Sequenziamento del genoma

Metodica per migliorare l'accuratezza del sequenziamento del DNA

Per migliorare l'accuratezza del sequenziamento del DNA, è stata sviluppata una metodica che utilizza degli adattatori. Questi adattatori sono composti da una parte a doppia elica e una parte che non si anneala. Grazie a questa struttura, si forma un loop che permette alla polimerasi di continuare a girare, anche se in realtà è la molecola di DNA che ruota e la polimerasi rimane ferma. Alla fine, viene letta la sequenza ottenuta.

Successivamente, è possibile spezzare le reads a seconda della punteggiatura e ottenere una circular consensus sequence.

Il sequenziamento viene effettuato tramite la metodica SMRT (Single Molecule Real Time) e si sequenziano i pozzetti di dimensioni nanometriche. Questi pozzetti sono fabbricati in un film di metallo depositato su un substrato di diossido di silicone.

Una ZMW (Zero Mode Waveguide) è un foro con un diametro di qualche decina di nanometri, fabbricato in un film di metallo di 100nm depositato su un substrato di diossido di silicone. Ciascun ZMW funge da camera di visualizzazione nanofotonica che fornisce un

Oxford nanopore è una macchina per il sequenziamento che si attacca ad una porta USB; essa ha un numero abbastanza limitato di sequenze che possono

Capitolo 5 – Preparazione delle librerie per NGS

Negli ultimi anni le tecnologie di sequenziamento si sono evolute molto, così come i metodi per preparare gli acidi nucleici e per la costruzione delle librerie. Fondamentale per la NGS è la preparazione di RNA e DNA bersaglio in una forma compatibile per il sequenziamento (al momento non possiamo sequenziare direttamente le molecole di RNA e DNA in forma naturale infatti).

In generale gli step principali per la preparazione di RNA o DNA per le analisi NGS sono:

• Frammentazione della sequenza target in frammenti della lunghezza desiderata (solitamente si ottengono frammenti da 40kb se si parte da materiale fresco, altrimenti solitamente si ottengono frammenti di lunghezza inferiore nel caso si parta da materiale non fresco, in quanto questo risulterà già parzialmente degradato; in entrambi i casi la lunghezza

Deve essere ulteriormente modificata così da ottenere frammenti tra i 500 e le 800pb):

• Conversione della sequenza target in un dsDNA;
• Ligazione di adattatori oligonucleotidici alle estremità dei frammenti target;
• Quantificazione dei prodotti finali della libreria prima del successivo sequenziamento;

Inizialmente si frammenta l'acido nucleico e si procede con il sizing (selezione delle molecole nell'intorno di un determinato peso molecolare ossia di una determinata dimensione), poi si converte il bersaglio in DNA a doppia elica e si attaccano degli adattatori alle estremità del frammento bersaglio (prima si frammenta, dopo si converte e poi si modifica). Alcuni anni fa prima l'RNA veniva trasformato in doppia elica di DNA e poi si frammentava, però si è visto che si ottiene una copertura maggiore di RNA andando a frammentarlo direttamente e poi convertirlo in DNA a doppia elica (in questo modo la trascrittasi inversa).

La domanda è limitata, quindi non è necessario fare sequenziamenti enormi. Gli approcci per frammentare gli acidi nucleici sono fisici, enzimatici o chimici.

Per quanto riguarda la frammentazione attraverso metodi fisici abbiamo:

• Acoustic Shearing (Covaris): viene usata una macchina per rompere il DNA in modo da ottenere frammenti di dimensioni da 100 a 5000bp (si può selezionare la dimensione del DNA finale che vogliamo rompere). Il campione è immerso in un bagnetto, c'è un generatore di onde acustiche che emette onde che vengono assorbite dall'acido nucleico all'interno del tubo (nella zona in cui c'è il focus delle onde), e si ha la rottura del DNA. Esistono tubi di un'altra macchina che frammentano in modo grossolano (da 6 a 20kb) per generare librerie particolari matepair in cui due frammenti lontani nel genoma (anche più di 20 kb) vengono uniti e ricircolarizzati con una sequenza di

• Sonication (Bioruptor): macchina per rompere la cromatina, il DNA e i tessuti in frammenti molto piccoli attraverso impulsi molto brevi.
• Hydrodynamic Shear (Digilab): la macchina consiste in un pistone con un foro e una sorgente di DNA con l'uscita. Girando le valvole il pistone scende, il DNA entra nel foro e girando altre valvole il pistone inizia a fare cicli avanti e indietro sul tubo (il DNA deve passare attraverso una zona di restringimento, quindi l'energia aumenta tantissimo perché per mantenere lo stesso flusso in una sezione molto piccola l'energia aumenta così il DNA esce e si spacca a seconda di quante volte lo si fa passare avanti e indietro). L'importante è che si rompa in modo uniforme, cosa che

• Nebulizers (Life Tech); viene usata una vasca di aerosol che nebulizza microgocce. Nell'aerosol viene messa aria compressa o azoto, che entra in una camera dove c'è il liquido con il DNA che viene schiacciato e fatto passare attraverso un tubo per poi essere sprayato all'interno di un tubo di raccolta (si possono effettuare più passaggi). Anche qua si rompe il DNA in pochi secondi, ma il range di dimensione dei frammenti è grande e si perde del materiale.
• Per quanto riguarda la frammentazione attraverso metodi enzimatici abbiamo:
  • DNasi I o altre endonucleasi di restrizione; viene usata in quanto le rotture meccaniche spesso creano delle estremità irregolari del DNA difficili da riparare enzimaticamente, mentre se la rottura è enzimatica il taglio è pulito (abbiamo blunt o sticky); recentemente è stato messo in commercio un cocktail di enzimi che prende il nome di Fragmentase

(maltose binding protein MBP-T7endonucleasi I, una nucleasi non specifica Vibrio vulnificus Vvn, NEB's) in quanto si è visto che il taglio con la nucleasi I non è aspecifico e tendeva a digerire alcune regioni con maggiore specificità (questo vuol dire che la libreria non diventa rappresentativa di tutto il genoma); il cocktail genera dei nick e un altro enzima taglia e genera i frammenti con estremità 5' protrudenti (per riparare questa estremità e renderla blunt basta mettere una DNA polimerasi che è la T4 DNA polimerasi).

È possibile usare anche un sistema che prevede l'utilizzo di trasposoni per la costruzione di librerie per la massive sequencing parallela (acquistato da Illumina); viene accoppiata la fase di rottura di DNA a doppia elica con la formazione di estremità con degli adattatori (un trasposone è un piccolo pezzo di DNA che copia se stesso in regioni random del genoma tramite un enzima

cheprende il nome di trasposasi). Si può copiare un pezzo del genoma asportando materiale genetico eportandolo in altre zone del genoma. La trasposasi lega degli elementi in modo naturale (dettiinverted repeat), poi quando trova le insertion sequence all’interno del genoma (o delle regionimolto simili), si appaia e avviene la ricombinazione. Hanno modificato la trasposasi così iltrasposone ha la capacità di legarsi al DNA in modo casuale, in quanto non è più guidato dalleregioni invertite e fa l’inserimento del materiale genetico(gli adattatori di nostro interesse). Leinverted repeat non ci sono più, c'è solo la trasposasi con gli adattatori che conosciamo e cheservono per il sequenziamento e c'è anche un barcode. Se noi bilanciamo la quantità di DNAgenomico con quella dei trasposoni questi si attaccano in modo random e si ottimizza il tutto inmodo che si attacchino ogni 300 bp (ad esempio), ma se