Tecniche e metodi di anatomia

TECNICHE DI ANATOMIA

Anatomia: "dissezione", scienza biologica che studia la struttura dell'organimso vivente , dissezionandolo. I

primi studi anatomici risalgono al periodo egiziano , poi nella scuola di Alessandria , e in Italia. Stduio

correlazione strutture degli organi e malattie osservate nei pazienti. Si fonda nel 600 l'anatomia microscopica,

con la descrizione cellulare e istologica e infine nascita dell'anatomia patologica che studia le malattie

attraverso l'esame macro e microscopico di organi , tessuti e cellule , correlando segni e sintomi con

l'osservazione.L'istologia studia la struttura microscopica dei tessut , a differenza dell'anatomia (macro) con uso

del microscopio. L'istopatologia è una branca dell'anatomia patologica che studia le alterazioni strutturali del

tessuti in caso di malattia. Si avvale di tecniche quali istochimica , immunoistochimiche , immunofluorescenza e

la biologia molecolare. Virchows capì il ruolo della cellule e le loro alterazioni in correlazione con la

sintomatologia dei pazienti. La citologia studia la morfologia della cellula , senza le componenti extra cellulari ,

la citopatolgoia studia le loro alterazione morfologiche della cellula. Su questo materiali individua fattori

prognostici per capire andamento clinico di quella malattia e fattore predittivi che indicano a quali terapie

risponderà meglio , i farmaci più adeguati(Anatomopatologo). Analizza cellule e tessuti per formulare la

diagnosi , determinare il danno , informare sulla gravità e diffusione e possibile evoluzione della malattia ,e

informazioni sulla terapia e per il follow up. 3 scopi: diagnosi della malattia , definizione della prognosi ,

parametri predittivi (diagnosi e terapia del paziente).

Identifica macroscopicamente le lesioni degli organi , le lesioni tissutali e delle cellule (citopatologia) ma anche

la patologia molecolare che studia le lesioni di tipo molecolare (alterazioni del DNA, proteiche).

Può esaminare pezzi chirurgici ovvero organi durante interventi , biopsie ovvero frammenti di organo prelevati

a pazienti viventi, organi e tessuti autoptici e materiale citologico ovvero solo cellule senza il tessuto.

 Esame citologico ad esempio su campioni di urine che contengono cellule che sfaldano dalle vie

urinarie; daccio esame citologico se esamino queste cellule. Un esame poco invasivo e quindi anche più

rapido ma hanno minor certezza diagnostica.

 Esame istopatologico: esame invasivo

Si parte dalla richiesta , quando il clinico prelva un campione e lo invia al laboratorio , segue l'accettazione e

registrazione , segue esame macroscopico e campionamento , si processo e si allestiscono i preparati istologici ,

si tagliano le sezioni al microtomo, colorazioni standard , istochimiche e immunoistochimiche , la diagnosi

istopatologica e invio della diagnosi al richiedente.

La richieste deve anere i dati anagrafici , dati del mittente , identificazione del campione , quindi il tipo di

intervento , il materiale inviato e la sede e il quesito diagnostico. Il trasporto con contenitori aventi sopra i dati

sull'etichetta. In barattoli con formalina (fu decretato un agente tossico e potenzialmente cancerogeno), un

liquido fissativo oppure si usano macchine che il pezzo è messo in buste e si fa il sottovoto e sigilla la busta. Il

campione è accettato , si controllano i dati e poi lo registra. Verifico i dati , possono avere più sedi dello stesso

paziente, se non sono il liquido i campioni non sono accettati e a ogni esame si assegna un numero progressivo

al posto dei dati del paziente, stampato e apposto sul barattolo.

L'esame macroscopico: osservo le sue caratteristiche a occhio nudo , si fa nella "sala macroscopica" dotate di

cappe per non inalare i vapori di formalina con vetri di protezione. Serve per certificare l'attività del chirurgo

ovvero quello che è stato asportato al paziente e come è sttao eseguito l'intervento , poi il tipo di campione , le

dimensioni , il peso e le eventuali lesioni e la loro descrizione (dimensioni , colore , forma , consistenza ,

distanza dai margini resezione), importante per la diagnosi anche le alterazione di volume e dimensione

corrispondenti a determinate malattie.

