Schemi tecniche immunologiche e modelli cellulari e animali

Valutazione

Per tipizzare una specifica sottopopolazione si possono utilizzare anche citochine a marcatori diversi dagli Ag di membrana, come citochine specifiche prodotte dal livello intra un tipo di cellula citoplasmatica mediante Stimolazione Induce l'attivazione di più cloni linfocitari stimolati con l'aggiunta citometria di policlonale di Ig-Anti-CD28 (CD28 attiva la trasduzione del segnale) e di flusso Ig-Anti-CD3 (CD3 consente la trasduzione del segnale in seguito a riconoscimento di Ag). Tali Ab inducono un'attivazione aspecifica. Dopodiché, sono aggiunti PMA (incrementa la produzione di PKC) e ionomicina (incrementa il calcio citosolico e attiva la calcineurina). Calcineurina e PKC agiscono sul nucleo ad indurre la sintesi di NFAT e AP-1 che attivano la sintesi di citochine specifiche. Dopodiché viene aggiunta brefeldina A o monensina per inibire la secrezione proteica. Infine, viene aggiunta la saponina, per creare pori non

permanenti sulle membrane cellulari. Dopo aver rimosso gli Ab non coniugati, viene effettuata l'analisi citofluorimetrica.

DEVONO ESSERCI CONTROLLI ci possono essere cellule non stimolate, cellule sottoposte ad Ab che mostrano specificità verso altre specie o neutralizzati.

CARATTERIZZARE LA POTENZIALITÀ DI PRODURRE CITOCHINE DA PARTE DI UNA POPOLAZIONE CELLULARE

Stimolazione: Incubazione di 6 giorni delle cellule del campione con Ag/allergene specifica e le APC. Al termine dell'incubazione, avremo la presenza delle cellule T attivate dall'incontro con l'Ag. A questo punto viene aggiunta IL-2 per indurre la proliferazione della sottopopolazione attivata e dopo 8 giorni si ottiene la linea cellulare T specifica su cui viene effettuata la ricerca della citochina.

INDIVIDUAZIONE CELLULE IN GRADO DI PRODURRE CITOCHINE IN RISPOSTA ALL'Ag

Valutazione: Sono utilizzate delle biglie che possono avere dimensioni e/o

fluorescenza quantitativa diversa, coniugate a MAb specifici per la citochina ricercata. Ciascuna biglia può delle citochine riconoscere citochine diverse. Una volta avvenuto il legame con la citochina, solubili in sono aggiunti altri MAb coniugati a fluorocromi che riconosceranno epitopi plasma/siero e delle citochine coniugate alle biglie. Sono necessari test di controllo in cui un nei numero fisso di biglie sono capaci di legare una specifica citochina a supernatanti concentrazione nota. È usato per analizzare il tipo di citochina prodotta nel siero e la sua concentrazione. Intensità di fluorescenza diverse corrispondono a diverse citochine analizzate oppure a concentrazioni diverse della stessa citochina. GIULIO MAGHERINI Studio della Attivazione Con utilizzo di mitogeni risposta T-Ag policlonale specifica Attivazione Si valutano sia l'aspetto qualitativo che quantitativo. Dal punto di vista mediante Ag-specifica qualitativo, si devono mettere in coltura linee.

Specifiche T, Ag e le cellule APC per citofluorimetria 6 giorni di modo da facilitare l'espansione dei T in grado di rispondere all'Ag. Siria aggiunge IL-2 per promuovere la crescita dei T specifici. Si ottiene una linea arricchita di T specifiche e questa è valutata in base al tipo di citochine prodotte o mediante stimolo policlonale con ionomicina oppure aggiungendo nuovamente cellule APC coniugate all'Ag. Queste metodiche non mi consentono però di valutare l'aspetto quantitativo, dato che ho indotto espansione con IL-2.

Valutazione: Occorrono linfociti T, APC e Ag. La stimolazione dei T è eseguita direttamente da delle 500 microlitri di sangue intero. Lo stimolo è effettuato per 8-16 h. Si aggiungono citochine a molecole di costimolo Ig-Anti-CD49d e Ig-Anti-CD28 che si legano a recettori livello attivatori dei linfociti T per renderli specifici, pronti alla presentazione delle APC.

Intracellulare: Avviene la fase di riconoscimento con l'Ag

E l'attivazione con cui i linfociti T producono citochine. Si aggiunge brefeldina A e si fissano le cellule con formaldeide e si permeabilizzano con la saponina che consente l'entrata all'interno della cellula di Ig-Anti-Citochina specifici coniugati con fluorocromi. Infine, vengono aggiunti Ig specifici per marcatori CD69, CD4 e CD3 per riconoscere la cellula.

Tecnica di L'unica differenza è che posso riutilizzare le cellule per ulteriori analisi di cattura della approfondimento dato che non subiscono il fissaggio. È utilizzato il CATCH citochina REAGENT (costrutto ingegnerizzato), unione di due Ab, Ab-Anti-CD45 legato al prodotta secondo Ab-Anti-citochina. (catch reagent) e dell'Ag. Al termine dell'incubazione, introduco il catch reagent che si lega a tutte le cellule attivate tramite Ab-Anti-CD45. Da tale campione, creo delle sospensioni cellulari che incubo per 45

min in rotazione. Le cellule attivate produrranno la specifica citochina che andrà a legarsi immediatamente al secondo Ab del catch reagent.

Dato che le cellule non sono fissate, un parametro importante da controllare è la temperatura. T bassa marcature. T = 37°C quando le cellule T devono produrre la citochina specifica.

