Sequenziamento delle proteine

Il secondo step è la spettrometria di massa.

Lo spettrometro di massa (MS) è in grado di identificare la sequenza

dei peptidi misurandone il rapporto tra massa e carica ovvero la

frazione m/z, dopo essere stati trasformati in composti carichi e in fase

gassosa.

Noi partiamo da un insieme di peptidi neutri o con bassa carica, quindi

prima dobbiamo caricarli a sufficienza cioè produrre la fonte ionica:

1) I peptidi digeriti dalla tripsina sono solubilizzati in un solvente

polare e volatile.

2) Vaporizzazione della soluzione, cioè la trasformazione in gocce

volatili, grazie all uso di gas elio (He) e pressione atm

Evaporazione del solvente grazie all uso di gas azoto (N2)

detto drying gas perché riscalda

3) Applicazione di alta tensione per formare un aerosol di gocce

cariche

4) Applicazione di un campo magnetico variabile, in cui i peptidi

carichi si muovono, con traiettorie differenti a seconda del

rapporto m/z.

Lo sdm viene collegato al nano-HPLC. Le frazioni vengono pompate

automaticamente nello sdm una alla volta.

In ingresso viene iniettata la soluzione proteica proveniente dall

HPLC che effettua lo step di purificazione.

I peptidi vengono convertiti in fonte ionica grazie a un sistema di

Ionizzazione ElettroSpray (ESI), che è una delle tecniche di

Ionizzazione a Pressione Atmosferica (API), adatta per molecole

polari. Sfrutta l elio come gas nebulizzante che viene immesso insieme

alla soluzione all interno di un capillare, in modo da generare gocce di

prot+solvente. L aggiunta di azoto come drying gas va a far

evaporare il solvente così che rimangano gocce volatili di soli

peptidi. Poi l alto voltaggio carica le gocce.

L analizzatore di massa è una trappola ionica a quadripolo. Questa

configurazione insieme all applicazione di un campo magn var

conferisce un moto oscillatorio e fa sì che solo i peptidi con un certo

valore di m/z possano raggiungere il rilevatore.

Il rilevatore o detettore riporta su un istogramma i gruppi di peptidi

organizzandoli sulla base del m/z e della relativa abbondanza.

La risoluzione dello strumento indica la capacità di distinguere due

picchi, ovvero di distinguere tra due diversi valori di m/z. Questo

dipende da FWHM (Full Width at Half Maximum), che deve essere

minimizzata per avere alta risoluzione, ovvero vogliamo che la

differenza minima tra due valori di m/z che possa essere percepita dallo

strumento sia +bassa possibile.

La trasmissione indica il rapporto tra il numero di ioni generati

nella fonte ionica e il numero di ioni che arrivano al rilevatore.

L accuratezza indica la differenza tra la massa osservata e quella

teorica.