Tecniche immunologiche

VALUTAZIONE DELL'APOPTOSI

L'apoptosi è la morte cellulare programmata caratterizzata da eventi ben distinti che possono essere studiati. Si distinguono 2 fasi:

- PRECOCE: la cellula diminuisce di dimensione, si stacca dalle limitrofe e si verifica un'alterazione dell'architettura di membrana con esposizione della fosfatidil-Ser.

- TARDIVA: a livello nucleare si ha la condensazione della cromatina e il taglio del DNA in frammenti discreti che raggiungono la membrana plasmatica e fuoriescono dalla cellula mediante evaginazioni (fenomeno di blebbing), che staccandosi dalla cellula formano i cosiddetti corpi apoptotici.

Esistono diversi metodi citofluorimetrici con cui studiare il processo:

- Contenuto DNA: picco pre-G0

- Potenziale mitocondriale (MitoPT): durante l'apoptosi si ha una depolarizzazione del potenziale della membrana esterna mitocondriale con alterazione della permeabilità e rilascio nel citoplasma del CytC. Vengono utilizzati

coloranti che in una cellula vitale silocalizzano sulla membrana mitocondriale come aggregati e fluorescono nel rosso. Nelle cellule apoptotiche invece non riescono ad aggregarsi e come monomeri fluorescono del verde.

Fosfolipidi di membrana (Annexina V): permettono di distinguere la fase precoce e tardiva dell'apoptosi. La Fosfastidil-Ser è un fosfolipide di membrana carico - che nella fase precoce viene esposta dal lato EC della membrana. L'Annexina V si lega, con un metodo Ca2+ dipendente, preferenzialmenete alla Fosfatidil-Ser. Questa valutazione viene spesso associata alla marcatura del DNA con PI o 7-AAD, intercalanti non vitali, per distinguere 3 diverse popolazioni:

• Annexina V + e 7-AAD o PI + indica cellula in fase tardiva perché l'alterazione della membrana plasmatica è tale da permettere anche l'ingresso dell'intercalante del DNA
• Annexina V + e 7-AAd o PI - indica cellule che sono in fase precoce

residuo di Cys nel sito attivo che agiscono proteolizzando in sequenze consenso che contengano almeno un Asp. Si dividono in iniziatrici (2, 8, 9 e 10) ed effettrici (3, 6 e 7). Uno dei principali bersagli delle caspasi è ICAD, inibitore specifico di CAD che è un'endonucleasi che andrà a tagliare il DNA. L'analisi può essere fatta mediante un substrato che diventa fluorescente una volta tagliato dalle caspasi, esistono sia substrati generali che specifici; oppure con Abs coniugati a fluorocromi che legano le caspasi nella forma attiva.

STUDIO DELL'ATTIVAZIONE E DELLA PROLIFERAZIONE MEDIANTE TECNICHE CITOFLUORIMETRICHE

L'attivazione cellulare può essere studiata sotto diversi aspetti:

Per quanto riguarda i linfociti T la fase di attivazione è fondamentale e avviene in seguito al riconoscimento dell'Ag a livello di membrana. Durante l'attivazione il linfocita T, in prima battuta, produce IL-2 che è

TNF-α e INF-γ IC. Le cellule vengono trattate con Brefeldina per trattenere le CK IC.- Espressione citoplasmatica di TFs coinvolti nei meccanismi di attivazione. I TFs agiscono al livello del nucleo e le cascate segnalatorie coinvolte sono generalmente fosforilazioni. Vengono infatti usati Abs contro la forma fosforilata, quindi attiva, dei TFs.

Nello specifico si valutano i TFs della famiglia STAT. IL-4 si lega al proprio recettore Tyr-K che si auto-P nella parte IC e va a fosforilare STAT-6 che migra nel nucleo e si lega alla sequenza consenso che si trova a livello del gene della stessa IL-4 sostenendone la produzione. Questa è la classica casata dei Th2.

IL-12 è intercettata dal suo specifico recettore, anch'esso Tyr-K, che attiva STAT-4 il quale migrerà nel nucleo e andrà ad attivare T-bet (TF principe delle Th1) e INF-γ che agisce sui macrofagi i quali rispondono producendo IL-12.

Per esempio, si analizza una popolazione CD4+ riguardo una

CK per capire se questa agisce insenso STAT-4 o STAT-6. La stimolazione viene tenuta per un tempo idoneo a far sì che si sviluppi larisposta. I TFs STAT vengono attivati subito (15-30 min) perché sono trascritti di background esono presenti nel citosol in forma inattiva.Per lo studio delle proteine fosforilate le cellule devono essere fissate e permeabilizzate anche conMeOH che mantiene meglio la fosforilazione.

31- Valutazione del Ca2+ IC come indice di risposta ad uno stimolo, in questo caso attivatorio.La [] IC di Ca2+ aumenta se è in azione uno stimolo che di solito conducono a proliferazionee differenziazione cellulare. Vengono analizzati, di solito, stimoli da parte di chemochineche si legano ai propri recettori associati a proteine G.Questa valutazione permette di effettuare analisi di una singola cellula su campioni numerosi,definire il numero di cellule che sono in grado di rispondere a un determinato stimolo e correlarecon altri parametri fenotipici.

Ionomicina si ha aumento di Ca2+. Questo indica chei Th1 non hanno i recettori specifici per le chemochine in analisi.

Per i Th17 si vede che l'aumento di Ca2+ si ha sia con Ionomicina che con CCL20 e CCL25. Indiceche questi linfociti T esprimono i recettori specifici.

La proliferazione, in citofluorimetria, si studia usando principalmente 2 tecniche:

La proliferazione cellulare, per le cellule dell'immunità, è fondamentale affinché si sviluppi la funzione effettrice.

Prima veniva misurata con altre tecniche quali la conta cellulare al microscopio, che è molto soggetta a variazioni in base all'operatori, e incorporazione di timidina triziata che è un agente radioattivo. Questo secondo metodo è estremamente sensibile perché una volta che le cellule arrivano in fase S la timidina triziata si incorpora nel DNA e quindi permette di avere una frequenza di proliferazione proporzionale alla radiazione. I metodi citofluorimetrici

• BrdU – (o bassi livelli) e 7-AAD che corrisponde a 2n: fase G0-G1
• BrdU + e 7-AAD che corrisponde a DNA tra 2n e 4n: fase S
• BrdU – e 7-AAD che corrisponde a DNA 4n: fase G2-M
• BrdU – e 7-AAD -: cellule apoptotiche

più bassi rispetto al controllo rappresentato dalle cellule che non proliferano.- Prolife