dosaggio del DNA

1 dai ceppi A e B

2 Rottura del DNA in frammenti

Calcolo del Tr in tampone 5x (media

3 dei due Tm ottenuti nelle condizioni

del saggio)

4 Allestimento del saggio

•Introdurre nella cuvetta 1 75 µg (corrispondenti a

1,5 OD ) di DNA A

260nm

•Introdurre nella cuvetta 2 75 µg di DNA B

•Introdurre nella cuvetta 3 37,5 75 µg di DNA A

e 37,5 75 µg di DNA B

•Step di denaturazione: impostare allo

spettrofotometro una T di 98°C per 5-7 min

•Step di riassociazione: impostare Tr calcolato per

30-40 min % riassociazione

OD

260 nm

OD Tr=0. 50%

OD iniz. h

5 Calcolo e interpretazione dei risultati

Dal tabulato bisogna calcolare per ogni campione:

• Cot ½ = ½ OD (al 50% riassociazione) x t (h)

impiegato a raggiungere tale valore

• Cot ½ = media Cot ½ dei DNA omologhi

100

• Cot ½ = somma Cot ½ dei DNA omologhi

0

Formula: % riassociazione

Cot ½ + Cot ½ - Cot ½

mix 100 0 X 100

1

- ½

Cot 100

= ODTr (t=0) – ODiniziale

∆OD

Al 50% riassociazione: OD50 = ODiniziale + 1/2 ∆OD

Cercare sul tabulato il tempo richiesto per raggiungere

OD50 e trasformarlo in h

t (

Calcolare il Cot ½ h) x 1/2 OD50

=

5° Amplificazioni di porzioni specifiche del

cromosoma

PCR Polymerase chain reaction

DNA totale estratto dalle

cellule = DNA stampo o

5’ 3’ templato (in opportuno

3’ 5’ tampone di reazione

Separazione dei filamenti

5’ 3’ mediante DENATURAZIONE

(95°C 3-5 min)

3’ 5’ Oligonucleotidi

+ (INIZIATORI o PRIMERS)

di 15-20bp

FASE DI APPAIAMENTO = T

5’ di appaiamento per 30-60 ‘’

3’ T app. =Tm (primer) – 3°C

3’ 5’ Tm = 4 x (G+C) + 2 x (A+T)

=DNA polimerasi termostabile

+ + = dNTP

FASE DI ALLUNGAMENTO =

5’ T di AZIONE DELL’E = 72-

3’ 75°c per 30-60 ‘’

3’ 5’

Fase di denaturazione 1 ciclo

Fase di appaiamento

Fase di allungamento 6 7

25-30 cicli = 10 -10 copie

5’ 3’

3’ 5’

Verifica dell’avvenuta amplificazione:

•gel elettroforesi

•Controllo negativo

Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione dello

6° studio molecolare delle porzioni amplificate

Se una specie batterica possiede nel suo cromosoma un gene o una regione

specifici, allora posso costruire una

•Devo conoscere la sequenza nucleotidica agli estremi del gene o regione specifica

•Devo costruire i primers idonei

•Devo estrarre il DNA batterico totale dal campione in cui devo ricercare la

presenza di quella determinata specie

•Devo condurre una amplificazione specie-specifica

•Devo conoscere il PM dell’amplificato che mi aspetto e l’eventuale numero di copie

presenti lungo il cromosoma Da matrice alimentare devo

verificare la presenza di

microrganismi indesiderati

Se conosco il 1. Ricerco in banca dati

genere e/o la possibilità di costruire

la specie da primers genere o specie-

ricercare specifici sonde

2. Allestisco saggi di

amplificazione specifica

3. Verifico in

elettroforesi la presenza

del giusto segnale di

amplificazione

Ho in tempi brevi

ed in modo preciso

la risposta

qualitativa:

presenza/assenza

Esempi di sonde specie-specifiche

his

Gene Lactococcus lactis cremoris

e

(933 bp) (933 + “n” 59)

Lactococcus garvieae

16S rDNA (1100 bp)

Streptococcus thermophilus (950 bp)

lac

Z Enterococcus faecium (650 bp)

reg. conserv. Enterococcus faecalis (940 bp)

ddl (Ala-

Gene

Ala ligasi) lactis

Se devo identificare un numero elevato di isolati,

le tecniche di indagine genetica mi possono

aiutare? Amplificazione della regione spaziatrice

compresa tra il 16S rDNA e il 23S rDNA

studiando ad esempio il polimorfismo presente in (RSA)

housekeeping

operoni conservati e/o in geni Amplificazione del 16S rDNA e successiva

digestione con E.R. (ARDRA)

•Permettono di ottenere

cluster omogenei di

dei

isolati

•In molti casi si hanno

indicazioni già a livello di

genere e specie

Se voglio 1. Isolo su idonei terreni

conoscere i (selettivi e/o completi)

microrganism 2. Prelevo un n° rappresentativo

i presenti di colonie colture pure

e/o la loro 3. Estraggo il DNA totale da

incidenza ciascun ceppo isolato

sull’intera

popolazione 4. Allestisco saggi di

amplificazione specifica con

primers universali in grado di

raggruppare i ceppi in cluster

omogenei

5. Su un rappresentante dei

vari cluster proseguo

nell’indagine molecolare per la

conferma a livello di specie con

Ibridazione molecolare, sonde

specie-specifiche o il

sequenziamento parziale del

gene 16S

Ho in tempi brevi ed in

modo preciso la

risposta quantitativa:

presenza/incidenza

Amplificazione della regione spaziatrice

compresa tra il 16S rDNA e il 23S rDNA

(RSA)

16S 23S

Posso usare sempre Primers

Universali

La RS è la parte più variabile dell’operone

ribosomale posso distinguere generi e

specie diverse in funzione del numero e del peso

molecolare degli amplificati ottenuti

Ci possono essere sul La lunghezza della RS può

cromosoma più essere differente sia

operoni ribosomali nell’ambito dello stesso

ceppo che tra ceppi diversi

RSA

nell’ambito lattiero-caseario:

1 2 3 4 5a 5b 5c 5d M L. lactis

1 380 bp L. garvieae

2 410 bp S. thermophilus

3 360 bp

4 500 bp ??

5 a) b) c) d) 2 amplificati 300-

Enterococcus spp.

500 bp

Amplificazione del 16S rDNA e successiva

digestione con E.R. (ARDRA)

16S

1500 bp

Quali primers usare?

PRIMERS UNIVERSALI

Dopo aver ottenuto l’amplificato, si

procede alla sua restrizione con

endonucleasi di restrizione e all’analisi

dei frammenti così ottenuti mediante gel

elettroforesi

L’analisi va condotta comparando i profili

ottenuti con almeno 7-8 ER

Endodesossiribonucleasi di restrizione =

Endonucleasi = ER

Eco E. coli

RI da 5’ –G-A-A-T-T-C- Siti di restrizione

=

-C-T-T-A-A-G-5’

Hae Haemophilus aegyptius

III da 5’ –G-G-C-C-

-C-C-G-G-5’

Hpa Haemophilus parainfluenzae

II da 5’ –C-C-G-G-

-G-G-C-C-5’

Fanno parte del sistema di

MODIFICAZIONE/RESTRIZI