Sequenziamento DNA

Sequenziamento del DNA

La determinazione della sequenza nucleotidica del DNA è lo strumento d'eccellenza per l'individuazione e caratterizzazione di mutazioni. I metodi per il sequenziamento del DNA sono stati sviluppati alla fine degli anni '70 e hanno rivoluzionato la scienza della genetica molecolare.

Metodi di sequenziamento del DNA

I due metodi di sequenziamento del DNA descritti nel 1977 si differenziano considerevolmente nel principio:

• Il metodo di Sanger, definito anche terminazione della catena con dideossi, coinvolge la sintesi di un filamento di DNA da uno stampo a singolo filamento da parte di una DNA polimerasi.
• Il metodo di Maxam e Gilbert, definito anche degradazione chimica, implica la degradazione chimica del DNA originale.

Entrambi i metodi producono popolazioni di polinucleotidi marcati radioattivamente che iniziano in un punto fisso e terminano in punti che dipendono dalla collocazione di una particolare base nel filamento di DNA originale. Tali polinucleotidi possono poi essere separati tramite elettroforesi su gel di poliacrilamide e la sequenza nucleotidica può essere letta direttamente da un'autoradiografia del gel.

Diffusione e utilizzo del metodo di Sanger

Sebbene entrambe le tecniche siano usate ancora oggi (il metodo di Maxam molto poco), il metodo di Sanger è di gran lunga la tecnica più popolare e più largamente impiegata per la determinazione di sequenze nucleotidiche. Questo processo è stato semplificato grazie ai continui progressi tecnologici: la reazione è stata ciclizzata mediante la tecnologia PCR moderna e innovative strumentazioni di elettroforesi capillare, congiunte all'impiego di fluorocromi e a software computerizzati, hanno reso automatizzabile l'interpretazione del dato.

Dettagli del metodo di Maxam e Gilbert

Il metodo di Maxam e Gilbert è basato sulla degradazione del DNA in piccoli frammenti a doppio filamento. Questa tecnica in realtà è molto poco usata sia perché non è possibile automatizzarla sia perché fa uso di sostanze particolarmente tossiche e pericolose per la salute. Questo metodo si differenzia da tutte le altre tecniche perché NON usa tecniche enzimatiche ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidi. I frammenti di DNA a doppio filamento vengono prodotti o per frammentazione oppure per digestione enzimatica. In entrambi i casi le molecole a doppio filamento devono essere convertite in molecole a singolo filamento e marcate terminalmente.

La tecnica quindi inizia con la purificazione del DNA da sequenziare che viene marcato radioattivamente con P³². Il campione di DNA così marcato viene denaturato con DMSO in modo da generare filamenti di DNA a singola elica. Il campione viene diviso in 4 aliquote ognuna delle quali viene trattata con un reagente diverso in grado di metilare o rompere specifiche basi. I reagenti usati sono:

• DMSO + Piperidina
• DMSO + Piperidina + Acido formico
• Idrazina + Piperidina
• Idrazina + Piperidina in NaCl 1,5M

Il DMSO è in grado di metilare la guanosina ed in maniera minore l'adenosina. La piperidina invece porta sia alla perdita della base metilata sia alla rottura dello scheletro zucchero-fosfato in corrispondenza della