Sequenziamento del genoma

SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI

L’obiettivo finale di un “Progetto Genoma” consiste nell’ottenere la sequenza di DNA

completa dell’organismo studiato, idealmente integrata con mappe genetiche e/o

fisiche del genoma, in modo tale da poter localizzare i geni e altre sequenze

caratteristiche all’interno della sequenza stessa.

Il sequenziamento del genoma è, dunque, una fase preliminare che predispone

all’annotazione genica e all’identificazione genica: il tutto è finalizzato alla

mutagenesi, ossia modificare la sequenza e studiare gli effetti sul fenotipo.

Sequenziamento

Fine ultimo del è la generazione e la creazione di sequenze

genomiche e di sequenze di geni espressi.

Ad oggi, lo si può considerare una metodica di routine per:

- identificare polimorfismi e geni d’interesse;

- controllare l’identità di cloni;

- controllare la fedeltà di nuove mutazioni create;

- controllare l’identità dei prodotti di PCR;

- valutare l’esattezza regioni ligate ex novo.

metodo della degradazione chimica, Metodo di

Storicamente, il noto anche come

Maxam-Gilbert, rappresenta il primo metodo di sequenziamento.

Nel metodo Maxam-Gilbert la sequenza è determinata in base alla lunghezza delle

molecole di cui è noto il nucleotide terminale.

Si parte da una preparazione di DNA campione double straind sottoposto a

trattamento con reagenti chimici che tagliano la molecola in corrispondenza di

specifici nucleotidi.

Consta di sei fasi:

1. Il campione di DNA a doppia elica da sequenziare viene denaturato per separare i

due filamenti di DNA.

2. I filamenti a singola elica vengono marcati al terminale 5' con l'isotopo

32

radioattivo P.

3. Il DNA a singola elica marcato radioattivamente viene suddiviso in 4 aliquote che

vengono sottoposte a 4 diverse combinazioni di trattamento con DMS o idrazina

per ottenere la rottura specifica del DNA in posizione G, G e A, C e T, C:

4. I frammenti derivanti dalle 4 combinazioni di trattamento vengono caricati in 4

pozzetti e separati per elettroforesi su gel di poliacrilammide.

5. Solo i frammenti con l'estremità 5' marcata vengono visualizzati

attraverso autoradiografia come delle bande radioattive di lunghezze diverse.

6. La sequenza del DNA viene ricostruita a partire dall'estremità 5' a quella 3' (cioè

dal frammento più corto, in basso, a quello più lungo, in alto) in base alla posizione

delle bande nei 4 diversi pozzetti, che corrisponde al taglio specifico a livello di

una delle 4 basi nucleotidiche.

Il sequenziamento con Metodo Maxam-Gilbert comporta una serie di svantaggi, primo

fra tutti la necessità di eseguire almeno quattro reazioni di sequenziamento separate,

una per ciascun nucleotide.

Esistono numerose tecniche per il sequenziamento del DNA, ma quella di gran lunga

Metodo a terminazione di catena, Metodo di

più popolare è il altrimenti noto come

Sanger.

Il sequenziamento a terminazione di catena comporta la sintesi di nuovi filamenti di

DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento. La sintesi di un singolo

filamento non prosegue indefinitamente perché la miscela di reazione contiene piccole

quantità di ciascuno dei quattro dideossinucleotidi che bloccano l’allungamento.

Lo stampo di DNA a singolo filamento può essere ottenuto mediante:

 Clonaggio in un vettore plasmidico. In generale, il frammento di DNA che deve

essere inserito nel vettore viene tagliato con la stessa nucleasi di restrizione che ha

tagliato il plasmide e quindi aggiunto al DNA plasmidico linearizzato: si forma il

plasmide ricombinante. Il plasmide ricombinante viene, poi, introdotto in cellule

batteriche all’interno delle quali si replica, riproducendosi in un enorme numero di

copie con l’inserto di DNA esogeno.

Il DNA che ne risulta è a doppio filamento, per cui viene convertito a singolo

filamento mediante denaturazione con alcali o bollitura. È una tecnica di routine;

un inconveniente può essere dovuto alla difficoltà di preparare DNA plasmidico

privo di contaminazioni, costituite da piccole quantità di DNA e RNA batterici, che

potrebbero fungere da stampi o inneschi errati nel saggio di sequenziamento.

