Tecniche microbiologiche

Tecniche Microbiologiche

Tecniche Microbiologiche 1

Domande d’esame 4

Introduzione 4

Microrganismi autoctoni: 4

Microrganismi alteranti: 4

Microrganismi indici di contaminazione: 5

Microrganismi negativi: 5

Intossicanti alimentari: 5

Infettanti alimentari: 5

1) Qual’è l’obiettivo delle operazioni di laboratorio perpetrate? 5

2) Definizione e differenza tra specie e ceppo 6

Specie: 6

Ceppo: 6

IL 16S rRNA 7

OPERONE RIBOSOMALE 7

3) Come si isola il ceppo dalla matrice complessa? Come si esegue la

diluizione iniziale per poter proseguire con quelle successive? 8

4) Che tipo e quante diluizioni vengono compiute? 8

Scelta del metodo di conta: 9

Scelta e preparazione del diluente: 9

Scelta e preparazione dei terreni nutritivi: 9

5) Come si ottiene una colonia pura e si prepara il terreno liquido? 9

Preparazione terreno MRS: 10

PREPARAZIONE delle SOLUZIONI con XILOSIO e GLUCOSIO: 10

PREPARAZIONE TERRENO BSM: 10

7) Come ci si serve delle prove di fermentazione per individuare il genere?

11

PROVA di CRESCITA e FERMENTAZIONE: 11

RISULTATI PROVE di CRESCITA e FERMENTAZIONE 11

6) Qual’è l’obiettivo e come si esegue l’osservazione morfologica al

microscopio? Che tipo di microscopio viene utilizzato? 12

8) Quali sono gli altri elementi che consentono l’identificazione? 12

OSSERVAZIONE MICROSCOPICA 13

9) Quali indagini genetiche vengono attuate a seguito dell’estrazione del

DNA? 14

ESTRAZIONE del DNA TOTALE: 14

ESTRAZIONE DNA CROMOSOMALE e/o PLASMIDICO: 14

Riassunto pratico: 14

10) Come avviene la lettura dello spettrofotometro? 15

11) Qual’è il ruolo del bromuro di etidio? 15

Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica 15

I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI: 16

LA STRUMENTAZIONE DELL’ELETTROFORESI: 16

GEL ELETTROFORESI 16

14) Su quali principi si basa l’amplificazione? 18

16) Come avviene e su quali principi si basa l’amplificazione mediante

primers universali? 18

AMPLIFICAZIONE DNA 18

12) In che cosa differiscono i marker CCC dai lineari? 19

13) Cοme si ottiene la retta di taratura dall’analisi RSA? 20

15) Cosa sono e come agiscono le sonde specie-specifiche? 21

17) Come si calcola il rapporto filogenetico che esiste tra i diversi ceppi?

22

Amplificazione della regione spaziatrice compresa tra il 16S rDNA e il 23S

rDNA (RSA): 23

Amplificazione del gene 16S rDNA e successiva digestione con

endodesossi-ribonucleasi di restrizione (E.R.): 23

Sequenziamento del gene 16S rDNA: 24

Ibridazione dot blot: 25

A questo punto è necessario seguire la metodica southern: 26

Domande d’esame

1. Qual’è l’obiettivo delle operazioni di laboratorio perpetrate?

2. Definizione e differenza tra specie e ceppo

3. Come si isola il ceppo dalla matrice complessa?

Come si esegue la diluizione iniziale per poter proseguire con quelle successive?

4. Che tipo e quante diluizioni vengono compiute?

5. Come si ottiene una colonia pura e si prepara il terreno liquido?

6. Qual’è l’obiettivo e come si esegue l’osservazione morfologica al microscopio?

Che tipo di microscopio viene utilizzato?

