Tecniche immunologiche

Anticorpi monoclonali: allestimento e applicazioni

Funzione fisiologica degli anticorpi

Risposta umorale specifica: La risposta immunitaria si può dividere in umorale e cellulo-mediata. La risposta umorale è mediata da fattori solubili, che si trovano nel plasma e negli altri liquidi biologici, ovvero gli anticorpi (o immunoglobuline). Sono prodotti dai linfociti T e si possono trovare in due forme: secreta ed espressa sulla superficie come recettore per l'antigene dei linfociti B (BCR).

Cooperazione tra linfociti T e B

Nel linfonodo avviene la presentazione dell'antigene al linfocita T, da parte delle cellule dendritiche (CD), che passa da naive ad attivo, migra verso il confine dei follicoli linfatici e si interfaccia con i linfociti B i quali presentano a loro volta l'antigene e si ha l'attivazione T-B bidirezionale. Parallelamente può avvenire la captazione e la processazione dell'antigene, l'attivazione dei B e la loro successiva migrazione ai confini dei follicoli linfatici per interfacciarsi con i T. La cooperazione tra T e B porta all'ulteriore maturazione dei B che andranno a produrre anticorpi specifici per quel determinato antigene.

Attivazione dei linfociti B

In risposta ad antigene polivalenti

I B si possono attivare in risposta ad antigene polivalenti che quindi portano le Ig di membrana (BCR) a cross-linkare e attivarsi, mediante eventi di fosforilazione si attivano fattori di trascrizione per molecole che inducono il proliferare delle cellule target.

In risposta ad antigene coniugati a frazioni del complemento

I B si possono anche attivare attraverso le molecole del complemento: quest'ultime riconoscono l'antigene in modo aspecifico, il B lo riconosce in modo specifico e nel contempo si lega alle molecole del complemento, tramite molecole accessorie (come per es. CD19), un antigene legato a molecole del complemento (C3b o C3d) diventa fino a 1000 volte più immunogenico. Inoltre, topi KO per i geni C3, CD19 o CD21 presentano un grave deficit di produzione di anticorpi.

In risposta all'antigene e a ligandi dei TLR

I TLR vanno a riconoscere molecole tipiche di batteri o virali. In questo caso i linfociti B funzionano come fossero cellule dell'immunità innata in quanto riconoscono l'antigene in modo aspecifico, mentre nei primi tre casi il riconoscimento B-antigene è specifico.

Le immunoglobuline sono composte da due catene pesanti e due catene leggere, ciascuna catena è formata da domini immunoglobulinici tenuti insieme da ponti di disolfuro, mentre le catene sono tenute insieme tra di sé da legami covalenti. Si trova una regione costante (Fc) che ne determina l'isotipo e una regione variabile (Fab) che determina la specificità delle immunoglobuline ed è composta dalle regioni N-terminali delle quattro catene. Nelle immunoglobuline TM alla porzione C-terminale troviamo un dominio in più e una regione che si ancora alla membrana cellulare. Le immunoglobuline secrete si trovano in quattro isoforme (M, G, A ed E) mentre quelle TM in cinque (in più l'isoforma D che è la prima a fungere da BCR).

Presentano dei domini per legare le molecole del complemento: nella regione Fab per C3b e C4b, mentre nella regione Fc per C1q.

• IgG sono le più abbondanti nei fluidi corporei, specialmente extravascolari e sono molto importanti nella difesa contro microrganismi e le loro tossine. Di solito si trovano come monomero e si suddividono in quattro sottoclassi (γ 1-4).
• IgA si ritrovano soprattutto a livello delle mucose e sono quindi importanti nella difesa delle zone di contatto con l'esterno. Si trovano come monomero, dimero o trimero. Si ritrovano in due sottoclassi (α 1 e 2).
• IgM si trovano in forma di pentamero e infatti hanno una attività agglutinante elevata. Sono le prime ad essere prodotte e rappresentano perciò la prima linea di difesa, soprattutto contro batteri.
• IgD sono per lo più TM.
• IgE si trovano principalmente in forma di monomero ed entrano in gioco nel caso delle allergie.

Le principali funzioni delle immunoglobuline

• Neutralizzazione di microrganismi e tossine: è legata alla specificità delle immunoglobuline e infatti non è necessaria la porzione Fc. Viene molto utilizzata in caso di avvelenamento, intossicazione o infezioni virali, ovvero in interventi rapidi perché questa funzione non necessita di altre componenti del sistema immunitario.
• Opsonizzazione: un antigene ricoperto da immunoglobuline diventa più appetibile per le cellule del sistema immunitario dotate di attività fagocitaria (fagociti).
• Citotossicità mediata da anticorpi: il bersaglio sono cellule che devono essere eliminate che vengono ricoperte da anticorpi e attivano così le cellule NK. (IgG libere nel plasma non sono in grado di attivarle).