Il tipo di campione ovvero o il pezzo operatorio (intero organo) o la biopsia ovvero un suo frammento. Tipi di

biopsie:

 Escissionali : asportazione in toto della lesione che si trova al centro del campione con una zona

periferica di tessuto sano.(quando c'è elevato sospetto di neoplasia)

 Incisionali : la lesione , di cui non conosco il significato clinico ,è asportata in modo parziale a scopo

diagnostico e non curativo.

 Raschiamenti : si raccolgono a scopo diagnostico, frammenti di tessuto superficiale , effettuato nella

patologia genitale femminile.

 Punch biopsia: si asporta un pezzo di lesione con strumen to perforatore che perfora la cuta e ne

prelva un piccolo pezzo , una "carotina" , in genere in patologie con sospetto neoplastico non forte.

 Ago biopsie: simile alla Punch , ma si usa un ago e si effettua su orgnai interni. Sotto l'uso di una guida

, come radiografie.

Si inseriscono poi le notizie che derivano da questo esame. Si usano inchiostri di china e distinguo i margini, per

orientarmi anche dopo sulle sezioni istologiche.

Il campionamento dei pezzi operatori , dopo esame macro : si prelevano porzioni rappresentative da osservare

al microscopico. Varia il base al quesito clinico , al pezzo che ricevo. Si basa su protocolli standard

internazionali che dicono in base a queste caratteristiche come si effettua il campionamento del pezzo o della

biopsia. Dei campioni ottenuti , faccio prelevi con dimensioni massimedi 2x1 e spessore i 0,5 cm in modo da

avere le dimensioni di cassettine ( il suo contenuto corrisponde all'inclusione).

Taglio il pezzo , faccio il prelievo --> metto nella bio cassetta che riportano un numero , quello attribuito

all'esame. Delle stampanti di biocassette stampano le biocassette con il numero non scritto più a matita e un

altro numero che indica quanti pezzi operatori ho per esame. Si annotano poi il numero di cassette per ogni

paziente (Inclusioni = 4 alla fine del campionamento e quindi 4 vetrini).

Il campionamento delle biopsie: per le piccole non necessitano di altri tagli. Si segnano quanti frammenti vi

erano in ciascun "tubo". Sono messi su spugne in biocassette formate da fori in cui passano i liquidi usati nelle

processazione ma potrebbero apassarci anche i frammenti. Così subiscono il trattamento dei liquidi , ma non si

perdono. Si spostano dal barattolo di arrivo alle biocassette senza altri campionamenti. Determino il numero , la

lunghezza , il tipo di biopsia , perché ella processazione si possono frammentare. "inclusi in toto , ovvero tutti i

frammenti sono stati messi in biocassetta unica.

Per le biopsie più grandi eseguite con Punch necessitano di altri passaggi. Dall'alto ha forma rotonda, sono

tagliate in due meta e messe poi nella stessa cassetta, così vedo tutto lo spessore. ( I tagli dipendono da quello

che volgio vedere al microscopio e sono irreversibili). La parte da osservare si pone verso il basso. La biopsia

escissionale : il campionamento è fatto in modo da vedere se la lesione arriva ai margini (il chirurgo dovrà

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togliere ancora più tessuto). Possono usare inchiostri di china, faccio tagli longitudinali per vedere lo spessore e

metto tutte le sezioni ottenute nelle cassette.

Biopsia endoscopiche vengono descritti i frammenti sena campionamenti speciali tranne se non si tratta di

lesioni detti polipi ovvero lesioni che protrudono nel lume , ad esempio del colon , che sono o dotate di

peduncoli (osservo entrambi, e taglio di conseguenza) o essere sessili ( faccio più tagli lungo la lesione) quando

non lo hanno.

