Riproduzione cellulare, fecondazione e tessuti

La cellula si riproduce

Il nostro corpo è costituito da due tipologie di cellule: cellule differenziate e cellule staminali. Quelle staminali sono in grado di riprodursi, dividersi e dare luogo a nuove generazioni cellulari. In tutti i distretti tissutali sono presenti in quantità variabile distretti staminali, dunque tutti i tessuti sono in grado di rinnovarsi. Alcuni si rinnovano continuamente (epidermide), altri più lentamente (il fegato). Sono pochissime le tipologie cellulari identificate come perenni. Le cellule staminali sono state evidenziate anche nel tessuto nervoso. Anche nel tessuto cardiaco sono state identificate cellule staminali. Le cellule uovo non si rinnovano (oociti), ma secondo alcuni ci sono delle cellule staminali che sono in grado di produrne di nuove.

Nelle cellule del corpo le cellule staminali sono ovunque, ma hanno minore capacità rispetto a quelle del nodo embrionale (perdono la memoria di costruzione). La capacità delle cellule staminali di dividersi: producono a ciascun ciclo due cellule figlie da ogni cellula madre e queste due possono entrambe rimanere staminali, oppure una differenziarsi e una rimanere tale, oppure differenziarsi entrambe. Ciò dipende dalle situazioni che possono essere normali o patologiche. In condizioni normali devono mantenere il gruppo di cellule staminali, ma anche produrre cellule differenziate. Quando ho un’urgenza per tamponare una ferita arrivano tanti segnali dall’ambiente che fanno costruire nuove cellule staminali per poi differenziarle per riparare il tessuto leso.

Processo differenziativo

Il processo differenziativo inizia nei primi momenti della nostra vita. Nei primi giorni di vita l’embrione fluttua nell’ovidotto e si mantiene nelle tube uterine fino a quando va ad impiantarsi e va a inattivare il cromosoma X. Inizia anche il differenziamento cellulare quando si impianta. Questo processo avviene durante lo sviluppo del feto, ma anche in qualsiasi momento del corpo adulto. Decine di milioni di cellule si replicano ogni secondo nel nostro corpo e iniziano a differenziarsi. Da cellule indifferenziate (cellule tondeggianti), poi iniziano a prendere forma e funzioni completamente diverse. C’è anche la possibilità di differenziare le cellule in laboratorio con tanti diversi metodi (tranne i globuli rossi poiché non hanno il nucleo) fino a riacquisire una capacità staminale.

L'isa per malattie.

Ciclo cellulare mitotico

Si tratta delle diverse fasi attraverso cui la cellula passa per potersi dividere, sono tutte fasi necessarie. Il ciclo cellulare delle cellule somatiche è differente da quello delle cellule germinali, ma entrambi li possiamo dividere in due fasi principali:

• Interfase
• La fase M di divisione fisica della cellula. M sta per meiosi o mitosi.

L’interfase può essere a sua volta suddivisa in sottofasi che sono la G1, la S e la G2. Dove G sta per growth. La cellula si accresce. La G1 segue la fase M e derivando da una cellula madre, essendo il prodotto di una divisione, deve ricostruire tutta una serie di organelli, incluso il citoscheletro, ed è più piccola. Ha dunque un alto metabolismo, sta producendo tanti trascritti, tante proteine per riportarsi a un livello quantitativo caratteristico di un particolare tipo cellulare. Poi la cellula entra in fase S dove S sta per sintesi, è una fase di replicazione del DNA poiché se da una cellula dividendo ne ottengo due con lo stesso corredo cromosomico, devo replicare il genoma. Ciascuna fase è un momento di preparazione della fase successiva. In G1 non solo accresco il numero di organelli, di RNA, ma produce anche delle molecole necessarie alla fase successiva, dunque se devo replicare il DNA, mi serve la DNA polimerasi, l’elicasi e tutta una serie di proteine necessarie a questo processo, ma oltre a queste proteine enzimatiche servono anche quelle istoniche. Tutto ciò inizia ad essere prodotto nella fase G1.

La fase G2 è anche lei una fase di preparazione alla mitosi, si ha il disassemblamento del citoscheletro per poi riassemblarli e formare i microtubuli del fuso mitotico. La fase M è a sua volta suddivisa in sottofasi:

• Profase
• Prometafase
• Metafase
• Anafase
• Telofase
• Citodieresi

Divisione fisica vera e propria della cellula madre in due cellule figlie. G1, S, G2, M questo è ordine, tranne nelle prime fasi di vita dell’embrioncino in cui la fase G1 è brevissima, la cellula esce dalla M e quasi subito entra in S poiché c’è la volontà di dividersi velocemente, per produrre nuove cellule. La fase G1 infatti è la più lunga del ciclo cellulare, ma varia, può anche essere brevissima.

