Quaderno di laboratorio-Tecniche microbiologiche

CONTA MICROBICA

Per ciascun terreno, si va a contare la piastra che contiene un numero di colonie compreso tra 30 e

300. Per esprimere il risultato in UFC/g bisogna fare l’opposto della diluizione della piastra considerata

e moltiplicare ulteriormente per 10.

Terreno Diluiz. Risultato

-6 6 9

PCA 10 240 * 10 = 2.4 * 10 UFC/g

-5 6

YGC 10 1 * 10 UFC/g

-6 7

MRS 10 8 * 10 UFC/g

ISOLAMENTO in COLTURA PURA

Si preleva con un’ansa sterile una colonia superficiale e ben isolata dalle altre dalla piastra MRS

preparata nelle esercitazioni precedenti e la si trasferisce in una provetta con del terreno MRS liquido

a pH 6.5.

2017 Preparazione terreno MRS: prendiamo il flacone con il terreno liofilizzato MRS e ne pesiamo

un’aliquota corrispondente a 150 mL.

/

2016 MRS 52.2g : 1L = x : 150mL 7.83 g

|

laboratorio Dopo aver portato a volume, è necessario prima controllare il pH. Per far questo utilizziamo un

pHmetro. Se dovesse essere troppo basso, per alzarlo, si aggiunge NaOH. A questo punto i 150 mL di

di terreno a pH corretto vengono ripartiti nel seguente modo:

Quaderno  70 mL in 14 provette (5 mL per provetta) che verranno poi tappate e sterilizzate;

3  80 mL vengono addizionati del 4% di NaCl e poi suddivisi in 16 provette (5 mL per provetta),

tappate e preparate per la sterilizzazione.

Ricordarsi di siglare le provette con MRS o MRS 4% NaCl!

Il secondo gruppo prepara 150 mL di terreno MRS che vengono poi ripartiti in modo differente:

 70 mL in 14 provette (5 mL per provetta) che verranno poi tappate e sterilizzate;

 80 mL vengono addizionati del 6.5% di NaCl e poi suddivisi in 16 provette (5 mL per provetta),

tappate e preparate per la sterilizzazione.

Ricordarsi di siglare le provette con MRS o MRS 6.5% NaCl!

I calcoli che devono essere fatti per trovare la quantità di NaCl da aggiungere al terreno sono:

MRS 4% di NaCl 4g : 100 = x : 80mL 3.2 g

MRS 6.5% di NaCl 6.5g : 100 = x : 80mL 5.2 g

Le provette con diversa concentrazione di sale servono per identificare meglio il genere a cui

appartengono i batteri lattici.

PREPARAZIONE delle SOLUZIONI con XILOSIO e GLUCOSIO

Per questa esercitazione bisogna preparare:

 Soluzione di glucosio al 20% sterilizzata per filtrazione (10 mL);

 Soluzione di xilosio al 20% sterilizzata per filtrazione (10 mL).

I grammi necessari sono gli stessi per entrambe le soluzioni.

20g : 100 = x : 10mL 2 g

Le soluzioni di zucchero sono sterilizzate per filtrazione in quanto, se trattate ad elevate temperature

e pressioni tipiche dell’autoclave, andrebbero in contro a caramellizzazione.

PREPARAZIONE TERRENO BSM

Preparare 100 mL di terreno BSM (Basal Sugar Medium) che ha la seguente composizione (g/L): 2017

 Peptone 15; /

2016

 Estratto di lievito 6;

 Tween80 1 mL; |

 laboratorio

Rosso di clorofenolo 40 mg (da stock solution di 4 mg/mL).

Il terreno deve essere a pH 6.4 per cui, come per la prova precedente, viene utilizzato il pHmetro.

Dopodiché ripartire il terreno in 20 provette (5 mL per provetta) e in 10 di esse introdurre la campanella di

di Durham, tappare e portare a sterilizzare. Quaderno

4

Il terreno BSM è un terreno base che contiene i nutrienti necessari ai microrganismi per crescere ma

manca la fonte di carbonio. Questa viene aggiunta successivamente e permette di andare a studiare il

metabolismo microbico:

 Omofermentanti: non producono CO , non usano i pentosi ma esosi;

2

 Eterofermentanti facoltativi: non producono CO , fermentano i pentosi;

2

 Eterofermentanti obbligati: producono CO , fermentano i pentosi.