 Clonaggio in un vettore fagico M13. I batteriofagi M13 possiedono un genoma a

DNA a singolo filamento che può essere convertito, in seguito ad infezione del

Escherichia coli,

batterio in una forma replicativa a doppio filamento. Il vettore a

doppio filamento, a sua volta, dirige la sintesi di copie a singolo filamento che

vengono impacchettate in particelle fagiche e secrete dalla cellula.

I vettori di clonaggio basati su M13 sono molecole di DNA a doppio filamento

corrispondenti alla forma replicativa del genoma M13. Questi possono essere

manipolati esattamente allo stesso modo di un vettore di clonaggio plasmidico.

Uno svantaggio è rappresentato dal fatto che il sistema può essere utilizzato

soltanto con frammenti di DNA non più lunghi di 3 Kb.

 PCR con un solo primer. Si tratta di una metodica simile alla PCR (DNA polimerasi

termostabile e cicli di denaturazione-appaiamento-sintesi di DNA).

Anche in questo caso, si assiste alle fasi di:

- denaturazione della doppia elica del DNA stampo in due singole eliche (alla

temperatura di 95 °C);

- appaiamento (annealing) degli inneschi oligonucleotidici alle sequenze di DNA a

singola elica ad essi complementari e localizzati alle estremità del frammento

bersaglio;

- estensione degli inneschi mediante aggiunta di nucleotidi nella direzione 5’-3’

ad opera della DNA polimerasi che porta alla sintesi di una nuova elica

complementare al DNA stampo.

La differenza sta nel fatto che il sequenziamento ciclico fa uso solo di un primer e

include nella reazione un ddNt (terminatore della catena). Siccome c’è un solo

primer, viene copiato solamente uno dei due filamenti della molecola iniziale e si

accumula un prodotto lineare in modo non esponenziale, contrariamente a una

vera PCR.

In generale, il sequenziamento con metodo di Sanger necessita di:

Un primer oligonucleotidico che si appai al DNA stampo (il primer svolge inoltre la

 funzione critica di stabilire la regione della molecola stampo che verrà

sequenziata);

Un DNA templato, ossia uno stampo a singolo filamento della molecola di DNA da

 sequenziale;

Una DNA polimerasi stampo-dipendente

 Una miscela di quattro deossiribonucleotidi trifosfato e un dideossinucleotide

 trifosfato; 35 32

Un marcatore fluorescente ( S o P) che si leghi a ciascun dideossinucleotide (per

 35

es. S-dATP). Nel sequenziamento automatico, il deossinucleotide radioattivo è

stato sostituito con dideossinucleotidi fluorescenti.

Il campione di DNA da sequenziale viene clonato e, successivamente, denaturato per

ottenere lo stampo a singolo filamento. Questo è suddiviso in quattro provette di

sintesi con l'aggiunta di:

- Un primer specifico complementare al filamento da sequenziare e marcato

radioattivamente

DNA polimerasi

- Una

- Una miscela dei quattro dNTP

- Un ddNTP diverso in ognuna delle quattro provette e in concentrazione 1:100

rispetto al dNTP corrispondente.

Il legame al filamento stampo guida l’incorporazione dei deossinucleotidi trifosfato:

finché viene incluso un dNTP, continua l’estensione della catena, ma occasionalmente

verrà incorporato un ddNTP e si avrà la terminazione della catena.

Ciascuna delle quattro reazioni base-specifiche genererà una serie di frammenti di

DNA marcati e di dimensioni diverse, con un’estremità 5' comune ed estremità 3'

variabili (a seconda della posizione 3' in cui è stato incorporato il ddNTP).

Anticamente, i frammenti erano visualizzati attraverso autoradiografia come bande

radioattive di lunghezze diverse. In questo caso, vengono condotte in parallelo quattro

reazioni di sintesi: al termine della reazione ogni provetta conterrà nuovi frammenti di

DNA marcati di lunghezza diversa che vengono poi caricati in 4 pozzetti diversi e

separati con elettroforesi su gel di poliacrilammide.

La sequenza del DNA viene ricostruita a partire dall'estremità 5' a quella 3' (cioè dal

frammento più corto a quello più lungo) in base alla posizione delle bande nei diversi

pozzetti, che corrisponde alla terminazione della sintesi a livello di una delle quattro

basi nucleotidiche per incorporazione di un ddNTP.

“sequenziamento automatizzato”

Nella tecnica di il deossinucleotide radioattivo è

sostituito con dideossinucleotidi fluorescenti: difatti, il DNA viene marcato facendogli

incorporare un primer o ddNTP a cui sono attaccati dei fluorofori.

L’uso di fluorofori differenti per ciascuna base implica che i frammenti possano essere

caricati in un'unica corsia e, soprattutto, che la sequenza possa essere letta in modo

automatizzato.