La cellula uovo è la cellula più grande nei mammiferi e da una cellula (cellula uovo appunto) se ne ottengono più di cento più piccole, riducendo la fase di crescita (ovvero le G). Questo si ha nella blastocisti (da una cellula a 100).

Alcuni metodi di studio

Ci sono diversi metodi per studiare il ciclo cellulare, quelli maggiormente utilizzati sono:

• La citometria statica
• Quella sul vetrino con anticorpi colorati
• La citofluorimetria (che si avvale di sonde, di anticorpi che sono fluorescenti e in grado di legarsi a uno specifico antigene di superficie o interno alla cellula).

In un contesto clinico è lungo preparare un vetrino (devo fissare le cellule ecc…) allora si usa la citofluorimetria a flusso che utilizza le stesse conoscenze della citofluorimetria statica, dunque le cellule vengono marcate con gli anticorpi fluorescenti, ma si usa un citofluorimetro a flusso e le cellule sono in sospensione (ovvero all’interno di una provetta), attraverso un tubo le aspiro (si mettono una dietro l’altra) e le metto in un’altra provetta che le raccoglie e le cellule quando escono in quest’ultima vengono intercettate da un raggio laser (fonte luminosa) che se erano marcate da un anticorpo fluorescente emettono fluorescenza.

(2c quantità → Da una fase S (in cui duplico il DNA) alla fase G2 o M ho DNA duplicato DNA cellula diploide, 2n invece il numero di cromosomi). Il c definisce la quantità in picogrammi, ogni base di DNA ha un peso particolare, il DNA umano è 7,4 picogrammi, quello di topo 7,2 picogrammi. Colorando le cellule con quantità differenti di fluorescenza riesco a capire le diverse fasi del ciclo cellulare. La quantità di fluorescenza è proporzionale alla quantità di DNA poiché sono coloranti intercalari (entrano nel DNA). Il citofluorimetro riesce ad analizzare fino a 5-7 mila cellule in un secondo. Il risultato dunque è un istogramma in cui avrò sull’ascissa la quantità di DNA, sull’ordinata il numero di eventi. Abbiamo due picchi, uno corrisponde a G1, l’altro a G2 M, lo strumento non riesce a distinguere questi ultimi poiché c’è la stessa quantità di DNA. Nella gobba, in fase S sono le cellule che stanno replicando il DNA. Quante più cellule ritrovo in G2 M tanto maggiore è la frequenza di replicazione delle cellule. In fase tumorale il secondo picco sarà maggiore. G0: le cellule si dividono, cellula madre e cellule figlie e a loro volta le cellule figlie possono rientrare in fase G1. Quando la cellula inizia a differenziarsi esce dal ciclo cellulare e entra nella fase che chiamiamo G0, può essere un’uscita transitoria, come uno stato di quiescenza che è necessaria per poter tamponare situazioni in cui è necessario che il tessuto si rinnovi velocemente. La capacità proliferante dei tessuti con la vecchiaia diminuisce e questo è collegato anche alla diminuzione delle cellule di riserva, quelle quiescenti, le cellule in G0 infatti possono tornare a ciclare oppure differenziarsi.

Come inizia il differenziamento?

Il differenziamento secondo alcune ipotesi dipende dalla posizione, in ogni distretto tissutale esiste un compartimento staminale e poi un compartimento differenziale o differenziato. Nell’epitelio per esempio abbiamo una lamina basale con appoggiate delle cellule staminali, poi abbiamo tanti strati (è pluristratificato). In base alla posizione la cellula riceve segnali differenti che indicano alla cellula se rimanere nel ciclo cellulare o entrare in fase G0 per iniziare a differenziarsi.

• Cellule ciclanti
• Cellule quiescenti in G0
• Cellule terminalmente differenziate che sono le più frequenti nell’organismo.

In fase G1 e G2 la cellula ha un’altissima attività di sintesi di proteine, di RNA e fattori di regolazione, ma anche proteine istoniche. La cellula in G1 immagazzina una quantità tale di RNA messaggeri per la sintesi di istoni che verranno poi utilizzati per la sintesi proteica in fase S. RNA e proteine vengono sintetizzate e prodotte in tutta l’interfase. La trascrizione invece nella fase M viene bloccata.

