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IV. Software
Abbiamo detto che abbiamo un software diverso per il citofluorimetro di Sorting che mi fa vedere vari valori diversi e in particolare è importante la finestra di Sorting. Posso fare raccolta su piastravetrini e in particolare è che in piastra ho solo 4 possibilità, due cariche a dx e due a sx. La raccolta in piastra funziona che scelgo solo una via di uscita e si ha una specie di carrello sotto alla camera di sorting che mi fa spostare i pozzetti invece che le cellule. Quindi è chiaro che se uso provette posso usare tutte e quattro le vie di deflezione insieme, mentre per i pozzetti posso usare solo una direzione alla volta. Ritorniamo un attimo al risultato nella finestra di sorting, immaginiamo di avere un tipo di separazione a 4 vie: da questa finestra di sorting vedo che accanto a ogni gate di sorting ho il numero di eventi che ho in quel momento e che via via recupero per quella popolazione. Ho anche altre informazioni però, il rate.
Per esempio di sorting, quanti eventi sono sortati al secondo, e ho anche gli eventi in conflitto, poi ho la frequenza di conflitto e anche l'efficienza, e è importante vedere cosa sono questi eventi in conflitto. E si ritorna al fatto che all'inizio diciamo che ogni goccia ha una cellula, ma avevamo già detto che è una situazione ideale che non sempre abbiamo all'atto pratico, soprattutto quando abbiamo tanti eventi. Può capitare che ci siano due cellule nella stessa goccia, ma più che altro che ci sia un passaggio di una cellula da una goccia all'altra durante la fase di recupero, ovvero da quando la goccia viene caricata ho il calcolo del drop delay e ho uno spazio di circa 10cm, non troppo piccolo e le gocce sono tantissime, e sono quasi attaccate l'una all'altra e quindi potrebbe esserci un passaggio anche di una cellula da una goccia all'altra man mano che ci si allontana dalla flow cell verso i.
tubi o piastre di raccolta. Quindi, questi eventi in conflitto sono proprio quegli eventi che sono scartati dal software per aumentare la purezza e far sì che si soddisfino le condizioni di sorting poste dall'operatore. Come posso allora definire il grado di purezza che voglio ottenere? A livello di software è un po' quello che abbiamo visto nelle compensazioni del citofluorimetro, non agisco su filtri e lunghezze d'onda, ma agisco a livello di software. Qui diciamo che si viene a creare e possiamo scegliere delle maschere di sorting per definire la posizione della cellula dentro alla goccia e capire e ipotizzare (sono previsioni) se posso migliorare l'efficienza di separazione. Essenzialmente possono esistere varie combinazioni di queste maschere di sorting e le principali sono tre che si basano sul fatto che una goccia viene divisa in modo ipotetico in 32 parti, quindi è un po' come meridiani e paralleli, quindi immaginiamo che la goccia siasegmenteata in 32 parti. Si viene a clacolare la posizione della cellula dentro la goccia tenendo conto di questi riferimenti. Sono tre maschere: Yeld mask, immaginiamoci la goccia interrogata che si stacca dal nozzle e che si carica in§ base al drop delay se contiene la goccia di mio interesse, e se la contiene la goccia non viene automaticamente caricata, ma in base alla maschera scelta fa un’altra valutazione. Se questa cellula si trova per esempio alle estremità, durante il percorso questa cellula potrebbe passare nella goccia vicina, quindi viene recuperata anche la goccia adiacente. In immagine c’è un esempio per cui la Yeld mask la impostiamo a un valore 16 e allora il software prende in considerazioni 8 parti ai due capi della goccia, se la cellula si trova all’estremità, in uno di questi due gruppi di 8 parti, viene recuperata anche la goccia vicina, altrimenti se si trova nel mezzo si prende solo quella goccia interrogata. Ovviamente.sepongo lo Yeld mask a 20 ho 10 da una parte e 10 dall'altra. Ovviamente è un'ipotesi che pongo, non per forza poi la cellula davvero è passata alla goccia vicina, ma per essere sicuro di averla io prendo anche le gocce vicine. Nelle gocce vicine però potrebbe esserci un'altra cellula e questo va a vantaggio del numero di cellule recuperate ma a scapito della purezza.- 55 -
Purity mask, che è una maschera più basata sulla purezza come immaginiamo. Si va a valutare le parti della goccia non sulla goccia interrogata ma nelle gocce adiacenti, si prende sempre una Purity mask a 16 e si prendono 8 parti della goccia prima e 8 della goccia dopo. Se in queste porzioni c'è una cellula, questa cellula potrebbe finire nella mia goccia di interesse nel mezzo e in questo caso non viene sortata alcuna goccia, proprio per escludere che possa avere un risultato non puro. Si recupera la goccia che voglio solo se in quelle 8 parti della goccia interrogata non c'è nessuna cellula.
goccia prima e dopo sono vuote senza cellule.Phase mask, è la maschera più pura di tutte in cui consideriamo soltanto la goccia che contiene la cellula in una posizione tale da non passare nelle gocce adiacenti e solo se le gocce adiacenti non hanno cellule che potrebbero passare nella mia goccia in analisi. Di solito si fa quando si fa un sorting su singola cellula per cui faccio sorting su pozzetti e in ogni uno voglio una sola cellula.