In una tipica reazione di sequenza è possibile sequenziare frammenti di dimensioni

fino a 800 paia di basi (500 bp dimensione ottimale).

Il sequenziamento automatizzato

comporta qualche difficoltà per

frammenti di grandi dimensioni. Se

l’inserto di DNA è più lungo di 750 bp,

l’uso di un singolo primer fornisce la

sequenza di una sola estremità

dell’inserto (A).

Un modo per ottenere una sequenza più

lunga consiste nell’effettuare una serie di

saggi di sequenziamento, ciascuno con

un “primer interno” diverso che si appaia

all’interno dell’inserto (B).

All’interno della provetta, il primer si appaia all’estremità in 3’-OH del filamento di DNA

e rende disponibile il proprio terminale idrossilico per la reazione di polimerizzazione,

catalizzata dalla DNA polimerasi.

Quando la catena nascente incorpora un ddNTP, la reazione di polimerizzazione si

arresta e si ha la terminazione della catena; ciò avverrà più volte, in posizioni diverse

della sequenza, generando una serie di frammenti interrotti di lunghezza variabile.

I prodotti di

reazione vengono

caricati in singoli

tubi capillari del

diametro di circa 50

μm contenenti un

polimero di corsa

(elettroforesi

capillare). Durante

l’attraversamento

del capillare i vari

frammenti di DNA

vengono colpiti da

un raggio laser,

focalizzato su uno

specifico punto del

gel. Man mano che i

singoli frammenti di DNA superano quel punto, il laser eccita i vari fluorocromi che

marcano i singoli frammenti. Ciascuno dei quattro fluorocromi emette una diversa

lunghezza d’onda.

Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo e intensità delle varie emissioni

luminose e il tutto viene registrato in forma grafica.

La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi: il tipo, ossia il colore

del picco, corrisponde al tipo di base azotata.

elettroferogramma

Ciò permette la costruzione di un , nel quale ogni picco ed ogni

colore corrisponde ad un determinato nucleotide. Difatti, la sequenza di DNA è

determinata da un software in grado di interpretare le misure di fluorescenza

registrate dal rilevatore e di elaborarle opportunamente.

La lettura dei tracciati grezzi o non elaborati (raw data) viene anche detta

identificazione delle basi (base-calling) ed è oggi effettuata tramite software dedicati

che leggono automaticamente le basi. I software allineano anche le sequenze simili e

forniscono una base intuitiva per identificare eventuali errori (correzione di bozze o

editing).

Mentre leggono i tracciati, i software assegnano punteggi di probabilità all’accuratezza

di identificazione di ciascuna base e le informazioni ottenute vengono usate nei

passaggi successivi della procedura di allineamento.

Normalmente l’inizio e la fine di un elettroferogramma non sono di buone qualità.

Generalmente, una sequenza ha una sua affidabilità per una grandezza non superiore

alle 500-600 bp. Gli errori di sequenziamento possono essere provocati da problemi

molto frequenti. Le prime 50 basi di una lettura sono indistinguibili dal rumore di

fondo a causa della migrazione anomala di brevi frammenti di DNA che contengono

agglomerati di coloranti. Inoltre, all’inizio avviene l’allineamento dello stampo con il

primer: questo double straind non è denaturato, per cui il sequenziatore tende a

leggere due basi per ciascuna posizione. In aggiunta, i tracciati diventano

progressivamente meno uniformi con l’avanzare della corsa: aumentano, difatti, gli

effetti della diffusione molecolare e contemporaneamente diminuiscono le differenze

relative di massa tra frammenti successivi. La parte centrale del tracciato presenta

una lettura pulita, mentre la fine della sequenza è nuovamente di pessima qualità.

Phred è l’algoritmo di base-calling più utilizzato. Ad oggi la qualità delle sequenze di

DNA viene espressa utilizzando il suo score.

Phred, assegna un punteggio di probabilità di accuratezza di identificazione di ogni

base mentre legge i tracciati elettroforetici. Phred analizza gli elettroferogrammi e

applica metodi statistici per esaminare l’andamento delle quattro basi nella regione

che precede e segue ogni picco.

Il processo di analisi è suddiviso in tappe:

Fusione delle quattro tracce corrispondenti ai quattro spettri di fluorescenza in un

 unico file.

Basandosi sulla distanza media tra i picchi in particolari regioni di sequenza, il

 programma determina il punto dove si attende di trovare un picco, in relazione ai

picchi vicini.

