seminario microbiologia

Preparazione del terreno in laboratorio

Per preparare 1 litro di terreno LB, seguire i seguenti passaggi:

1. Fare le opportune pesate per la preparazione di 1 litro di terreno LB: triptone 10 g, estratto di lievito 5 g, NaCl 10 g, agar 10 g.
2. Versare in un beker 900 ml di acqua distillata.
3. Aggiungere un magnete e mettere in agitazione su una piastra riscaldante.
4. Versare delicatamente le polveri pesate nel beker, escluso l'agar, e agitare finché la soluzione non diventa omogenea.
5. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato e portare a volume (1 litro) con acqua distillata.
6. Trasferire la soluzione in due bottiglie (500 ml ciascuna) e sigillarle opportunamente.
7. Aggiungere la polvere di agar (al 2%) nella bottiglia predisposta per il terreno LB solido.
8. Sterilizzare in autoclave per 15 minuti.

Dopo la sterilizzazione, far raffreddare il terreno fino a circa 45 °C.

Siglare 25 piastre Petri con il nome del

terreno(LB) e prepararle sul piano di una cappa aflusso laminare, togliendo il coperchio.

• Versare delicatamente il terreno LB agar nelle piastre (circa 20-25 ml per piastra) facendo attenzione a non provocare la formazione di bolle.

Preparazione del terreno in lab

• Lasciare solidificare il terreno senza spostare le piastre.

• Utilizzare le piastre LB agar e il terreno LB liquido oppure conservarli a 4°C.

Come faccio ad isolare E.coli?

• dell’Escherichia Conoscere le caratteristiche coli :

• e’ un batterio gram-negativo di interesse sia medico che di salute pubblica.

• È anaerobio facoltativo

• Fermenta il glucosio o lattosio;

• E’ Negativo al test dell’urea;

• È catalasi-positivo;

• È ossidasi-negativo.

1. COLORAZIONE DIGRAM

2. SEMINA DELLE COLONIE

• Siglare il fondo di due piastre di terreno LB agar.

• Con un'ansa sterile prelevare 10-20µl da una Escherichia coli coltura liquida di partenza

di edepositarli in una posizione periferica dellapiastra.

• Con la stessa ansa distribuire poi la coltura inuna regione più estesa della piastra.
• Chiudere le piastre con il coperchio,capovolgerle ed incubarle a 37°C per 12-15ore.
• Dopo l'incubazione osservare gli isolamentiottenuti.
• Prendere una colonia e metterla in incubazionesu terreno agar sangue, in quanto da coloniecaratteristiche per E.coli.

3. TEST DIFERMENTAZIONE DELLATTOSIO

• Si semina la colonia prelevata dal terreno LB ela si semina su terreno McConkey Agar, checontiene come zucchero il lattosio

4. TEST DIANAEROBIOSI

• Si stempera la colonia presente su terreno LBin un terreno liquido
• I batteri anaerobi tendono a rendere torbido ilterreno, depositandosi sul fondo, mentrel'E.coli, che è facoltativo, renderà il terrenosolamente leggermente torbido

5. TEST DELL'UREA

• Identifica quei organismi in grado di idrolizzarel'urea per produrre

ammonio e CO2. Questotest puo’ essere sia con terreno solido cheliquido6.

TEST DELLA CATALASI

• La catalasi è un enzima, prodotto da microrganismiche vivono in ambienti ossigenati per neutralizzarele forme tossiche di metaboliti dell’ossigeno,H2O2, che viene scisso in H2O e O2.
• Test dei vetrini
• Trasferire una piccola quantità di colonia batterica su unasuperficie di un vetrino pulito ed asciutto;
• Posizionare una goccia di H2O2 al 3% sul vetrino emescolare con un’ansa sterile;
• Un risultato positivo deriva dalla rapida produzionedell’ossigeno (entro 5-10 sec.);
• Un risultato negativo non determina produzione di bolle ola produzione solo di alcune bolle sparse.

positivo

TEST DELL’OSSIDASI

• L’enzima citocromo ossidasi svolge un importanteruolo durante il trasporto di elettroni della catenarespiratoria. Soltanto alcuni batteri possiedono taleenzima respiratorio e la sua presenza può essere

Un carattere identificativo, che può essere messa in evidenza mediante un semplice test:

• Si prende una petri vuota sulla quale si dispongono dei dischetti imbevuti di una sostanza cromogena.
• Si posiziona qualche goccia di coltura, coltivata in terreno liquido.
• Attendere 10-15 minuti per la reazione colorimetrica.
• Il substrato artificiale interagisce con il citocromo ossidasi formando un composto di colore blu scuro (indofenolo).

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