7. Come ci si serve delle prove di fermentazione per individuare il genere?

8. Quali sono gli altri elementi che consentono l’identificazione?

9. Quali indagini genetiche vengono attuate a seguito dell’estrazione del DNA?

10. Come avviene la lettura dello spettrofotometro?

11. Qual’è il ruolo del bromuro di etidio?

12. In che cosa differiscono i marker CCC dai lineari?

13. Cοme si ottiene la retta di taratura dall’analisi RSA?

14. Su quali principi si basa l’amplificazione?

15. Cosa sono e come agiscono le sonde specie specifiche?

16. Come avviene e su quali principi si basa l’amplificazione mediante primers universali?

17. Come si calcola il rapporto filogenetico che esiste tra i diversi ceppi?

Introduzione

Nell’ambito della garanzia di sicurezza e qualità microbiologica alimentare diviene fondamentale la

conoscenza della microflora presente in un dato alimento o porzione dello stesso.

Essa permette infatti di identificare la componente protecnologica e quella ambientale, a loro volta

distinguere i microrganismi inerti da quelli alteranti nonché dai patogeni derivanti da una fonte di

contaminazione.

Ciò è reso possibile previ studi in campo microbiologico che ci forniscono informazioni preziose

riguardo i microrganismi stessi, informazioni che è necessario sfruttare per concepire delle

operazioni di laboratorio caratterizzate da costi inferiori e risultati più specifici e precisi.

Dato che, per garantire la qualità alimentare non è tollerata la presenza di microrganismi patogeni,

l’identificazione riguarda per lo più la componente protecnologica (flora batterica volutamente

aggiunta per favorire determinate trasformazioni della stessa nei confronti della motrice alimentare

selezionata) o ambientale, dovuta alla presenza di microrganismi negli ambienti di trasformazione

che trovano nell’alimento un terreno prolifico.

Naturalmente non si tengono in considerazione esclusivamente batteri ma anche muffe e lieviti

Conoscendo le caratteristiche, il metabolismo e i prodotti di sintesi di questi microrganismi

possiamo conoscere le trasformazioni subite dal prodotto, quindi agire per ostacolarle o favorirle.

MICRORGANISMI AUTOCTONI:

Si tratta di microrganismi non dannosi presenti nelle materie prime ma non contribuiscono

all’ottenimento e/o alla conservazione del prodotto finito (es. microflora ambientale)

MICRORGANISMI ALTERANTI:

Si tratta di microrganismi no dannosi ma in grado, una volta sviluppatisi in numero elevato di

causare alterazioni organolettiche del prodotto che incidono sulla conservabilità del prodotto (es.

Pseudomonadaceae, alteranti negativi)

MICRORGANISMI INDICI DI CONTAMINAZIONE:

Si tratta di microrganismi non patogeni ma che ne condividono l’habitat e le caratteristiche

(Escherichia coli)

MICRORGANISMI NEGATIVI:

Si tratta di microrganismi pericolosi che compromettono le caratteristiche di sicurezza alimentare, a

loro volta possono essere suddivisi in intossicanti o infettanti.

INTOSSICANTI ALIMENTARI:

La patogenicità è provocata dalla produzione di tossine come prodotto del metabolismo primario o

secondario del microrganismo. Esse possono essere già contenute nell’alimento e resistere ai

trattamenti (es. tossine termostabili) e causare intossicazione oppure possono essere prodotte solo

inseguito all’ingestione e conseguente colonizzazione del tratto digestivo da parte dei

microrganismi che quindi cominciano a produrre la tossina causando tossinfezione.

Es. Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botyulinum.

INFETTANTI ALIMENTARI:

La patogenicità è dovuta all’elevato numero di organismi allo stato vegetativo che attuano un

comportamento aggressivo nei confronti delle strutture cellulari dell’apparato digerente dell’ospite.

Es. Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio cholereae.

1) Qual’è l’obiettivo delle operazioni di laboratorio

perpetrate?

L’obiettivo prepostosi in funzione delle operazioni di laboratorio effettuate è quello di identificare

con precisione specie, genere e sottospecie del microrganismo costituente la colonia analizzata che

ci permetterebbe di ottenere una traccia della storia di trasformazione del prodotto nonché

contestualizzarne le caratteristiche.