Il programma assegna “N” ad una posizione in cui non è possibile identificare

 alcuna base. La N può essere assegnata tendenzialmente per due ragioni: la

sequenza è sporca, non solo in quel dato punto ma per diverse decine di basi; se N

è presente in una sequenza pulita ci si trova di fronte ad un polimorfismo (per

esempio un individuo eterozigote per cui, in fase di sequenza, i due alleli non

vengono identificati).

Poiché in alcuni punti della sequenza, la risoluzione potrebbe essere minore, si

 usano valori soglia di altezza minima e massima per determinare la presenza reale

di un picco.

Ciascun tracciato è accompagnato da due righe di sequenza: un’identificazione

automatica, sotto al tracciato, e un’identificazione corretta manualmente, sopra al

tracciato. (A) La sequenza

mostra rumori di

fondo (ossia

notevole variabilità)

dati dalla lettura

delle prime 30 basi

(più o meno) della

corsa

elettroforetica.

(B) Le due file

intermedie

presentano un

tratto con due

sequenze, sia per

SNP sia per

inserzione/delezione (indel).

(C) Dopo circa 800 bp si osserva in genere una netta diminuzione della qualità della

sequenza.

Dopo anni in cui il Sanger sequencing ha rappresentato il gold standard della

Next Generation

diagnostica genetica molecolare, le tecniche di nuova generazione (

Sequencing - NGS ) stanno per prendere il sopravvento. La NGS è anche

high-throughput sequencing (sequenziamento ad alta resa)

chiamata perché, a

differenza del sequenziamento tradizionale col metodo Sanger, consente di

sequenziare moltissimi frammenti in parallelo.

Le tre piattaforme di nuova generazione attualmente di maggiore impatto sono:

il 454 della Roche

 il Solexa dell’Illumina

 il Solyd dell’Applied Biosystem



Rispetto alle tecniche basate sul metodo di Sanger, queste nuove tecniche di

sequenziamento sono caratterizzate da una più alta velocità ed elevate prestazioni

che permettono di ridurre drasticamente i tempi ed i costi. Inoltre, con questi nuovi

sistemi

- Non è più necessaria la fase di elettroforesi, poiché la lettura della sequenza è

effettuata step-by-step;

- È sempre necessaria la fase di amplificazione del DNA, ma viene effettuata in

nanoreattori in emulsione.

Nonostante la minore lunghezza dei frammenti analizzati, la possibilità di effettuare un

gran numero di letture in parallelo permette di ottenere in poco tempo una

significativa mole di dati:

Metodo di Sanger produce 6,5 Mb/day; necessita, inoltre, di alcune settimane di

 preparazione dei campioni;

Genome Sequencer FLX instrument (454 Roche) fornisce100-500 Mb/8 ore;

 occorrono pochi giorni di preparazione dei campioni;

Genome Analyzer II (Illumina) produce 3 Gb/5 days; servono pochi giorni di

 preparazione dei campioni;

TM

SOLiD 3 (Applied Biosystem) restituisce 20 Gb/7 days; sono necessari pochi giorni

 di preparazione dei campioni. pyrosequencing.

Il sistema Roche 454 si basa sulla tecnologia del

Quest’ultimo si basa sulla rilevazione del

pirofosfato rilasciato dall’incorporazione di

un nucleotide durante la sintesi del DNA.

Il primer si ibrida allo stampo a singola elica,

amplificato mediante PCR e viene incubato

con gli enzimi DNA polimerasi, ATP

solforilasi, luciferasi e apirasi, i substrati

(dNTP), adenosin 5’-fosfosolfato (APS) e

luciferina.

Il primo dei quattro dNTP viene aggiunto alla

reazione. La DNA polimerasi catalizza

l’incorporazione del dNTP al filamento di

DNA, se è complementare alla base del

filamento stampo.

Ogni evento di incorporazione è

accompagnato dal rilascio di pirofosfato (PPi)

in quantità equimolare a quella del

nucleotide incorporato.

In presenza di adenosina 5’ fosfosolfato

(APS), l’ATP sulforilasi converte

quantitativamente il PPi ad ATP:

ATP sulfurilasi+ APS >

PPi ATP

❑

L’ATP, a sua volta, guida la conversione,

catalizzata dalla luciferasi, di luciferina ad

ossiluciferina con conseguente produzione di luce di intensità proporzionale alla

quantità di ATP. luciferasi >luce+

ATP+ luciferina+O2 AMP+ PPi+ ossilucife rina+CO 2

❑

La luce prodotta è ri