Tecniche molecolari

LE APPLICAZIONI DEL METABARCODING

❖ BIOMONITORAGGIO NEI CORSI D’ACQUA

L’Unione Europea richiede agli stati membri di avere entro una determinata data tutti i corsi d’acqua in uno stato

ecologico buono o potenzialmente buono. Nel caso non venga raggiunto l’obiettivo è necessario procedere al

ripristino dei corsi d’acqua o ad iniziative di compensazione, in accorso con autorità e portatori di interesse.

Attualmente i gruppi biologici che devono essere studiati per valutare il raggiungimento dello stato ecologico buono

sono: diatomee, macrofite, macroinvertebrati e fauna ittica.

Per i macroinvertebrati, la valutazione viene effettuata raccogliendo campioni nei siti di interesse. Dai dati di

composizione di comunità si calcoleranno degli indici che forniranno un giudizio di qualità ma vi sono delle

problematiche:

- Variabilità e soggettività dell’identificazione morfologica;

- Elevati costi di biomonitoraggio;

- Tempistiche lunghe per il processamento dei campioni;

- Scansione spaziale e temporale del monitoraggio limitata;

- Reperibilità dei risultati (con il metabarcoding non ho questo problema perché le sequenze vengono

inserite in una banca dati da cui possono essere prese per l’utilizzo).

Obiettivo: valutare la capacità del metabarcoding nel fornire risultati analoghi a quelli ottenuti attraverso

classificazione morfologica.

Metodi: hanno raccolto con il bulk metabarcoding 18 campioni in Finlandia nel 2013; il marcatore molecolare nella

regione COI – citocromossidasi (2 combinazione di primer testati di 217 pb., 421 pb.); piattaforma di sequenziamento

illumina (motivo per cui abbiamo questa lunghezza ridotta del marcatore molecolare).

Risultati: grafici in cui sull’asse delle x si hanno gli indici calcolati sulla base della morfologia, mentre sulle y indici

calcolati sulla base del DNA; per avere una corrispondenza perfetta ed esatta i punti dovrebbero trovarsi sulla linea

tratteggiata ma poiché non lo sono significa che vi è una differenza di variabilità tra il calcolo effettuato sulla base dei

dati morfologici e dei dati sul DNA. I colori dei grafici rappresentano le classi di qualità (per i valori vedere grafico). I

punti potrebbero anche essere all’interno del quadratino e identificano una corrispondenza ideale tra morfologia ed

identificazione genetica, anche se quella perfetta appunto sarebbe sulla linea.

Ma come otteniamo gli organismi dal campione per poi effettuare il metabarcoding? Devo comunque spendere del

tempo per separare gli organismi dalla matrice in cui sono presenti. Le tecniche genetiche hanno una certa flessibilità

per risolvere i problemi, infatti, nel metabarcoding prendiamo gli organismi li separiamo inserendoli in un barattolo e

poi si fa l’analisi genetica ma si possono utilizzare dei metodi alternativi: ad esempio, gli organismi una volta raccolti

dal fiume sono preservati in etanolo almeno al 70% dove sono presenti anche detriti, minerali, etc. e ciò che

possiamo fare è valutare la diversità di specie presenti nell’alcool -> questo risolverebbe problemi relativi ai costi.

Non è un’alternativa ottimizzata alla perfezione perché vi è una variabilità molto elevata. (GRAFICO)

❖ VARIABILITA’ INTRA-SPECIFICA

Si raccolgono individui appartenenti a popolazioni diverse e vedo quanto queste popolazioni abbiano un DNA simile;

più separo le popolazioni più avrò differenza genetica. I marcatori molecolari come la citocromoossidasi sono risultati

efficaci per gli studi di variabilità intra-specifica (lo stesso utilizzato nel metabarcoding).

I ricercatori hanno raccolto individui appratente al genere Baetis in un reticolo fluviale; hanno analizzato la struttura

genetica delle popolazioni sulla base del citocromoossidasi. Per ogni studio hanno valutato la presenza di pattern di

dispersioni degli organismi e ad oggi queste informazioni possono essere ottenute analizzando la struttura di

popolazione di una specie alla volta.

ASV (aplicon sequence variant) = hanno l’obiettivo di ricostruire le sequenze originali presenti prima

dell’amplificazione e del sequenziamento riescono a discriminare due sequenze sulla base di un nucleotide che

appartengono alla stessa specie. ASV è una misura della variabilità intraspecifica della specie. Possono essere

assegnate a livello di specie utilizzando i classici database di riferimento.

Risultati: dei 18 campioni raccolti in Finlandia si vede dai grafici vi è una segregazione tra nord e sud dell’area di

studio (vedere grafici).

Con la genetica di popolazione raccogli un numero di individui standard distribuiti nello spazio e poi li sequenzio;

mentre per il metabarcoding non conto gli individui da prendere quindi ottengo un campione in cui una specie è

presente e la stessa può essere assente nel secondo campione oppure avere 100 individui nel primo e 1 nel secondo,

insomma varia. Il limite del metabarcoding è lo sforzo nel differenziare il campionamento perché non possiamo

controllarlo, infatti, è una tecnica che ci fornisce dati qualitativi e non quantitativi. Al contempo stesso un altro

problema è che si creano delle false sequenze, oppure avere delle variazioni somatiche in uno stesso individuo

(mutazioni e quindi codice genetico non uniforme nel corpo) per cui si ottengono due s equenze diverse che

appartengono allo stesso individuo solo per il fatto che esiste una variazione somatica su di esso.