Per poter proseguire è necessario procedere isolando il microrganismo dalla matrice complessa,

solubilizzando un campione; in secondo luogo si utilizzano dei terreni selettivi per isolare il

microrganismo dagli altri presenti nella matrice sfruttando nozioni di microbiologia come le

necessità nutritive e colturali; infine, una volta isolato il microrganismo d’interesse, si crea un

terreno di arricchimento per favorirne la crescita.

Da questo step in avanti è necessario proseguire mantenendo una coltura pura, poiché eventuali

contaminazioni, volute o accidentali, non farebbero altro che alterare il risultato compromettendo

l’intera operazione.

A tal proposito diviene importante il contributo conferito dal bruciatore Bunsen, il quale garantisce

il mantenimento dei requisiti di sterilità necessari.

La sterilità è fondamentale anche per poter dare una corretta interpretazione alle operazioni di

conta, sia totale che selettiva per poi procedere con le fasi di riconoscimento.

Una corretta fase di riconoscimento è garantita dalla correlazione di quattro elementi fondamentali:

habitat, fenotipo, genotipo e filogenesi.

Questa scuola di pensiero più innovativa si contrappone alla tradizionale, la quale prevedeva di

basare l’identificazione dei microrganismi solamente su habitat, genotipo e fenotipo, permette di

ottenere risultati più soddisfacenti integrando l’analisi del genoma alle precedenti.

Più concretamente, prevede di associare gli elementi caratteristici del fenotipo (ossia:

macromorfologia, micromorfologia, reazione di Gram, metabolismo energetico, esigenze

nutrizionali, esigenze colturali, pattern enzimatico, caratteristiche strutturali) al genotipo (omologia

DNA-DNA, corrispondenza

I criteri di identificazione innovativa prevedono l’impiego di tecnici che di indagine genetica basate

sulla possibilità di amplificare in breve tempo regioni specifiche del cromosoma batterico: la PCR

(polymerase chain reaction).

Combinando studi filogenetici e genetici si possono determinare appartenenza alla specie in tempi

ridotti e modo specifico anche per un numero elevato di isolati da identificare.

Le caratteristiche fenotipiche vengono studiate in un secondo tempo solo sugli isolati d’interesse

per permetterne il riconoscimento a livello di biotipo

2) Definizione e differenza tra specie e ceppo

SPECIE:

Più ceppi isolati in habitat e tempi diversi che mantengano:

Elevata affinità fenotipica, con almeno una caratteristica distintiva nei confronti delle altre specie.

• Elevata omologia genetica (riassociazione molecolare DNA-DNA superiore al 70% di

• corrispondenza)

Elevata omologia filogenetica (omologia del gene codificante per rRNA 16S maggiore del 98%)

•

CEPPO:

Consiste nel livello più basso della categoria tassonomica. Consiste nel derivato di un singolo

isolamento e identifica le colonie di una specie caratterizzate da lievi differenze (chiamate tipi o

varianti) nel fenotipo e di conseguenza anche nel genotipo (riassociazione molecolare DNA-DNA

inferiore al 70%/omologia del gene codificante per rRNA 16S inferiore al 98%)

Per ogni specie batterica descritta esiste un ceppo di riferimento o type mantenuto in collezioni

internazionali.

Il DNA è formato da due filamenti complementari antiparalleli composti da 4 basi nucleotidiche

(timina-adenina e guanina-citosina).

Il codice genetico permette la formazione di 64 possibili triplette per gli amminoacidi, alcuni dei

quali codificati da più di un codone.

Questa peculiarità prende il nome di degenerazione del codice genetico, allo scopo di minimizzare

gli effetti delle mutazioni.

Questo significa che un aminoacido può essere sintetizzato da più triplette di DNA (geni) ma un

gene può corrispondere esclusivamente ad un aminoacido.

