Sequenziamento di genomi, Biotecnologie Cellulari

Sequenziamento di genomi

Il fine ultimo di un progetto genoma consiste nell’ottenere la sequenza di DNA completo dell’organismo studiato.

Metodi di sequenziamento

Maxam e Gilbert (metodo per degradazione chimica)

In questo metodo, il filamento di DNA da sequenziare deve essere purificato e marcato radioattivamente 32 all’estremità 5’ di ciascun filamento con il P. Il campione di DNA da sequenziare viene denaturato in presenza di DMSO (dimetil solfossido) e la soluzione viene portata a 90°C causando la denaturazione totale della molecola. I due filamenti vengono quindi divisi mediante elettroforesi, si purifica un filamento dal gel e si divide in quattro aliquote uguali, ciascuna delle quali viene trattata con dei reagenti chimici diversi che ne causano la metilazione o la rottura in corrispondenza di basi specifiche (G, A+G, C, C+T).

Utilizzando i reagenti a basse concentrazioni si può fare in modo che i tagli non avvengano per ognuna delle basi, ma più raramente (idealmente, solo una volta per copia di frammento di DNA): in questo modo viene generata una serie di frammenti marcati (dalla fine della molecola al primo sito di taglio della stessa) di dimensione specifica i quali vengono fatti correre su gel di poliacrilammide-urea per separarli in base alla dimensione. A corsa ultimata il gel viene posto a contatto con una pellicola radiografica sulla quale lascia impressa la disposizione delle bande che riporterà i frammenti generati tramite i quali è possibile determinare l'ordine dei nucleotidi e quindi la sequenza di partenza.

Sequenziamento di Sanger (metodo a terminazione di catena)

Il metodo Sanger è un metodo cosiddetto enzimatico, poiché richiede l'utilizzo di un enzima; il principio della tecnica sviluppata da Fred Sanger si basa sull'utilizzo di nucleotidi modificati (dideossitrifosfato, ddNTPs) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche. I nucleotidi dideossitrifosfato sono molecole artificiali corrispondenti ai nucleotidi naturali, ma si differenziano per l'assenza del gruppo idrossilico sul carbonio 3’ della molecola. I dideossinucleotidi, a causa della loro conformazione, impediscono che un altro nucleotide si leghi ad essi, in quanto non si possono formare legami fosfodiesterici, provocando la terminazione della polimerizzazione.

Il protocollo classico richiede una molecola di DNA a singolo filamento, un primer per iniziare la reazione di polimerizzazione, una DNA polimerasi, deossinucleotidi e dideossinucleotidi per terminare la reazione di polimerizzazione. O un nucleotide normale o quelli modificati o il primer devono essere marcati (radioattivamente o per fluorescenza) in modo da poter visualizzare le bande dei frammenti di DNA neosintetizzato dopo aver effettuato l'elettroforesi, spesso la marcatura si trova sui dideossinucleotidi, ognuna delle 4 basi sarà quindi marcata con un fluorocromo differente.

Il campione di DNA da sequenziare viene diviso in quattro reazioni separate, ognuna delle quali contiene la DNA polimerasi e tutti e 4 i deossiribonucleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Ad ognuna di queste reazioni viene poi aggiunto solo uno dei quattro nucleotidi dideossi (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) in quantità stechiometricamente inferiore per permettere una elongazione del filamento sufficiente per l'analisi. L'incorporazione di un dideossinucleotide lungo il filamento di DNA in estensione ne causa la terminazione prima del raggiungimento della fine della sequenza di DNA stampo; questo dà origine ad una serie di frammenti di DNA di lunghezza diversa interrotti in corrispondenza dell'incorporazione del dideossinucleotide, che avviene casualmente quando esso è utilizzato dalla polimerasi in luogo di un nucleotide deossi.

I frammenti generati da queste reazioni vengono poi fatti correre su gel di poliacrilammide-urea (l’urea viene aggiunta come denaturante per impedire al filamento di DNA di appaiarsi con basi complementari del filamento stesso) che permette la separazione dei vari frammenti con una risoluzione di un nucleotide. Ognuna delle 4 reazioni è corsa su pozzetti vicini, dopodiché le bande sono visualizzate su lastra autoradiografica o sotto luce UV, e la sequenza viene letta direttamente sulla lastra o sul gel, a seconda del tipo di marcatura dei nucleotidi dideossi.

Attualmente è possibile effettuare, anziché quattro reazioni distinte per ogni nucleotide modificato, una sola reazione utilizzando i 4 ddNTPs marcati fluorescentemente in modo diverso tra loro ed utilizzando lettori ottici appropriati. In questo modo ogni filamento di DNA emetterà una luce di colore diverso in base al nucleotide (ddNTP) col quale terminerà. Questo tipo di sequenziamento è anche detto automatico e permette un sequenziamento da 300 a 1000 basi.

Pyrosequencing e automazione

Pyrosequencing

Il metodo non richiede utilizzo di ddNTPs né la separazione elettroforetica dei frammenti sintetizzati; la sintesi avviene aggiungendo i dNTPs in ordine uno dopo l’altro: la non incorporazione determina l’immediata degradazione del dNTP, viceversa l’incorporazione di un dNTP nel filamento nascente innesca una reazione che emette chemioluminescenza (che deriva dal rilascio di pirofosfato che viene aggredito dall’enzima solforilasi emettendo un lampo di luminescenza) la quale viene rivelata da un CCD. Le letture sono tipicamente di 100-200 basi, ma molti campioni possono essere trattati in parallelo.

Il metodo ha grossi vantaggi perché può essere applicato su larga scala e consente quindi il rapido sequenziamento di regioni molto grandi, a fronte di impegno umano comunque limitato. Recentemente è stata introdotta una nuova tecnica, detta pyrosequencing, pirosequenziamento, estremamente rapida ma in grado di sequenziare sole 100 basi per volta. È un metodo enzimatico completamente automatizzato, che permette il sequenziamento della catena complementare.