Analizziamo ora le varie sottofasi della fase M:

Profase:

Ciascuna delle varie fasi è riconoscibile per degli eventi specifici. Nella profase si ha:

• La disgregazione dell’involucro nucleare. Esso viene ricostituito nelle cellule figlie o poco prima che la cellula madre si divida completamente a partire dal reticolo endoplasmatico.
• La cromatina inizia a condensarsi sempre più fino a quando arriviamo in metafase.
• Scomparsa nucleolo.
• Iniziano a formarsi i centrosomi a partire dai microtubuli prodotti durante la G2, due strutture proteiche che si disporranno ai due lati opposti della cellula con la funzione di ancorare i microtubuli del fuso a mano a mano che questi si formano. La formazione dei microtubuli è dovuta alla fusione di tante proteine di microtubuli unite l’una alle altre. Questa componente proteica di ancoraggio nel complesso si chiamano centrosomi, nello specifico centriolo dal quale dipartono i microtubuli del fuso. All’interno dei centrosomi dunque si hanno i centrioli.

(Nella transizione dalla profase alla metafase prometafase: il primo punto metafase, chiamiamo metafase invece il momento in cui lo spostamento dei cromosomi sulla piastra equatoriale termina (secondo punto). I cromosomi possono essere a una sola doppia elica (un cromatidio) oppure due doppie eliche (cromatidi fratelli)).

Metafase:

Dai centrioli si allungano i microtubuli del fuso e mano a mano che si allungano vanno a cercare un cromosoma, in particolare si legherà al suo centromero, nello specifico in una regione proteica detta cinetocore. Centromeri non contengono sequenze trascrivibili, hanno DNA altamente ripetuto (sequenze TA) i microtubuli li spingono verso il centro della cellula per andare a costituire una piastra metafasica. La compattazione nel contempo è progredita e ha raggiunto il massimo della compattazione. Possiamo dunque costituire il cariotipo. I cromatidi di ciascun cromosoma possono essere dunque separati in ciascuna delle due cellule figlie.

In G1 il cromosoma è costituito da un unico cromatidio. Chiamiamo cromatidio la doppia elica di DNA avvolta sugli istoni e compattata. Al termine della fase S, dunque in G2, il DNA è stato replicato e quindi il nostro cromosoma apparirà con due cromatidi. Ciascuno di questi due cromatidi è costituito da una doppia elica. In metafase dunque i cromosomi sono costituiti da due doppie eliche: un cromatidio è rivolto verso un polo della cellula e l’altro verso l’altro polo.

Anafase:

I microtubuli del fuso retraendosi possono staccare i due cromatidi dal punto di fusione e ripartirli nelle due cellule figlie. A livello del centromero avviene la rottura.

Telofase:

I cromosomi si spostano ulteriormente verso i due poli opposti della cellula e raggiungono i due apparati centrosomici che nel frattempo si vanno dissolvendo. Raggiunti i due poli opposti avviene la ricostituzione dell’involucro nucleare. Dunque l’involucro nucleare che avvolgerà i due nuovi genomi si forma prima della divisione fisica della cellula. Scompaiono i centrosomi e nella zona equatoriale, attorno alla membrana cellulare, si forma un involucro proteico, un anello proteico di actina, il cui diametro si riduce sempre di più. Questa riduzione di diametro porta alla strozzatura della cellula fino alla sua separazione fisica nelle due cellule figlie. Nel frattempo il nucleo si è formato e i cromosomi all’interno del nucleo cominciano a de-condensarsi. La cellula sta per completare la fase M e rientrare in G1 dove riprende l’attività trascrizionale.

Quando il fuso raggiunge la metafase si blocca grazie ad una molecola presente nel terreno di coltura, dunque si possono avere cellule sincronizzate nello stesso momento. Cambiando il terreno di coltura le cellule riprendono a dividersi ma in modo sincronizzato, a parte alcune eccezioni. Questo era il processo mitotico, ovvero ciò che avviene ogni secondo all’interno del nostro corpo al maggior numero delle cellule, poi esiste anche la meiosi che presenta analogie, ma anche differenze.