Esami citologico : Ho solo le cellule e sono prelevati in modo diverso perché posso eseguire esame diversi:

 Per esfoliazione diretta : le cellule si staccano , ad esempio nelle urine o dei versamenti in alcune

cavità , contenenti delle cellule. Arriva il barottilino.

 Per esfoliazione indiretta: le cellule normalmente non si staccherebbero , come nel PAP test, dove si

usa uno spazzolino , fatto poi strisciare su un vetrino. Arrivano dei vetrini.

 Per agoaspirazione: con un ago e aspiro delle cellule di quel tessuto, per organi superficiali come la

tiroide dotto guida ecografica, e vengono poi strisciate e osservate al microscopio.

Esame che varia a seconda del campione quindi nel caso dei liquidi indico il volume e il colore oppure mi

arrivano vetrini e nell'esame macro indico il numero di vetrini arrivati e la loro qualità. Questo è il

campionamento e l'esame macroscopico , dopo? Ottengo il vetrino con procedimenti diversi;

Il tessuto prelevato dal corpo , non arriva più sangue e si verificano processi come autolisi (il tessuto si

distrugge da solo) , per cui per osservarli devo preservarne la struttura fermando processi di digestione e

autodistruzione. Inoltre , devo tagliare da questi campioni sezioni molto sottili , dello spessore di micron , quelle

osservabili al microscopio dove vengono attraversate da un fascio di luce. Dentro il lisosomi ci sono enzimi litici

che vengono rilasciati quando prelevo e distruggono il tessuto. Mentre la putrefazione èè dovuta all'azione dei

batteri nell'ambiente su questo tessuto.

Quindi , devo ottenere sezioni micron e fermare la autodistruzione con processo detto fissazione: consiste

nell'interrompere la degradazione che compaiono nei tessuti dopo la morte cellulare, per preservarne la

morfologia dei tessuti.

1. Fissativi fisici: non interagiscono chimicamente con il tessuto e sono due o il congelamento del

campione tissutali o dissecazione a temperatura ambeiente (materiali citologici). Congelare blocca

perché gli enzimi agiscono a determinate temperature , anche detta criofissazione con vantaggi di

essere rapida, preserva acidi nucleici , e si evita la successiva processazione (serve a ottenere sezioni

sottili , avviene dopo la fissazione e indurisce il campione per ottenere sezioni in micron) ma porta alla

perdita di dettagli morfologici. , per cui in routine clinica non si usa. Si usa per fare diagnosi rapida

ovvero quando faccio esame intra operatorio o se devo fare esami di biologia molecolare e per le colture

cellulari. Deve avvenire in poco tempo per evitare che si formino cristalli di ghiaccio --> congelo l'acqua

dentro i tessuti , dove aumenta di dimensioni, può spaccare le cellule e determinare artefatti morfologici.

Il cervello ha più acqua in assoluto e vedo nella sezione come buchi creati da questi cristalli, per cui non

si usa in routine. Si possono dimuire , la dimensione dei cristalli è maggiore se il congelamento è lento ,

quindi se congelo velocemnte i cristalli saranno più piccoli. Come lo congelo? Posso usare azoto liquido ,

che è rapido a T molto basse , non si usa in routine perché rischioso , in genere per colture così i cristalli

non danneggiano le cellule o per analisi molecolari. Possono anche usare il criostato , uno strumento che

congela ma anche di tagliare le sezioni. Esistono poi strumenti che congelano in fretta. Non si usa in

routine tranne per le biopsie muscolari dove si usa il congelamento come mezzo di fissazione perché per

fare diagnosi è importante il contenuto proteico , per cui non devo modificare la strutture proteica e

viene meglio se uso il congelamento.

2. Fissativi chimici: a differenza , agiscono interagendo con il tessuto e in base alla sua azione sul tessuto

è detto

 Coagulanti: si sostituiscono alle molecole di acqua del campione , coagulando le poteine , bloccando

gli enzimi litici . Sono etanolo , metanolo e acetone , che induriscono troppo il campione , si usano in

citologia e hanno basso potere di fissazione.

