Sequenziamento del genoma

TM

SOLiD 3 (Applied Biosystem) restituisce 20 Gb/7 days; sono necessari pochi giorni

 di preparazione dei campioni. pyrosequencing.

Il sistema Roche 454 si basa sulla tecnologia del

Quest’ultimo si basa sulla rilevazione del

pirofosfato rilasciato dall’incorporazione di

un nucleotide durante la sintesi del DNA.

Il primer si ibrida allo stampo a singola elica,

amplificato mediante PCR e viene incubato

con gli enzimi DNA polimerasi, ATP

solforilasi, luciferasi e apirasi, i substrati

(dNTP), adenosin 5’-fosfosolfato (APS) e

luciferina.

Il primo dei quattro dNTP viene aggiunto alla

reazione. La DNA polimerasi catalizza

l’incorporazione del dNTP al filamento di

DNA, se è complementare alla base del

filamento stampo.

Ogni evento di incorporazione è

accompagnato dal rilascio di pirofosfato (PPi)

in quantità equimolare a quella del

nucleotide incorporato.

In presenza di adenosina 5’ fosfosolfato

(APS), l’ATP sulforilasi converte

quantitativamente il PPi ad ATP:

ATP sulfurilasi+ APS >

PPi ATP

❑

L’ATP, a sua volta, guida la conversione,

catalizzata dalla luciferasi, di luciferina ad

ossiluciferina con conseguente produzione di luce di intensità proporzionale alla

quantità di ATP. luciferasi >luce+

ATP+ luciferina+O2 AMP+ PPi+ ossilucife rina+CO 2

❑

La luce prodotta è rilevata da una CCD camera e

visualizzato come picco in un pirogramma.

L’apirasi, un enzima che degrada i nucleotidi, degrada continuamente tutti i dNTP non

incorporati e l’ATP in eccesso. Non appena la degradazione è completata viene

aggiunto un altro dNTP.

I dNTP vengono aggiunti sequenzialmente, uno alla volta.

Poiché il dATP è un substrato naturale della luciferasi, al suo posto viene utilizzato la

deossiadenosina α-tio-trifosfato (dATPS) che viene incorporata efficientemente dalla

DNA polimerasi ma non viene riconosciuta dalla luciferasi.

Man mano che il processo continua, il filamento di

DNA complementare è sintetizzato e la sequenza

nucleotidica è determinata dai picchi del pirogramma.

Questa procedura dà la possibilità di seguire l’ordine

con il quale i deossinucleotidi vengono incorporati nel

filamento in crescita. Rappresenta, pertanto, il tipo di

procedura che può essere facilmente automatizzata.

La rivelazione della chemioluminescenza è molto

sensibile, il che permette di eseguire la reazione in un

volume molto piccolo, perfino in un solo picolitro. Ciò permette di eseguire fino a 1,6

milioni di reazioni in parallelo su un vetrino, che equivale ad una velocità di

sequenziamento circa 100 volte superiore a quella ottenibile con il metodo a

terminazione di catena.

Questo tipo di approccio ha tre passaggi fondamentali: 1.Preparazione di una libreria

di DNA: il DNA genomico

viene isolato, frammentato co

n la nebulizzazione, legato ad

adattatori (complementari

alle sequenze)e separato in

singole eliche.

2.PCR in emulsione: La libreria di single

strand DNA funge da templato per la PCR

in emulsione (l’emulsione viene creata

mescolando opportunamente la mix di

PCR con olio minerale). Le singole

molecole vengono immobilizzate su delle

biglie (beads), dove vengono poi

amplificate mediante PCR in maniera tale

che il singolo filamento di DNA resti

legato alla biglia. Ogni biglia, così, contiene fino a dieci milioni di frammenti identici di

DNA. 3.Sequenziamento:

Beads con legati i frammenti a

singola elica vengono deposti

nei micropozzetti del PicoTiter

Plate device, costituita da circa

1,6 milioni di pozzetti che

hanno un diametro tale da

poter accomodare un’unica

biglia.

A questo punto viene aggiunta

la DNA polimerasi ed altre

sferette di dimensioni minori a

cui sono legati

covalentemente gli enzimi responsabili della reazione di pirosequenziamento.

Ad ogni ciclo vengono aggiunti

i quattro nucleotidi TACG, uno

per volta in sequenza; quando

un nucleotide complementare

allo stampo viene aggiunto

la DNA Polimerasi lo incorpora

rilasciando pirofosfato che

l’ATP solforilasi converte

ad ATP, permettendo

alla luciferasi la conversione

di luciferina ad

ossiluciferina con produzione

di un segnale luminoso che

viene registrato dalla camera

CCD. Questa reazione viene

ripetuta per 100 cicli e i

segnali ottenuti da ciascuna cella vengono combinati per generare la sequenza di

lettura per ogni micropozzetto.

Le reazioni che avvengono in ogni pozzetto della PTP (Pico Titer Plate) vengono, difatti,

rilevate e registrate in continuo ed in contemporanea per tutti i pozzetti. Ciascun

flusso (passaggio di un nucleotide) viene quindi tradotto in immagine. L’analisi delle

fluorogramma

immagini associata all’ordine dei flussi permette di costruire il di

ciascun pozzetto, in cui l’intensità della luce emessa è proporzionale al numero di

nucleotidi incorporati.

Dopo un passaggio di normalizzazione, il segnale luminoso emesso da ogni cella viene

quantizzato, e i dati relativi a ciascuna cella sono convertiti in una successione di

caratteri alfanumerici (formato FASTA).