La meiosi

Avviene all’interno delle gonadi (testicolo e ovario) e avviene all’interno di due processi che si chiamano spermatogenesi e oogenesi. La meiosi maschile e quella femminile sono identiche. Molto diverse sono invece le tempistiche con cui avvengono le due meiosi, avviene la stessa cosa, ma con tempi diversi. La meiosi femminile, per esempio, inizia già durante la vita fetale, mentre quella maschile ha inizio solo nella pubertà (nell’uomo a 12-13 anni, nel topo intorno ai due/3 mesi per la spermatogenesi, per l’oogenesi intorno al terzo mese nella donna, nel topo dopo due settimane). La meiosi femminile inizia durante la vita fetale e si blocca alla nascita per riprendere poi con la pubertà, dunque intorno ai 14-15 anni. C’è una grossa variabilità e recentemente l’inizio dell’età puberale nelle ragazze è stato molto anticipato.

Le differenze tra la meiosi maschile e femminile continuano, oltre alle tempistiche, anche nelle modalità. Un’altra importante differenza è che quando la meiosi maschile inizia continuerà per tutta la vita, invece quella femminile dopo che ha ripreso nella pubertà termina con la menopausa intorno ai 50-55 anni. La vita riproduttiva maschile dura quanto la vita dell’individuo, invece quella femminile è limitata a circa 40 anni. La spermatogenesi è un processo continuo e da una cellula staminale che si chiama spermatogonio vengono prodotti quattro spermatozoi al termine dalla meiosi (partendo da uno) durante la meiosi femminile da una cellula staminale (oogonio) viene prodotto un solo oocita poiché le altre tre cellule prodotte durante la meiosi identica a quella maschile vengono eliminate.

Questa differenza è importante perché nel singolo oocita viene mantenuto tutto il citoplasma derivante dalle divisioni cellulari, dunque tutti i determinanti molecolari necessari a determinare lo sviluppo successivamente alla fecondazione. La spermatogenesi è un processo continuo, vengono prodotti continuamente gli spermatozoi, la oogenesi è un processo discontinuo e ciclico. Dunque a partire da una riserva fissa di oociti che la femmina possiede alla nascita periodicamente alcuni di questi vengono reclutati, maturati e ovulati. Alla nascita, nella gonade femminile sono presenti circa diecimila oociti. La stragrande maggioranza dunque non verrà mai ovulata: se prendiamo la nostra specie che ovula un singolo oocita ogni 28 giorni, ne ovulerà circa 13-14 all’anno, arrotondando per difetto a 10, in 40 anni di attività riproduttiva verranno ovulati circa 400 oociti su 10 mila presenti nell’ovario. La topolina circa 7-10 oociti ogni quattro giorni, ma vive circa 1 anno e mezzo. La riserva di cellule uovo che la femmina ha dopo la nascita rimane pressoché invariata dunque, sono diverse migliaia di oocite e solo alcune centinaia vengono ovulate.

Anche se ci sono queste importanti differenze il processo meiotico rimane identico nei due generi. L’obiettivo principale del processo meiotico è quello di ridurre il corredo cromosomico, dunque il genoma, da un contenuto diploide come le cellule staminali (oogonio e spermatogonio) a quello aploide, ovvero dimezzarlo. Questo avviene attraverso due successive divisioni cellulari: la meiosi 1 e la meiosi 2. Il cariotipo deve essere ridotto da due n = 46 a 2n = 23 poiché unendosi l’oogonio con lo spermatocita riformeranno il cariotipo standard (46 cromosomi).

Il processo meiotico prevede due divisioni:

1. Una prima definita come riduzionale perché riduce il numero cromosomico.
2. La seconda è una divisione equazionale molto simile alla mitosi.

Per poter comprendere come avviene il processo meiotico è importante la differenza tra 2n e 2c (2n=numero cromosomi, 2c =quantità DNA, che definisce anche il numero di cromatidi). In G1 la cellula umana ha 2n= 46 e per convenzione ha 2c, che corrisponde a un singolo cromatidio, infatti per ciascun cromosoma la cellula ha un cromatidio in G1. Siamo in G1 e la cellula fa un ciclo cellulare (G1, S, G2, M con M qui che indica la meiosi uno M1= profase uno, metafase 1, telofase 1 e citodieresi).

Entra ora in G2 e con un assetto cromosomico costituito da due cromatidi, entra poi in fase M, ovvero nella M1: profase: i cromosomi condensano, scompare l’involucro nucleare, si formano i centrosomi, il fuso acchiappa i cromosomi e li porta verso l’equatore, ma a differenza della mitosi i cromosomi si dispongono qui in modo da avere su un lato un omologo e dall’altro l’altro omologo. Il numero di cromosomi è rimasto invariato, ma il numero di cromatidi è raddoppiato, è aumentata la quantità di DNA. Dunque la cellula entra in meiosi uno 2n=46 e 4C.