Analisi al Avvenuto il legame con la citochina, si aggiunge PE, citofluorimetro fluorocromo specifico per un epitopo diverso della citochina.

Sorting - FACS citofluorimetrico cellulare - MACS immunomagnetico; si utilizza un Ab coniugato a una biglia magnetica che si lega all'Ab-Anti-Citochina. Le cellule così marcate vengono inserite in un campo magnetico e separate mediante miniMACS.

Utilizzo di Non valuta la funzionalità dei linfociti T, ma identifica il linfocita T Ag specifico multimeri simulando il legame tra questo e il suo bersaglio cellulare fisiologico, sostituito da MHC un tetramero di HLA.

classe I o II, caricato col peptide antigenico e resofluorescente. Non serve l'APC, perché il tetramero sostituisce direttamente i complessi MHC I o MHC II della cellula dendritica.

Tetrameri Classe I Effettori CD8+. I linfociti CD8+ riconoscono peptidi di 9 aa che si originano dal metabolismo interno della cellula, come peptidi virali o tumorali, che la stessa monta su MHC I per poterli esternalizzare e renderli visibili ai linfociti CD8. L'MHC I presentante il peptide virale o tumorale forma due legami col CD8+ specifico per l'Ag: uno col TCR, uno col CD8. [MHC I composto da 3 domini alfa che sono la tasca di legame dell'Ag e una beta 2 microglobulina che stabilizza la struttura]. La coda della catena alfa è biotinilata e viene legata da una streptoavidina coniugata a fluorocromo. Per fare ciò è necessario conoscere la sequenza specifica della catena alfa dell'MHC e conoscere la sequenza dell'MHC, di modo da poterla far riconoscere.

dal paziente. Per il fenomeno dellarestrizione, il tetramero deve essere costituito daalmeno uno degli MHC del paziente occorreàconoscere preventivamente l’aplotipo del soggetto.
Tetrameri Classe II Effettori CD4+. L’MHC II è formato da una alfa e unabeta, ognuna suddivisa in due domini. Tali tetrameririconoscono le cellule T CD4+ specifiche per l’Ag e sibasano sullo stesso procedimento, solo che sonomolto più instabili, dato che devono accoglierepeptidi più grandi e la stessa struttura è difficile dautilizzare.
Tetrameri Classe I Sono due strutture mantenute insieme da un Ab chee CD1d è identificato al citofluorimetro con un Ab antimouseconiugato ad un fluorocromo vengono caricati colàpeptide dall’operatore.
Streptameri Modifica dei tetrameri. Lo scopo è di avere cellulespecifiche per l’Ag identificate con la metodica deltetramero e non avere la struttura tetramerica soprala cellula ho cellule

specifiche per l'Ag, non visualizzo solo la frequenza (valutata col fluorocromo). La uso soprattutto per prendere queste cellule T specifiche.

GIULIO MAGHERINI

Studio L'attivazione cellulare è il primo step che conduce alla fase effettore delle cellule T e prevede una fase di riconoscimento dell'Ag mediante MHC, al termine della quale il linfocita raggiunge il suo massimo livello di attivazione. Appena attivate, le cellule T producono IL-2 che media l'espansione clonale.

Espressione di Sia per cellule isolate ex vivo, per valutare lo stato di attivazione nel momento in cui le ho prelevate, sia cellule isolate dopo stimolazione mediante tecniche esogene.

Espressione Fattori trascrizionali fanno da tramite tra la membrana cellulare e il nucleo. La stimolazione determina a livello intracellulare degli eventi citofluorimetrici che,

di emissione (calcium green). Le cascate fosforilative sono importanti processi di segnalazione intracellulare che portano all'attivazione di fattori che regolano la trascrizione di particolari geni. Possiamo rilevare i fattori di trascrizione utilizzando MAb (anticorpi monoclonali) coniugati a fluorofori specifici per un particolare fattore trascrizionale nella sua forma fosforilata. La valutazione del calcio è fondamentale in tutte le cascate fosforilative per la segnalazione intracellulare ed è mediata da chinasi dipendenti dal calcio. Possiamo effettuare un'analisi a livello della singola cellula su campioni numerosi, definendo il numero di cellule in grado di rispondere a un determinato stimolo e mettendo in correlazione la quantità di calcio con altri parametri per determinare l'intensità della risposta, confrontando stimoli diversi. La concentrazione di calcio viene misurata utilizzando dei fluorocromi che legano gli ioni calcio e, successivamente al legame, modificano alcuni dei loro parametri, come l'intensità di fluorescenza (utilizzando quin2 e fluo4), lo spettro di assorbimento (utilizzando fura2) e lo spettro di emissione (utilizzando calcium green).di emissione (indo-1). Nei plot citofluorimetrici, sull'asse x ho il tempo, sull'asse y il rapporto tra le 2 fluorescenze che sto utilizzando. Inizialmente acquisisco il campione senza stimolo, poi rimuovo il campione dallo strumento e aggiungo lo stimolo; infine reinserisco il campione e rilevo il flusso. Tra i tipi di legame normalmente studiati con tale metodica c'è il legame chemochina recettore. La proliferazione cellulare delle cellule somatiche serve per supportare la crescita del tessuto o per riparare eventuali danni, la proliferazione delle cellule immunitarie corrisponde all'espansione clonale ed è associata con l'attivazione e la funzione cellulare. Tecniche tradizionali non usano il citofluorimetro. Conta cellulare a microscopio. Uso di colorante che evidenzia cell.