Le tecnologie d’ibridazione su microarray furono sviluppate nei primi anni ’90 per

consentire saggi massivi in parallelo, nei quali si effettuano simultaneamente nelle

stesse condizioni sperimentali migliaia di singole reazioni di ibridazione. In un primo

momento, l’ibridazione su microarray fu concepita come uno strumento per la

mappatura su larga scala e il sequenziamento del DNA; in seguito, è stata utilizzata

per saggiare sia le varianti del DNA sia i profili di espressione genica.

microarray

Se utilizzato in un saggio di ibridazione, un è costituito da diverse migliaia

di sonde oligonucleotidiche o a DNA

non marcate, fissate su un supporto

di vetro o su una opportuna

superficie secondo coordinate

spaziali ben definite, in un formato

rappresentato da una griglia ad alta

densità.

L’ibridazione su microarray

utilizza array a oligonucleotidi o a

DNA che vengono allestiti fissando

migliaia di sonde sintetiche di DNA o

oligonucleotidi a singolo filamento in

specifiche posizioni predeterminate.

Come illustrato nella sezione

ingrandita, in corrispondenza di ogni

specifica posizione sono legate

diverse migliaia di copie identiche di

un singolo tipo di sonda a

oligonucleotide o a DNA (una

feature).

cosiddetta Viene poi

aggiunto il campione di interesse,

costituito da una serie eterogenea di

frammenti marcati di DNA o trascritti

a RNA, per consentire l’ibridazione

con le sonde presenti sull’array. Le

sequenze bersaglio legate da alcune

sonde possono essere abbondanti e

produrre un forte segnale

d’ibridazione; per altre sonde

possono invece esserci poche

sequenze bersaglio presenti nel

campione di interesse, e il segnale di

ibridazione prodotto sarà quindi più

debole. Dopo i passaggi di lavaggio

e asciugatura dell’array, i segnali

d’ibridazione per le diverse migliaia

di sonde sono rilevati mediante una

scansione al laser.

La quantificazione del marcatore

fluorescente legato a ogni posizione

nel microarray fornirà quindi una

quantità enorme di dati circa le

frequenze relative di numerose

sequenze bersaglio presenti nel

campione esaminato.

La costruzione dei microarray a DNA

di prima generazione prevedeva la

deposizione robotizzata di cloni di DNA o di oligonucleotidi sintetici sulla superficie di

vetrini da microscopia trattati chimicamente. Tuttavia, attualmente si preferiscono

microarray a DNA che usano sonde oligodeossinucleotidiche, che possono essere

disegnate in modo che siano specifiche per una singola sequenza bersaglio.

La maggior parte delle moderne applicazioni di questa tecnologia fa uso di microarray

prodotti grazie a tecnologie alternative sviluppate da due aziende:

- L’approccio seguito da Affymetrix è basato sulla produzione di chip al silicone, e ha

introdotto nell’uso comune il termine chip a DNA.

- La tecnologia sviluppata da Illumina è invece basata sull’assemblaggio casuale di

array di biglie in micropozzetti.

chip Affymetrix

La tecnologia dei implica la sintesi fotomediata di sonde

in situ.

oligonucleotidiche sul microarray

A. I microarray a oligonucleotidi di Affymetrix sono costruiti sintetizzando migliaia di

oligonucleotidi in posizioni predeterminate su un microarray costituito da uno strato

di quarzo, utilizzando un fotolitografo (fotomaschera) per determinare la posizione

di ogni nucleotide che viene aggiunto. linker

B. Ogni singolo oligonucleotide viene assemblato a partire da una molecola che

è fissata all’array e la cui estremità libera porta un gruppo protettivo fotolabile. Una

maschera dotata di fori in posizioni specifiche viene posizionata sopra l’array e

successivamente viene fatta passare attraverso le aperture nella maschera luce

proveniente da una sorgente esterna. Nelle singole posizioni dell’array esposte alla

luce, i gruppi fotolabili vengono distrutti (deprotezione).

Un mononucleotide specifico accoppiato al gruppo fotolabile viene quindi aggiunto

all’array, dove reagirà con i filamenti deprotetti. Il processo viene ripetuto tre volte

utilizzando altre tre maschere dotate di fori in posizioni differenti, per introdurre in

linker

sequenza uno degli altri tre nucleotidi. Il risultato netto è che ogni molecola

sarà dotata di un singolo nucleotide, A, C, G o T, attaccato specificamente con

modalità pre-programmata. L’uso in sequenza di quattro maschere diverse per

consentire l’accoppiamento dei quattro nucleotidi differenti viene ulteriormente

reiterato per altri 24 cicli. Il risultato finale è l’assemblaggio di oligonucleotidi

lunghi 25 basi, ognuno dotato di una sequenza predeterminata, in corrispondenza

di ogni specifica coordinata spaziale del microarray.

BeadArray Illumina

TM

La tecnologia di si basa sull’assemblaggio casuale di array di

microsfere in specifici pozzetti. Le biglie consistono in microsfere in silicio di 3 mm di

diametro e costituiscono gli elementi dell’array. Gli oligonucleotidi vengono

presintetizzati in modo da raggiungere lunghezze superiori ai 70 nucleotidi (suddivisi

in un codice di riferimento di 25 nucleotidi e in una sequenza gene-specifica di 50

nucleotidi). Ogni oligonucleotide viene accoppiato a una particolare partita di biglie e

ogni singola biglia può portare più di 100 000 oligonucleotidi identici.

Le biglie, contenenti diversi oligonucleotidi, sono raggruppate e successivamente

distribuite su microarray prefabbricati dotati di microp