2

Gli omofermentanti quindi saranno in grado di crescere solo nelle provette che contengono il glucosio.

Al contrario gli eterofermentanti saranno in grado di crescere laddove è presente lo xilosio. Per

distinguere gli eterofermentanti obbligati da quelli facoltativi, si utilizza la campanella di Durham che

viene posta sul fondo della provetta. Se viene prodotta della CO , rimarrà qui intrappolata. In alcuni

2

casi la produzione del gas è talmente elevata che la campanella viene portata in alto lungo la provetta.

Laboratorio 04) 08 Maggio 2017

PROVA di CRESCITA e FERMENTAZIONE

1. Addizionare sterilmente alla provetta di BSM contenente la campanella la soluzione di glucosio

fino ad una concentrazione dello 0.5% e alla provetta di BSM senza campanella la soluzione di

xilosio fino ad una concentrazione dello 0.5%. La soluzione iniziale è del 20%. Quindi:

20 : 5 = 0.5 : x 125 microlitri

2. Trasferire sterilmente 300 microliti di brodocoltura in Eppendorf usando una pipetta da 1 mL;

3. Centrifugare a 150000 rpm per 5 minuti;

4. Versare il surnatante, aggiungere 600 microlitri di acqua sterile, rispondere il pellet e

centrifugare nuovamente. Questa fase corrisponde al lavaggio delle cellule;

5. Risospendere il pellet in 600 microlitri di acqua sterile. In questo modo ho eliminato eventuali

nutrienti del brodo di partenza rimasti che potrebbe inficiare la prova di fermentazione;

6. Inoculare 100 microlitri della sospensione cellulare in:

 MRS addizionato di NaCl 4% e 6.5%;

 MRS per prove di crescita a 45 °C;

 BSM-Glu e BSM-xil.

2017 ESTRAZIONE del DNA TOTALE

/ Centrifugare nella stessa eppendorf usata per gli inoculi 3 mL di brodocoltura (2 centrifugate da 1.5

2016 mL), lavare il pellet con 1 mL di acqua sterile ed eliminare il surnattante.

|

laboratorio Il pellet verrà conservato a -20 °C fino alla prossima esercitazione.

OSSERVAZIONE MICROSCOPICA

di Quest’ultima esercitazione ci permette di andare ad osservare a fresco il ceppo selezionato. Su un

Quaderno vetrino portaoggetto mettiamo 1 goccia della sospensione cellulare e successivamente copriamo con

un vetrino coprioggetto. Aggiungiamo 1 goccia di olio ed osserviamo al microscopio ottico a contrasto

di fase con un ingrandimento 1000x.

5 Risultato osservazione: cocchi di forma leggermente allungata. Potrebbero essere: Streptococcus

thermophilus, Lactococcus o Enterococcus. Laboratorio 05) 15 Maggio 2017

RISULTATI PROVE di CRESCITA e FERMENTAZIONE

I microrganismi che fermentano lo xilosio sono eterofermentanti per cui sono riconoscibili dal fatto

che la provetta contenente questo zucchero vira al giallo. Se sono eterofermentanti obbligati vediamo

della CO intrappolata entro la campanella di Durham. Quelli che fermentano il glucosio invece sono

2

omofermentanti. BSM- BSM- Generi/specie 4% 6%

Gruppi fisiologici(Fermentazione) Morfologia 45°C

Glu Xil tipici NaCl NaCl

Streptococcus + +/- -

thermophilus

COCCHI Lactococcus V(-) V(+/-) V(-)

OMOFERMENTANTI Enterococcus + + +

+ - Lactobacillus

helveticus

BACILLI +

Lactobacillus

bulgaricus

Lactobacillus

parabase

FACOLTATIVI + + BACILLI -

Lactobacillus

plantarum

Lactobacillus

ETEROFERMENTANTI fermentum

BACILLI Lactobacillus V

brevis

OBBLIGATI +(gas) + Weissella spp.

Leuconostoc

COCCHI - (+) (+)

spp.

Osservando le provette con terreno BSM per la prova a 45 °C, con 4% di Nacl e 6% di Nacl, si nota che

il glucosio è stato fermentato mentre invece lo xilosio no per cui sappiamo trattarsi di un

omofermentante.

