Fecondazione artificiale e patologie della riproduzione

Clinica ostetrica 1: Patologia della riproduzione e fecondazione artificiale

Esame

Parte pratica (riconoscere e descrivere l’uso della strumentazione) + parte teorica. Si può dare l’esame a fine semestre solo se si ha dato anatomia patologica.

Fecondazione artificiale

Alcuni sostengono che per scaldare la pailette si debba strofinarla tra le mani. Secondo la professoressa, assolutamente no!

Vantaggi della fecondazione artificiale

• Vantaggi e progresso della genetica
• Economicità
• Sicurezza: non si usano animali positivi a infezioni, ecc.
• Flessibilità: posso fecondare superando barriere geografiche e politiche. Ad esempio, se voglio far accoppiare una cagna con un cane inglese, la cagna dovrebbe stare in quarantena per poter entrare in Inghilterra, mentre con l’inseminazione artificiale posso evitarlo.
• Inoltre si può usare il seme conservato di animali morti.

Svantaggi della fecondazione artificiale

• Necessità di individuare l’estro individualmente (ogni specie ha un preciso ciclo estrale e un momento ideale dell’estro per l’inseminazione in base all’ovulazione)
• Minore probabilità di gravidanza: il maschio sa quando accoppiarsi, è più preciso
• Ipofertilità: la riduzione della fertilità determina calori ripetuti e repeat breeding
• Imparentamento di massa: comporta il manifestarsi di malattie genetiche.

Il seme è composto dagli spermatozoi e da una parte liquida.

Raccolta del seme nel toro

• Il congelamento non è possibile per stallone e verri perché non funzionante e minor tasso di fecondità;
• La raccolta del seme non deve arrecare stress o traumi fisici all’animale;
• Prima si usava l’elettroeiaculazione, che si basa sull’utilizzo di scariche elettriche. Si pratica nel midollo lombare, a livello del plesso eiaculatore. È una pratica cruenta e dolorosa. Si usa l’elettroeiaculatore nell’ariete per fare l’esame dell’eiaculato. Non si può usare per l’inseminazione artificiale.

Prelievo del seme: la vagina artificiale è costituita da un tubo rigido nel quale si inserisce una guaina che delimita uno spazio. Ci sono 2 valvole: una per l’acqua e una per l’aria. Si aggiunge un cono di raccolta a cui attacco una provetta. Il cono di raccolta e la provetta devono venir coperte per evitare sbalzi termici e luce solare diretta. Nel toro si utilizza acqua calda con T=38-39°C, necessaria per l’eiaculazione.

• Ariete e toro non eiaculano se la T non è adeguata.
• Il pene del toro, del verro, dell’ariete e del becco è di tipo fibroelastico. L’allungamento del pene avviene per rilascio della S peniena, tenuta in sito dal muscolo retrattore.
• Ghiandole annesse nel bovino: tutte bulbo-uretrali, prostata (sia disseminata sia il corpo), vescichette seminali.
• L’acqua è spermiotossica.
• Il seme si preleva in ambiente tranquillo, con pazienza, rispettando i tempi dell’animale che non deve mai essere sgridato.
• Posso far saltare il toro su una femmina non in estro, oppure su manichini con ruota.
• Nei centri di raccolta ogni toro ha la propria vagina artificiale che deve essere lavata e sterilizzata ogni volta.

Raccolta del seme nell'equino

• Il pene del cavallo è di tipo ematico. L’allungamento/ingrossamento è dato del riempimento dei corpi cavernosi.
• Ghiandole annesse nell’equino: tutte. Pene ematico.
• Lo stallone è notevolmente sensibile alla temperatura.
• Gli stalloni sono sensibili e pretenziosi. Non tutti accettano di saltare sul manichino.
• Vagina artificiale per lo stallone: tubo + valvola + manico. Guaina che crea uno spazio tra la struttura rigida e la guaina. La guaina è monouso oppure individuale per ogni soggetto. Alla vagina artificiale si attacca un flacone perché il volume dell’eiaculato dello stallone è abbondante.
• Le guaine possono essere di diverso tipo: guaina Missuri, guaina doppia, di pelle, che si può riempire di acqua. (all’esame le guaine possono essere solo Missuri o Colorado).

L’acqua della vagina artificiale per lo stallone deve essere a 32°C. Deve essere a temperatura ottimale, altrimenti non eiacula. Lubrificare la vagina artificiale con gel non spermiotossico.