Per entrambe queste funzioni entra in gioco la porzione costante dell'immunoglobulina Fc. Infatti, sia sulle NK che sui fagociti sono presenti i recettori per le Fcγ e ne esistono di tre tipi: I lega i monomeri ad alta affinità, II ne esistono di due sottotipi, A che presenta la sequenza ITAM quindi è attivante e B che presenta la sequenza ITIM quindi è inibitore, legano i complessi di immunoglobuline, III ha una attività sviluppata per i monomeri.

• Sensibilizzazione di mastociti e granulociti basofili: mediata dalle IgE che si legano ai FcεR I, che è ad alta affinità, che si trovano su mastociti e granulociti basofili. Qui le IgE si legano prima di incontrare l'antigene. All'arrivo dell'antigene (soprattutto allergeni) le cellule si attivano e rilasciano i granuli. L'attivazione delle IgE è mediata da cross-linkaggio. Gli eosinofili godono dello stesso meccanismo però presentano il FcεR II, bassa affinità per IgE, e lo esprimono soltanto dopo il reclutamento nel sito di flogosi.

I mastociti contengono granuli preformati che contengono ammine vasoattive e granuli neoformati che producono e rilasciano prostaglandine e citochine e chemochine. La degranulazione dei mastociti provoca vasodilatazione, aumento della permeabilità capillare, aumento della secrezione mucosa e della peristalsi e reclutamento leucocitario.

Gli eosinofili invece contengono granuli che rilasciano MBP (proteina basica maggiore), ECP (proteina cationica eosinofila), EPO (perossidasi eosinofila) ed EDN (neurotossina derivata da eosinofili). La risposta di questi è principalmente verso microrganismi pluricellulari come gli elminti.

Allestimento in vitro di anticorpi monoclonali

Per la generazione di anticorpi specifici viene iniettato l'antigene nel topo il quale svilupperà una risposta immunitaria specifica per l'antigene esogeno che è stato iniettato. Si preleva il siero dell'animale immunizzato e il passo successivo è la purificazione del pool di immunoglobuline perché il siero è un contenuto proteico estremamente eterogeneo. Attraverso cromatografia per affinità si fa passare il siero dell'animale all'interno di una colonnina al quale resteranno legati solo gli anticorpi specifici per l'antigene. Con questa metodica si ottengono anticorpi che riconoscono diversi epitopi dell'antigene, quindi anticorpi policlonali.

Anticorpi monoclonali: derivano da un unico clone di linfociti B. Sono omogenei quindi sia per isotipo (producono le stesse immunoglobuline) che per specificità antigenica (riconoscono lo stesso epitopo). Per ottenerli non devo più selezionare come prima le immunoglobuline ma i linfociti B. I primi sono stati prodotti nel 1975:

• Immunizzazione del topo.
• Vengono prelevati splenociti dalla milza, selezionati i linfociti B e fusi con cellule di mieloma murino per formare ibridomi. Questo è necessario perché i linfociti B in coltura sopravvivono solo pochi giorni. Per facilitare la fusione tra i due citotipi si inserisce nella sospensione polietilenglicole (PEG) per otto minuti.
• Vengono poi selezionati gli ibridomi che producono gli anticorpi di interesse. I linfociti B che non si sono fusi dopo pochi giorni muoiono. Per selezionare gli ibridomi ed eliminare le cellule mielomatose che non si sono fuse si utilizza un terreno di coltura selettivo contenente ipoxantina (H) e timidina (T). Le cellule mielomatose non possiedono l’enzima ipoxantina-guanina-fosforil-transferasi né l’enzima timidin-chinasi, che sono tipici della via alternativa di produzione degli AA, quindi non possono utilizzare le purine inserite nel terreno perché viene anche aggiunto l’enzima aminopterina (A) che blocca la via classica di sintesi (de novo) degli AA (purine).
• Selezionare tra tutti gli ibridomi quelli che producono l'anticorpo specifico per l'antigene che è stato iniettato. Viene fatta una clonazione. Si effettua una diluizione limite: diluizione tale da mettere una cellula per pozzetto. Si recupera il supernatante di coltura dei pozzetti che contiene gli anticorpi e attraverso una tecnica di ELISA indiretta sarà possibile identificare gli anticorpi specifici per l'antigene iniettato e individuare il clone cellulare che li ha prodotti.
• Espansione in vitro dei cloni di interesse oppure re-inoculati nel topo a livello peritoneale e poi gli anticorpi vengono recuperati a livello del liquido ascitico. Questa seconda tecnica si utilizza per avere una produzione di anticorpi maggiore.

