Sequenziamento DNA

Il sistema SOLID è una piattaforma per il sequenziamento in parallelo di

segmenti di DNA amplificati in modo clonale e legati a sferette magnetiche. La

metdologia di sequenziamento è basatta sulla ligazione sequenziale di

oligonucleotidi marcati con fluorocromi. Il sistema SOLID può generare fino a 3

Gbp di dati di sequenza con un accuratezza superiore al 99%. Il

sequenziamento SOLEXA è invece una piattaforma per il sequenziamento in

parallelo di segmenti di DNA amplificat in modo clonale legati a sferette

magnetiche (cioè???? È uguale?). La metodologia di sequenziamento è basata

dulla sintesi sequenziale di oligonucleotidi attraverso l’uso di terminatori

dideossi reversibili. Il sistema SOLEXA può generare oltre 1 Gbp anche in

questo caso con un accuratezza superiore al 99%.

Il pirosequenziamento è un approccio sequenziale altamente innovativo e

permette di ottenere in poche ore centinaia di migliaia di sequenze geniche,

circa 10-20 milioni di bai, contro le poche centinaia ottenute con tecnlogie le

precedenti, nello stesso lasso di tempo. Questa tecnologia si basa sul dosaggio

del pirofosfato liberato in seguito di un attacco di dNTP al filamento

polimerizzato e si sviluppa attraverso 5 fasi:

1) La sequenza da analizzare, dopo essere stata amplificata con la PCR,

viene incubata come singola elica insieme agli enzimi DNA polierasi, ATP

solforilasi, luciferasi e apirasi e ai substrati adenosin solfo fosfato (ASP) e

luciferina;

2) Uno dei quattro dNTP è aggiunto ala reazione. La Dna polimerasi

catalizza l’aggiunta della base solo se è complementare cn il residuo del

templato. In tal caso si ha concomitante liberazione di pirofosfato

inorganico PPi;

3) Il Ppi così prodotto viene trasformato in ATP, ad opera della solforilasi e

usando l’ASP come substrato. L’ATP ottenut consente la conversione della

luciferina ad ossiluciferina ad opera della luciferasi con produzione di un

segnale luminoso che viene rilevato da un apposita camera fotosensibile

(CCD);

4) L’enzima apirasi degrada il dNTP che non è stato incorporato e l’ATP

prodotto dalla solforilasi. Solo quando la degradazione è terminata si

aggiunge un secondo dNTP per far progredire la reazione di

polierizzazione (ritorno alla fase 1);

5) Si aggiungono ciclicamente tutti i 4 dNTP fino alla deduzione completa

della sequenza.

Il segnale luminoso prodotto ogni volta dalla luciferina viene registrato in un

apposito pirogramma.