 Gelificanti: interagiscono con le proteine del campione e fanno in modo che si formino legami crociati.

Le proteine modificano struutura 3 e non soggetti a azione degli enzimi. Sono formaldide e

paraformaldeide usata come formalina una soluzione acquosa al 40% di formaldeide con buon potere di

penetraione, con adeguato indurimento del campione , e preserva adeguatamente la morfologia

Parametri per una adeguata fissazione sono:

 Potere di penetrazione (buona capacità)

 Spessore

 Temperatura (meglio intorno ai 4°)

 Ph (acido frammenta le proteine): deve essere neutro.

 Pressione osmotica (meglio isotonici )

 Caratteristiche del frammento da fissare, alcuni si fissano più facilmente

La fissazione ha l'obiettivo di preservare la morfologia tissutale dopo l'asportazione. Parametri che influenzano

la fissazione sono il potere di penetrazione , il volume (deve essere almeno 10 volte quello del campione),

pressione osmotica e temperatura, lo spessore del campione (se grosso lo taglierò, se non fisso meno , ne

risentono gli altri esami --> nella biologi molecolare ne risente la qualità degli acidi nucleici) Tutti i fissativi

tendono a abbassare il Ph che danneggia , per cui uso sostante tampone che lo mantengono costante. La

natura influenza , è più facile se molle , mentre è più defficile nei densi , come ossa e cartilagine , inoltre il

tempo ottimale va dalle 12- 24 ora , maggiore tanto più è lo spessore, lo posso accorciare con strumenti

appositi usando una fissazione nel liquido fissativo usando insieme le microonde --> vallutare espianti per

trapianti d'organo.

Tecniche di fissazione:

 Per immersione: La più usata immerso nel liquido fissativo, usando rapporto liquido e campione 10:1.

 Per perfusione: il fissativo è iniettato , per animali da esperimento o in caso di organi esportati ma

necessito di vasi integri.

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 Per uso di vapori: usano vapori che si liberano dalla soluzione fissativa riscaldata.

I coagulanti formano legami tra gruppi idrofili delle proteine , che coagulando e non iteragiscono più con

l'acqua. Blocco gli enzimi perché tolgo l'acqua.Sono etanolo , metanolo e acetone. Hanno un basso potere di

penetrazione (penetrano lentamente), provocano eccessiva indurimento dei tessuti e coartazione delle cellule

(raggrinziscono). In citologia si usa spesso l'etanolo a 95°C. il metanolo per la citologi ematologica. L?acido

picrico è usato insieme a altri fissativi in miscela per basso potere pentrativo. Miscele con acido ascetico che

diminuisce l'indurimento.

I gelificanti agiscono stabilizzando le proteine senza allontanare l'acqua dalle cellule, rendono le proteine

inaccessibili agli enzimi. Quindi gelificano il tessuto , lo induriscono. Sono formaldeide e glutaraldeide, la prima

in natura è un gas solubile in acqua , la sua soluzione in acqua al 40% è detto formalina che reagisce con atomi

liberi idrogeno delle proteine , creando dei ponti. Noi la usiamo al 4%. Viene ossidata da O atmosferico a acido

formico , che rende acida la soluzione e si neutralizza con una soluzione basica , carbonato di calcio = la

formalina neutra tamponata crea legami tra proteine , cambiandone la conformazione, idem sugli enzimi che

rende inattivi e indurisce il tessuto ma non tanto come alcool etilico. Se fisso per troppo tempo si possono

formare dei precipitati di pigmento che possono simulare depositi di ferro. La glutaraldeide si usa in soluzioni

acquosa al 2% , per la microscopia elettronica.

Il liquido di Carnoy è una soluzione acquosa di alcol etilico e cloroformio di acido acetico, il liquido di Bouin

ovvero una miscela di acido picrico , formalina al 10% , acido acetico ma è poco usato perché ostacola

l'estreazone del DNA ma ha buona penetrazione.

La decalcificazione si effettua per tagliare tessuti cos&#