• Lavare il pene in erezione, soprattutto nella fossetta uretrale, prima del salto.
• Preparare la cavalla se lo stallone non salta sul manichino. Alla cavalla vanno messe le balze, perché soprattutto se non è in estro potrebbe calciare. Si deve poi legare la coda della cavalla, in modo che i crini non vadano a lesionare il pene. Si mette la cavalla alla sbarra, con al di là l’operatore.
• Dare il tempo necessario al corteggiamento. Quando poi lo stallone effettua il salto si deve deviare il pene e introdurlo nella vagina artificiale finché non eiacula.
• Manichino: solo alcuni si abituano a saltare sul manichino, alcuni saltano sul manichino solo in presenza della cavalla. In questo caso il manichino è messo in posizione strategica perché non sia pericoloso per gli operatori. Alcuni manichini hanno altezza regolabile e una protuberanza da mordere (per rispettare l’etogramma).
• La cavalla è a fotoperiodo positivo, quindi generalmente sono fertili e si accoppiano in primavera. Gli stalloni eiaculano tutto l’anno ma nel periodo non riproduttivo il seme è ricco di gel, con una concentrazione di spermatozoi molto minore.

L'eiaculato dello stallone è frazionato

1. Secreto delle ghiandole bulbo-uretrali: serve per pulire l’uretra ed è privo di spermatozoi.
2. Liquido spermatico, testicolare.
3. Liquido della prostata e delle vescichette seminali.

Prelievo del seme nell’ariete

• Ghiandole annesse all’apparato genitale dell’ariete: tutte ma la prostata è solo disseminata.
• Si fa in modo parafisiologico e in modo da non ferire l’animale.
• La temperatura della vagina artificiale deve essere specifica per la specie.
• La vagina artificiale consta di una parte rigida, che può essere diversa a seconda della specie, di una guaina, di un raccoglitore e una provetta. La valvola serve per introdurre l’acqua calda e anche per l’aria.
• Il seme di un ariete è poco abbondante, circa 1-1,5 ml.
• L’addestramento dell’ariete inizia dalla nascita. Se l’ariete non è addestrato non si riuscirà mai a fare un prelievo di seme.
• Per fare dei controlli sul seme in arieti che non sono addestrati, si usa l’elettrostimolazione.
• L’operatore che deve addestrare l’ariete inizia da quando questo è piccolo e lo abitua a farsi toccare la pancia e il pene.
• Ogni ariete dovrebbe avere la propria vagina artificiale personale, che va smontata, lavata e sterilizzata ogni volta.
• Mai sgridare gli arieti, dare sempre rinforzi positivi.
• Per addestrare gli arieti si usa, inizialmente, una pecora come manichino.
• Già da quando sono piccoli, gli agnelli si portano dove c’è una pecora in estro per abituarli.
• Pene fibroelastico.

Prelievo del seme nel verro

• Ghiandole annesse all’apparato genitale del verro: tutte, molto sviluppate le bulbo uretrali.
• Il seme del suino si può refrigerare a 16°C circa;
• Rispetto alle altre specie, nel verro e cane non è importante la temperatura. Il verro non è sensibile alla temperatura ma è sensibile alla pressione. Quindi anche la vagina artificiale è diversa.
• Pene fibroelastico, l’allungamento del pene si ha per rilascio della S peniena, non per ingorgamento dei vasi.
• Il locale di prelievo si trova vicino al laboratorio e vicino al locale in cui sono tenute le scrofette alla prima inseminazione e le scrofe adulte (locale erotico). Ambiente particolarmente tranquillo, areato a temperatura costante di circa 20°, pulito e facilmente lavabili.
• Anche il verro deve essere addestrato fin da piccolo: va fatto famigliarizzare con le scrofe (all’inizio non mettere scrofe troppo grandi perché si inibiscono) e gli si fa vedere il salto di verri già addestrati in modo che impari per imitazione.
• Il verro è molto meno sensibile e delicato rispetto all’ariete. Ed è più facilmente addestrabile.
• Per la raccolta del seme nel verro si usa la mano guantata e un raccoglitore. Il raccoglitore è messo all’interno di un thermos per mantenere la temperatura del seme fisiologica. Il raccoglitore presenta un filtro che permette di allontanare la terza porzione del seme.
• Guanti non in lattice!
• L’eiaculato del verro è molto abbondante, 250-400 ml. L’eiaculato è suddiviso in porzioni: la prima parte non contiene spermatozoi, la seconda frazione è quella ricca di spermatozoi e la terza parte è simile alla tapioca, contiene dei granuli e va allontanato.
• Dose inseminante nel verro = 2 milioni di spermatozoi.
• Si potrebbe utilizzare anche una vagina artificiale ma è molto costosa e solitamente si usa la mano con un guanto e il raccoglitore. Le vagine artificiali per il verro, non ha una guaina per metterci l’acqua calda, ma ha una guaina collegata ad una pompetta che permette di simulare la pressione.