Dalla prova microscopica si è visto che il batterio ha forma a cocco per cui possiamo escludere i bacilli. 2017

La provetta a 45 °C è risultata negativa così come la provetta con 6% di NaCl. E’ un alofilo basso in

quanto è in grado di crescere ad una concentrazione bassa di sale (1-6%) ed è probabilmente mesofilo. /

Questo fa pensare si tratti di un batterio lattico appartenente al genere Lactococcus. Per averne la 2016

certezza, bisogna proseguire con l’estrazione del DNA. |

laboratorio

ESTRAZIONE DNA CROMOSOMALE e/o PLASMIDICO

La seguente metodica viene applicato per estrarre il DNA da lattobacilli ed enterococchi:

1) Utilizzare 2 mL di brodocoltura in eppendorf da 1.5 mL. Centrifugare per 3 mina 15000 rpm; di

Quaderno

2) Lavare le cellule per 2 volte:

 Con 500 μL di una soluzione SDS-EDTA (SDS 0.5%, EDTA 50 mM, pH 8);

 Con H O distillata sterile.

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Per “lavaggio delle cellule” si intende risospendere il pellet nelle soluzioni sopra indicate,

vortexare bene, centrifugare a 15000 rpm per 3 min ed eliminare il surnatante.

3) Risospendere le cellule in 150 μL di reattivo 1, vortexare e aggiungere 38 μL di reattivo 2.

Incubare a 37 °C per 30 min;

4) Aggiungere 18 μL di reattivo 3 e 12 μL di SDS 20%, mescolare per inversione ed incubare a 37

°C per 10 min. La sospensione dovrebbe apparire limpida; Passaggi necessari

5) Aggiungere 12 μL di NAOH 3N e mescolare per inversione per 3 min; solo per l’estrazione di

6) Aggiungere μL di Tris M pH 7 e mescolare per inversione per 2 min; DNA plasmidico

7) Aggiungere 28 μL di NaCl 5 M e mescolare per inversione per 2 min;

8) Aggiungere 300 μL di Cloroformio-alcool isoamilico (CHF isoamilico 24:1 v/v) e mescolare per

inversione e lasciare a 4 °C per almeno 1 h;

9) Centrifugare a 15000 rpm per 10 min. Raccogliere il surnatante avendo cura di non prelevare

l’interfase e versarlo in una eppendorf nuova;

10) Precipitare il DNA mediante aggiunti di 2 volumi (circa 400 μL) di etanolo al 95% freddo (-20

°C), centrifugare a 15000 rpm per 15-20 min;

11) Eliminare il surnatante, asciugare il DNA precipitato e scioglierlo in 30 μL di TE buffer;

12) Trasferire 5 μL della soluzione di DNA in una nuova eppendorf contente 20 μL di H O distillata

2

che servirà per la successivi PCR. I rimanenti vanno caricati su gel.

La composizione dei reattivi necessari per i passaggi sopra elencati è:

REATTIVO 1 REATTIVO 2 REATTIVO 3

Tris 1M pH8 7,5 µl 0,9 µl 0,9 µl

EDTA 0,5M pH8 0,3 µl 9 µl

Saccarosio 10,2 mg

Lisozima 1,8 mg

H O distillata 142 µl 37 µl 8 µl

2 Tot. 150 µl Tot. 38 µl Tot. 18 µl

2017 Laboratorio 06) 22 Maggio 2017

/ GEL ELETTROFORESI

2016 Procedere con i seguenti passaggi:

|

laboratorio 1) Preparare 150 mL di gel di agarosio allo 0,7%, risospendendo la quantità di agarosio necessaria,

in funzione alle dimensioni del gel che si deve preparare, in tampone TAE 1X (Tris-acetato-

EDTA pH 8, costituito da Tris 40 mM, acido acetico glaciale 20 mM, EDTA 1 mM) a cui vengono

di aggiunti 0,2 μg/ml di una soluzione di cloruro di etidio. Ufficialmente si utilizza il bormuro di

Quaderno etidio che però è neurotossico;

0.7 : 100 = x : 150 1.05 g di agarosio

7 2) Sciogliere a caldo e versare il gel ancora caldo nella idonea vaschetta, posizionando il pettine

per costruire le tasche di caricamento, e lasciare raffreddare fino ad avvenuta solidificazione

del gel;

3) Estrarre il pettine facendo molta attenzione e porre il gel nella idonea vaschetta per

elettroforesi orizzontale e riempire la vaschetta con TAE 1X fino a ricoprire l’inte