La sintesi avviene ad opera della RNA polimerasi, un enzima che si lega al filamento di DNA nel

sito riconosciuto come gene promotore (o codoni d’inizio, solitamente ATG) e riproduce mediante

sequenze di RNA complementari le triplette di basi azotate che compongono la proteina da

trascrivere fino alla porzione che viene riconosciuta come codone di fine (UGA)

Un operone non è altro che una porzione di DNA che codifica per più proteine

contemporaneamente. È un elemento tipico dei ribosomi che, per l’appunto, costituisce la struttura

di sintesi proteica per eccellenza all’interno della cellula.

Essi possono anche essere presenti in regioni non codificanti o casuali, acquisite mediante

trasformazione, traduzione o coniugazione.

I ribosomi sono importanti per le nostre analisi perché il DNA in essi contenuto presenta la

sequenza di trascrizione RNA sia per il gene 16S che 23S che 5S.

L'rRNA è il componente che ha subito meno variazioni nel corso dell'evoluzione, in tutte le cellule.

Per questa ragione, i geni che codificano per l'rRNA vengono sequenziati per identificare il gruppo

tassonomico di un organismo, per riconoscere i gruppi correlati e stimare il tasso di divergenza tra

le varie specie.

La 16S lega la sequenza Shine-Dalgarno contenuta nell'mRNA, e la loro interazione permette

l'associazione subunità minore-mRNA.

IL 16S rRNA

• Gene lungo ca 1500 - 1600 nt, dopo la trascrizione non è tradotto in proteina, ma assume una

particolare struttura secondaria che serve per la costruzione del ribosoma

• In particolare, codifica per la subunità piccola del ribosoma (16S nei procarioti; negli eucarioti

come i funghi è il 18S rRNA)

Deve assumere una determinata struttura tridimensionale per assolvere la sua funzione, quindi ha

• un basso tasso di mutazione (la maggior parte delle mutazioni producono ribosomi non

funzionanti e non vengono trasmesse alla progenie)

E’ presente nei genomi in multicopia (anche 15 copie!), proprio perché è essenziale per la vita. Per

questo motivo è facilmente amplificabile

IL 16S RRNA

Nella sequenza del gene 16S rRNA si riconoscono diverse regioni:

• regioni CONSERVATE universali, che hanno la stessa sequenza in tutti i batteri

• regioni SEMICONSERVATE, che hanno sequenza uguale tra batteri dello stesso taxon

• regioni VARIABILI, che hanno la stessa sequenza tra batteri appartenenti alla stessa specie

Confrontando la sequenza di questo gene di diversi batteri è possibile:

• Quantificarne la DISTANZA FILOGENETICA: determinare a che punto dell’evoluzione 2

organismi si sono differenziati

• Determinare la diversità tra gli organismi

• Identificare un batterio: se 2 organismi

hanno 16S rRNA con più del 97% delle basi omologhe, possono appartere alla stessa specie

OPERONE RIBOSOMALE

Il gene codificante il 16S rRNA fa parte di una regione di più geni trascritti da un medesimo

︎ promotore trascrizionale (operone); tali geni sono denominati 16S, 23S e 5S

I geni sono separati tra loro da due regioni intergeniche (ITS) aventi anche funzione di regolazione

︎ del processo di maturazione degli rRNA

All’interno dell’ITS tra 16S e 23S, possono esserci uno o due geni codificanti tRNA

︎ Tra questi geni il 16S rRNA è quello più analizzato, seguito dal 23S rRNA; attualmente per la

︎ definizione di una nuova specie, oltre che ad approfondite analisi fenotipiche e genotipiche, è

richiesto il sequenziamento completo del 16S; nel caso di un nuovo genere batterico, il 16S è più

che sufficiente.

Gli ITS e lo stesso 16S sono utilissimi per l’analisi sia di ceppi puri che dell’intera comunità

︎ batterica, come vedremo in seguito

La 23S contenuta nella subunità maggiore lega tra loro gli aminoac