Utilizzo di anticorpi monoclonali in diagnostica e terapia

La maggior parte delle tecniche in un laboratorio biomedico si basano sull'utilizzo degli anticorpi perché sono reagenti ad alta specificità e possono essere prodotti per riconoscere ogni tipo di molecola. Possono anche essere utilizzati per ristudiare la RI: valutare il profilo immunologico. Solitamente si utilizzano i linfociti T ma si ricercano anche tutte le altre sotto-popolazioni. Inoltre, si può fare uno studio funzionale in vitro: valutazione della capacità proliferativa, di produzione di citochine, di attività helper, citotossica …

• Anti-IgE per l'asma bronchiale e l'orticaria cronica
• Anti-TNFα per l'artrite reumatoide, artrite psoriasica, uveite autoimmune, morbo di Crohn
• Anti-IL-1 per shock settico, artrite reumatoide
• Anti-IL-5 per asma bronchiale
• Anti-IL-6 per artrite reumatoide giovanile
• Anti-CD20 per linfoma B

Bisogna ricercare la cellula target e le maggiori proteine coinvolte nella patologia e soprattutto avere un quadro fisiopatologico completo. Per esempio, esistono diversi farmaci Anti-TNFα che lo bloccano con meccanismi diversi: Infliximab e Adalimumab sono anticorpi ad azione neutralizzante, la loro porzione variabile (Fab) blocca il TNFα; Etarnecept è una molecola di fusione del recettore, si unisce la Fc di IgG umana con uno dei recettori umani di TNFα. Infliximab ha la Fab di origine murina, nel secondo invece è umanizzata, così si riducono gli effetti collaterali. Il TNFα è una citochina importante nell'artrite reumatoide perché genera flogosi a livello della cartilagine richiamando neutrofili… (anche IL-1β).

Per l'asma le citochine più coinvolte sono le Th2, le cellule principale sono i Th2 e i B, fibroblasti, endoteliociti e cellule che producono muco. Sono stati prodotti molti farmaci per diversi target. Omalizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato anti-IgE che riconosce l'Fc nel dominio Ch3 che si va a legare all'FcεR I e II, è quindi specifico per il sito di legame. È in grado di creare complessi che però sono solubili, è incapace di fissare il complemento e ha un basso rischio di innescare anafilassi in quanto impedisce che altre molecole si leghino perché il farmaco occupa il sito di legame. Non sono farmaci di prima scelta. Vengono utilizzati se non c'è risposta ai trattamenti standard. Omalizumab viene dato in dipendenza dalla concentrazione di IgE nel siero del paziente e in base al peso, l'allergene deve essere presente e il paziente deve avere una scarsa attività polmonare. Mepolizumab e Reslizumab sono anti-IL-5 che quindi legano la citochina prodotta oppure Benralizumab che lega il recettore dell'IL-5.

IL-13 prodotta da Th2 ha molteplici target (macrofagi, cellule endoteliali) ed è importante per lo switch isotipico in IgE. Utilizzando un anticorpo specifico è stato evidenziato un altro marcatore: periostina (proteina che viene rilasciate dalle cellule endoteliali delle vie aeree stimolate da IL-13). Il trattamento con anti-IL-13 era più favorevole in pazienti con alti livelli di periostina. Il farmaco è il Lebrikizumab. Dupilumab è un anticorpo che blocca il recettore sia dell'IL-4 che dell'IL-13. Entrambi i recettori (che sono dimeri) contengono la stessa catena (IL-4Rα) quindi con un unico farmaco blocco i due recettori e il signaling di STAT6.

Immunoterapia: lo scopo è riattivare la risposta immunitaria che è stata inibita dalla cellula tumorale stessa. Bersagli molto importanti di questa terapia sono gli immuno-checkpoint. In questa categoria si ritrovano tutte le molecole stimolatorie o inibitorie di T. Il linfocita per attivarsi ha bisogno di legami che coinvolgono molecole di o-stimolo oltre al legame TCR-MHC con la cellula presentante l'antigene (APC). Es CD28 che si lega a CD80/CD86 (stimolo). Esistono anche molecole di blocco di questo segnale che sono parte della normale risposta immunitaria. Es CTLA-4-CD80/CD86 (inibitorio). La cellula tumorale crea un segnale inibitorio perenne. Le principali molecole per cui sono state messe a punto terapie sono infatti CTLA-4 e PD-1/PD-L1. Per il primo Ipillimumab e per il secondo Nivolumab. Questi due anticorpi hanno avuto successo nel melanoma, tumore del polmone non a piccole cellule e come trial clinici nel tumore alla prostata e alla vescica. L'anticorpo impedisce che avvenga il legame inibitorio. Se il T esprime sia CD-28 che CTLA-4 al recettore sulla APC si legherà CTLA-4 perché ha maggiore affinità quindi partirà il segnale inibitorio. Utilizzando l'anticorpo anti-CTLA-4 si ha il blocco dell'inibizione. È stato visto che è possibile utilizzare entrambi i farmaci per avere una buona efficacia. Il parametro per la terapia con anti-PD-1 sono i livelli di PD-L1 espressi dalle cellule tumorali, più elevati sono e maggiore efficacia avrà la terapia. Vengono usati anche farmaci che sono proteine di fusione contenenti CTLA-4 solubile, per bloccare la risposta immunitaria, per esempio sono usati nell'artrite reumatoide: con il farmaco si impedisce che CTLA-4 leghi CD80/CD86 permettendo così che il legame avvenga con CD28 e attivando il segnale stimolatorio.