Prelievo del seme nel cane

• Anche il cane è sensibile alla pressione e non alla temperatura.
• Il seme del cane si può refrigerare a 4°C;
• Aiuto al salto: si hanno sia il maschio che la femmina, si fa il prelievo dal maschio e si insemina subito la femmina. Se invece non ho presenti sia il maschio che la femmina devo inviare il seme.
• Per la raccolta si può usare una vagina artificiale.
• L’eiaculato del cane è frazionato. Al fine della fecondazione artificiale, si deve prenderlo frazionato. La prima frazione serve solo per pulire l’uretra e proviene dalla prostata.
• Il cane ha solo la prostata come ghiandola annessa all’apparato genitale.
• Il pene presenta l’osso del pene che permette la penetrazione in vagina. La completa erezione avviene poi all’interno della femmina. Nel cane, si ha la penetrazione nella vagina grazie all’osso del pene e una volta che il pene è all’interno, la vena del pene che passa in mezzo all’anello fibroso viene compressa dai muscoli e dalla vulva, e il sangue che arriva al pene non riesce più a defluire, quindi il pene aumenta notevolmente di volume e non riesce a uscire dalla vulva. Per questo rimangono incastrati. Prima frazione, seconda frazione, poi ruota, uno di spalle all’altro e poi terza frazione. Il prepuzio si sposta caudalmente al glande.
• Si deve aspettare poi che il pene torni nel prepuzio. Se il pene non torna nel prepuzio si può avere una patologia detta parafimosi.
• Azospermia = assenza di spermatozoi nell’eiaculato. Azospermia primaria (spermatozoi non vengono prodotti) e azospermia secondaria (spermatozoi non passano l’epididimo).
• Nell’eiaculato del cane è presente la carnitina o fosfatasi alcalina che è prodotta dall’epididimo. Se nell’eiaculato è presente la carnitina significa che l’azospermia è primaria. Se la carnitina non è presente nell’eiaculato significa che il problema è a livello dell’epididimo, che gli spermatozoi vengono prodotti ma rimangono bloccati a livello dell’epididimo.

Esame del seme

Seme: Parte figurata: spermatozoi. Parte liquida prodotta dalle ghiandole annesse all’apparato genitale.

Esami macroscopici

• Colore, odore, volume, pH.

Esami microscopici

• Motilità di massa e individuale, concentrazione spermatica, vitalità spermatica, morfologia spermatica.

Spermatogenesi: Spermatogonio A, spermatogonio B, spermatocita di primo ordine (addensamento cromatina), spermatide (spermioistogenesi), spermatozoo.

Parti spermatozoo: Testa, tratto intermedio, coda.

Nel seme non si devono trovare alte percentuali di neutrofili (5-6 per campo a ingrandimento 10x è normale).

Esami macroscopici

Volume dell’eiaculato

• Si valuta avvalendosi della gradazione decimale dei raccoglitori usati per la raccolta o dopo il travaso dell’eiaculato in un contenitore graduato. Espresso in ml.

Fattori che influenzano il volume del seme:

• Specie: stallone e verro seme abbondante, ariete, toro poco abbondante.
• Razza: nelle diverse specie di cane, nei bovini le razze da latte solitamente hanno un eiaculato più abbondante.
• Età: le ghiandole annesse sono ormone dipendenti e aumentano con l’età, quindi il volume dell’eiaculato aumenta con l’età dell’animale.
• Stagione: becco, ariete, stallone hanno attività stagionale. I maschi possono eiaculare tutto l’anno ma nella stagione non riproduttiva l’eiaculato è misero.
• Alimentazione;
• Tipo di raccolta del seme: con l’elettroeiaculazione si stimolano le ghiandole accessorie con la corrente e l’eiaculato sarà più abbondante rispetto alla raccolta con vagina artificiale.

Volume dell’eiaculato nello stallone: valutazione del volume complessivo dopo filtrazione: volume del seme + volume del gel.

Volume di seme frazionato di cane: prima frazione è delle ghiandole uretrali, seconda frazione è ricca di spermatozoi e terza frazione è prodotta dalla prostata.

Volume dell’eiaculato nelle diverse specie

• Toro: 4-8 (3-10) ml
• Stallone: 75-150 (40-320) ml
• Ariete: 0,8 (0,5-2) ml
• Verro: 200 (100-500) ml
• Cane: 7 (2-15) ml

Colore

Fisiologicamente è bianco cremoso (bovino, ovino, becco), latteo-cremoso, latteo lievemente acquoso (stallone).