Adesso, avendo visto lo strumento in linea teorica, vediamo alcuni esempi di separazione. Abbiamo un primo esempio di separazione di cellule T regolatorie che sono quei linfociti CD4 che esprimono CD25 in alta quantità, altra caratteristica è anche l'espressione di un fattore di trascrizione che è il COP3 (?). Quando vado a fare un gate per prendere i Treg non prendo tutte le cellule CD25, ma prendo solo quelle cellule che esprimono in altissima quantità il CD25 e che inoltre esprimono anche il CD4.
livelli invece un po' più bassi. In questa separazione quindi per avere una popolazione Treg pura non posso usare la MACS perché potrei usare un Ab anti-CD25 coniugato abiglia ma prenderebbe in modo indistinto tutte le cellule CD25 positive, senza valutare l'intensità di espressione.
Questo, quindi, è il caso in cui voglio selezionare un marcatore non per positività/negatività ma per quantità di fluorescenza espressa.
Quindi, imposto il gate di sorting, uso un sorting a due vie e lo strumento lavora e ottengo due provette con le cellule CD25 positive con una fluorescenza alta al CD25, e CD25 negative, ma come posso fare per valutare la purezza della mia separazione, ovvero sapere che nella provetta CD25 negative davvero non ho le Treg, mentre nelle CD25 positive ho quelle Treg che voglio. Posso andare a prendere un'aliquota e la rileggo al citofluorimetro, bene sarebbe usare lo stesso citofluorimetro con cui ho fatto la
prima analisi. Vado a vedere il risultato della mia separazione. In alto ho davvero le popolazioni P3 che avevo e volevo selezionare all'inizio e è la provetta CD25 positiva, mentre in basso ho le popolazioni CD25 negative e ho una purezza di 99,5% nel primo caso e 99,9% nel secondo caso.
Secondo esempio posso scegliere la separazione FACS invece di MACS quando voglio selezionare popolazioni in base alla co-espressione di due marcatori, per esempio associamo due marcatori CXCR3 e CCR6 che sono recettori per chemochine. Anche in questo caso se applicassi una MACS potrei avere tutte le CCR6 positive o le CXCR3 positive. Anche in questo caso posso selezionare la popolazione che mi interessa. Anche in questo caso analizzo a citofluorimetro e ottengo sempre altra purezza. Nel caso del CCR6 ho circa 97,5% perché sono recettori non troppo stabili e infatti nel tempo possono ridurre l'intensità di fluorescenza dall'inizio alla fine; quindi, non è detto.
chealla seconda lettura rientri perfettamente nel gate selezionato nella prima analisi.- 57 -Terzo esempio è per le cellule che esprimono la GFP, la green fluorescent protein che si usa come reporter inseguito a transfezioni/trasduzioni cellulari, quando inserisco un fattore esogeno in una cellula. Per capire se l'ho inserito tra tutti i vari sistemi reporter il GFP è molto usato. Lego il gene esogeno al GFP e sulla base della sua fluorescenza posso capire se la transfezione è avvenuta. La fluorescenza è però interna alla cellula e quindi la MACS non posso usarla perché non ho marcatori di superficie utili, e uso il FACS. Anche qua vedo che quindi ho all'inizio, in alto una popolazione che esprime GFP in basse percentuali, al 17%, e selezionando la frazione positiva come le cellule che hanno GFP, posso ottenere fino a purezza del 98%.
Lez.10 – tecniche avanzate in citofluorimetria
Innanzitutto, il primo approfondimento da fare
È di capire quali sono le tecniche che possiamo usare per amplificare un segnale di fluorescenza, poi vedremo lo studio della senescenza cellulare e alcune tecniche per studiare le cellule staminali al citofluorimetro.
- Per spiegare meglio il processo di amplificazione del segnale di fluorescenza è necessario dare alcune definizioni, tra cui la MFI, ovvero la Mean Fluorescence Intensity. Questa è l'intensità media di fluorescenza di una popolazione che ricavo dal software che mi dice l'intensità media di fluorescenza.
- Dipende sicuramente dalla cellula che prendiamo in analisi, ma anche dall'Ab e reagenti che sto usando per mettere in analisi la molecola, così come dipende dallo strumento e dalle condizioni sperimentali in cui lavoro e dipende da tanti fattori. Quindi il MFI è proporzionale alla quantità di molecole espresse in superficie di una cellula, se tutte le altre condizioni vengono mantenute costanti.
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