RIA (dosaggio radioimmunologico)

È un metodo analitico che si avvale di due reazioni: una immunologica che prevede la formazione di complessi anticorpo-antigene e una reazione radiochimica. La tecnica è stata descritta per la prima volta nel 1975 per la ricerca dell'insulina plasmatica nell'uomo. È un saggio ad altissima sensibilità dovuto all'utilizzo di radioisotopi, viene usata per molecole che si ritrovano a bassissimi dosaggi nel plasma o difficili da saggiare (ormoni, farmaci come digitossina, alcune droghe). Altri target che vengono dosati sono antigeni virali (come HBsAg: antigene serico dell'epatite B) o anticorpi anti-DNA come quello che determina il LES (Lupus Sistemico Eritromatoso).

Il principio è una reazione di competizione tra un antigene caldo, ovvero marcato con il radioisotopo, e il suo competitor che è invece l'antigene non marcato ovvero quello che deve essere dosato. La competizione riguarda il legame di queste due molecole con l'anticorpo specifico che viene prodotto appositamente.

Ag + Ag* + Ab = AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab

La reazione si risolve in una frazione legata (AgAb e Ag*Ab) e una frazione libera (Ag e Ab). L'Ag* e l'Ab sono forniti da chi allestisce il saggio quindi sono concentrazioni note. L'Ab riconosce con la stessa affinità sia l'Ag da dosare che l'Ag* avendo la stessa struttura, per cui si legherà all'Ab l'Ag presente in maggior quantità per la legge di azione di massa.

Il test prevede il dosaggio in parallelo dell'Ag da dosare con campioni contenenti Ag a concentrazioni note per costruire la curva standard che è necessaria per sapere la concentrazione dell'Ag da dosare. Le linee guida per il test prevedono che l'Ab utilizzato riesca a legare il 50% degli Ag* che vengono messi in soluzione.

Tappe del RIA

• Preparazione e caratterizzazione dell'Ag: si deve fare un'analisi del ligando in quanto bisogna produrre l'analogo marcato. La molecola può essere sintetizzata oppure isolata da fonti naturali.
• Marcatura dell'Ag con il radioisotopo. Di solito vengono utilizzati il trizio (³H), il carbonio-14 (¹⁴C) e spesso si utilizza lo iodio (¹²⁵I o ¹³¹I) per la facilità con cui si lega alle tirosine. Cosa fondamentale: la marcatura non deve alterare la specificità antigenica e l'attività dell'Ag.
• Preparazione anticorpo specifico: l'Ag viene iniettato per via intradermica in cavie, gli anticorpi specifici prodotti vengono isolati dal siero, fusi con cellule mielomatose in un ibridoma e infine si seleziona il clone di interesse. Alcuni Ag non sono molto immunogenici e per ovviare si utilizzano apteni: sono molecole molto piccole (per es. ormoni steroidi, droghe…) che rendono l'Ag più appetibile.

Sviluppo del saggio

• Allestimento della curva di taratura: Ag* + anticorpi specifici vengono mescolati e vengono aggiunte quantità note di Ag dando così inizio alla reazione di competizione. All'aumentare della concentrazione dell'Ag libero che viene aggiunto aumenta anche la concentrazione di Ag* libero perché questo viene spiazzato. La frazione libera e quella legata vengono separate e la radioattività viene misurata con uno scintillatore, ovvero un contatore di radiazioni β o γ. L'intensità della radioattività è inversamente proporzionale alla concentrazione dell'Ag. L'allestimento della curva standard prevede che nell'asse x vengono segnate le concentrazioni note dell'Ag e sull'asse y la conta radioattiva (rapporto tra cpm bound e cpm free).
• Analisi dei campioni: i campioni da analizzare vengono trattati allo stesso modo. Si inseriscono Ag* + anticorpo e la radioattività registrata sarà inversamente proporzionale alla concentrazione dell'Ag che sto dosando. Mediante la curva standard posso risalire alla concentrazione.