• Con sangue, colore rossatro emospermia.
• Con urine, giallastro urospermia.
• Con sfumature verdastre piociti.

Nel prelievo con elettrostimolazione, spesso una conseguenza è che l’eiaculato sia inquinato con urine. A volte nel bovino il colorito giallastro può essere fisiologico in animali alimentati con alimenti in cui è presente la riboflavina. Nel bovino normalmente è bianco lattescente. Se è grigiastro e acquoso mi indica che la componente spermatica è ridotta. Nel cane l’eiaculato è più grigiastro, anche perché fisiologicamente la concentrazione spermatica del seme di cane è molto minore.

Valutazione del pH

Con cartina tornasole. Il pH varia a seconda di quando viene misurato. Se si misura subito dopo il prelievo, il pH ha un determinato valore in base alla specie. Dopo mezz’ora il pH sarà diverso, aumenta l’acidità perché gli spermatozoi consumano le sostanze. Nella conservazione si deve fare in modo che il pH non diminuisca eccessivamente.

• Toro: 6,7 (5,8-7,4)
• Stallone: 7,4 (6,8-7,6)
• Ariete: 6,5 (6,2-6,8)
• Verro: 7,4 (7,3-7,9)
• Cane: 7,5 (7-8,6)

Se c’è un aumento del pH, si ha un processo infiammatorio, probabilmente delle ghiandole accessorio.

Cause di aumento di pH:

• Contaminazione del seme con le urine: nel bovino e nell’ariete l’urina è lievemente alcalina. Nei carnivori l’urina è acida.
• Uso di detergenti: anche l’acqua ha un’azione speriotossica.
• Processi infiammatori del tratto genitale interno.

Esami microscopici

Cinetica spermatica

Si intende l’insieme degli attributi di movimento degli spermatozoi, per cui la motilità e la velocità di spostamento. Il movimento degli spermatozoi dipende dall’efficienza dei microtubuli e dall’integrità della coda.

Tipi di movimento degli spermatozoi:

• Progressivo (fisiologicamente corretto)
• Circolare, ondulatorio, retrogrado, veleggiamento.

Metodi per analizzare la cinetica spermatica:

• Determinazione visiva, microfotografia (ottenuta in microscopia a contrasto di fase), videoregistrazioni del movimento degli spermatozoi.

Determinazione visiva della cinetica:

• Motilità di massa: analisi diretta del campione di seme fresco non diluito (movimento ad onda). Metto una goccia sul vetrino termostatato (a 37°C) e osservo a basso ingrandimento (4x). Classificazione del seme a seconda dell’intensità del movimento (vedi scala).
• Motilità individuale: analisi diretta del campione di seme fresco diluito.

Conteggio con camera di Makler: usata sia per contare gli spermatozoi sia per controllarne il movimento (vedi funzionamento e come eseguire il conteggio). Sia la motilità di massa che quella individuale sono un’analisi soggettiva perché dipende dall’osservazione dell’osservatore.

Studio computerizzato della motilità: i sistemi computerizzati di analisi delle immagini (sistema CASA). IVOS computer assisted sperm analyzer: il sistema ottico di acquisizione delle immagini è costituito da una fonte di luce infrarossa e da una videocamera. Il sistema di illuminazione è su campo oscuro. Questi macchinari CASA hanno comunque dei limiti. Principali errori analitici:

• Eccessiva concentrazione degli spermatozoi: si deve diluire il campione, non con l’acqua che è spermiotossica, ma con soluzione fisiologica oppure altre soluzioni;
• Temperatura del campione inadeguata: deve essere mantenuto a 37°C circa. Non devono subire degli shock termici.
• Settaggio inadeguato: gli apparecchi vanno tarati anche in base alle caratteristiche degli spermatozoi di ogni specie. Gli spermatozoi non sono tutti uguali: gli spermatozoi di gatto sono piccolissimi rispetto a quelli dell’ariete.

Classificazione degli spermatozoi sulla base della motilità:

• Astenozoospermia: ridotta mobilità
• Necrozoospermia: assenza di motilità

Concentrazione spermatica

= numero di spermatozoi per unità di misura del seme (ml o mm³). Siccome molti eiaculati sono molto concentrati è più comodo in mm³.

Metodi utilizzati per valutare la concentrazione spermatica del seme:

• Camere contaglobuli: es. camera di Burker. Metto una soluzione diluita (soluzione fisiologica).