❖ CONSERVAZIONE DI SPECIE A RISCHIO DI RLEVAMENTO PRECOCE DI SPECIE INVASIVE

Quando abbiamo a che fare con specie minacciate dobbiamo valutare la consistenza delle popolazioni per poterle

conservare; il discorso vale sia per le specie minacciate (di interesse conservazionistico) andando ad individuare dove

sono situate, ma anche per le specie invasive (possono creare danni o meno) quindi devo sapere dove sono

localizzate per adottare delle strategie di gestione ottimale dell’ambiente. Una delle possibilità è quella di utilizzare

metodi standard (es: con retino) per valutare la presenza di tali organismi di interesse conservazionistico (sia in

positivo che in negativo); ma ci sono tecniche di valutazione alternative e complementari che possono tornare utili.

Caso studio: aveva come obiettivo quello di valutare l’efficienza di diverse tecniche di biomonitoraggio sugli anfibi, in

20 stagni -> dallo studio è emerso che all’interno di 6 anfibi analizzati sono presenti due specie di interesse

conservazionistico (rana draytoni che è quasi minacciata, ambystoma californiense che è vulnerabile). La terza

specie, la rana catesbeiana, è una specie alloctona non presente in quell’areale ed è stata introdotta dopo; è

estremamente invasiva, molto vorace e si nutre di diversi alimenti. Si è visto che le uov a di tale specie, da cui si

sviluppano le larve, vengono deposte in primavera ed in inverno e la metamorfosi avviene tra giugno e settembre.

È stato fatto un campionamento classico su 20 stagni ed in ogni stagno sono state effettuate due campagne di

campionamento utilizzando tecniche classi di biomonitoraggio con reti, retini; dopodiché negli stessi siti hanno

raccolto bottiglie d’acque le quali sono servite per effettuare le analisi di eDNA: 500 ml di H2O, che è stata filtrata,

estratta e poi hanno utilizzato due metodi: metabarcoding e qPCR (si vedrà con la Bonetta).

Hanno usato un primer nella regione RNA ribosomiale.. (non importante ha detto il prof).

Risultati: è emerso che per ogni specie viene riportato il numero di volte in cui è stata rilevata nei tempi standard; in

generale alcune specie sono state ritrovate in 20 stagni altre solo in 8, ed un’informazione interessante perché per

alcune specie il metabarcoding ha funzionato peggio rispetto alle tecniche tradizionali.

❖ IT’S RAINING SPECIES “piovono specie” (Macher et al., 2022)

L’obiettivo: valutare la possibilità di utilizzare il metabarcoding per quantificare la ricchezza in specie presente sulle

coperture arboree.

Sono andati in un parco (in Germania- confine Olanda) a raccogliere invertebrati in 4 specie di piante differenti. Per

valutare la diversità presente sulla copertura arborea hanno piazzato dei campionatori (forma di rete) per raccogliere

l’acqua piovana che dilava le foglie di queste quattro tipologie di piante. La raccolta è stata effettuata tramite un

dispositivo di raccolta e successivamente la raccolta del eDNA è stata effettuata con lo stesso metodo dove inserisco

un tubo di plastica con una pompa che fa vuoto per portare l’acqua in un filtro in modo tale che le molecole di DNA

presenti nell’acqua piovana si depositano sul filtro.

Risultati: si è visto che nelle coperture arboree diverse vi erano degli organismi fitofagi o fitofili tipici di quelle piante;

quindi, nell’acqua erano presenti sequenze appartenenti ad organismi che vivono o si nutrono di quella specie

vegetale.

Il dilavamento, inoltre, porta sequenze di DNA libere ma porta anche organismi che sono stati identificati

morfologicamente: su 56 specie ritrovate in totale, 7 sono condivise tra approccio morfologico ed eDNA, 6 con la

morfologia e con il eDNA 43 specie.

Ovviamente ci sono pro e contro: la tipologia del campionamento adottata consente di analizzare sia acqua che

organismi veri e propri e quindi è una buona tecnica; ma l’eDNA permette di analizzare la biodiversità in modo

specifico. Ma per contro la ricchezza delle specie può dipendere dalla quantità di pioggia ed il DNA può essere

trasportato, ad esempio per azione del vento, e non appartiene quindi a specie che colonizzano alberi.

❖ EFFETTO DI FORZANTI AMBIENTALI SULLE COMUNITA’ (Laini et al., 2020)

Obiettivo: comparare le informazioni fornite dall’identificazione morfologica genetica nel contesto della valutazione

dell’effetto dell’intermittenza idrologica sui macroinvertebrati.

Lo studio è stato svolto nel Trebbia e nel dicembre, due mesi dopo la secca e a giugno circa 6-7 mesi dopo la secca,

sono stati raccolti macroinvertebrati in 6 stazioni con portata d’acqua differente, dove la portata ridotta dipendeva da

azioni artificiali (prelievi idrici) quindi è una secca artificiale.

Sono stati raccolti i macroinvertebrati per poi procedere con l’identificazione morfologica al microscopio a livello di

famiglia o genere ma poi sono stati identificati con la tecnica del metabarcoding (in Germania).

Risultati: in tutti i campioni si è evidenziato un incremento di diversità all’aumentare della risoluzione tassonomica (più

sono fine/approfondito ad identificare, più specie avrò -> particolarmente vero per alcuni ordini di insetti come

efemerotteri o ditteri).

SLIDE CON GRAFICI: comparazione tra morfologia e metabarcoding.

Le tecniche biomolecolari sono mirate all’identificazione di specie, co