Riassunto microbiologia generale - lezioni complete

RIASSUNTO MICROBIOLOGIA GENERALE

1. procarioti ed eucarioti

I DOMINI

Ci sono tre grossi domini che includono tutte le specie organiche viventi: eucarya, archea, bacteria.

La microbiologia è interessata a tutti e tre i domini perché i batteri fanno parte del dominio bacteria e alcuni del

dominio archea, ma i funghi, le alghe e i protozoi fanno parte del dominio eucaria.

Il nostro organismo è eucariote, ma è popolato da microrganismi.

L’informazione genetica umana è minore di quella dei microrganismi

nell’uomo e anche il numero di cellule dei microrganismi in generale

è maggiore del numero di cellule eucariote.

TASSONOMIA

Scienza che si occupa della nomenclatura delle specie viventi.

Per quanto riguarda la nomenclatura dei microrganismi si

suddivide il nome in due parti, la prima che indica il genere e la

seconda che indica la specie di appartenenza.

Tradizionalmente i due regni principali erano piante animali.

Nel 1886 Haeckel creò il regno dei protisti.

Nel 1938 Chatton suddivise in procarioti e eucarioti

Nel 1969 Whittaker suddivise i regni in monere (batteri), protisti,

funghi, piante e animali

Nel 1990 Wose suddivise i regni in batteri, archei ed eucarioti

Le cellule sono state suddivise anche per il loro fenotipo ossia

l’insieme delle loro caratteristiche morfologiche e funzionali (attività

della cellula)

CELLULA PROCARIOTE

La cellula procariote è molto più piccola (0,2-0,3 micrometri

-6

ovvero meno di 10 m) della cellula eucariote (100-150

-4

micrometri ovvero 10 m).

La cellula procariote è rivestita di parete cellulare, che è lo strato

esterno rigido, a composizione chimica variabile, presente in molti

microrganismi, ma in tutti i funghi e piante.

Sotto la parete troviamo la membrana cellulare, strato di lipidi e

proteine che circonda il citoplasma, che rappresenta, per le cellule

prive di parete, il confine tra la cellula e l’ambiente circostante.

Il citoplasma contiene organuli, enzimi, sostanze chimiche e

rappresenta il sito di gran parte dell’attività metabolica della cellula

(è ricco di ribosomi che sintetizzano le proteine)

Il materiale nucleare può essere RNA o DNA (in gran parte delle

cellule, ma non nei batteri) ed è racchiusa da una membrana nelle

cellule eucariote, mentre nei procarioti non è separato né da una

membrana ne dà un nucleo.

La mitosi è la caratteristica riproduzione asessuata dei batteri e

molte altre cellule procariote (per gli eucarioti si ha la meiosi,

riproduzione sessuata)

1. Interfase

2. Profase: a cellula possiede due serie di cromosomi, una

proveniente da ciascun denitore.

Ognuno dei quattro cromosomi si è replicato. I due figli di ciascun cromosoma sono ancora uniti assieme.

3. Metafase: i cromosomi si allineano lungo l’asse centrale della cellula

4. Anafase: i due cromosomi figli si separano

5. Telofase: la cellula si divide

6. Interfase: le due cellule figlie sono ora pronte a replicare i propri cromosomi per ripetere il processo mitotico

I più comuni sono i bacilli, i cocchi, i vibrioni e gli spirilli

I plastidi sono presenti solo nelle cellule vegetali.

Una cellula eucariote come il lievito possiede una parete cellulare

CELLULA EUCARIOTE

Deriva da una simbiosi spinta tra due organismi: uno procariote ed uno eucariote.

Il materiale genetico non è contenuto solamente nel nucleo, ma anche nei mitocondri, che assomigliano a dei

batteri e sono le centrali energetiche della cellula.

Nelle cellule vegetali il materiale genetico si trova anche nei cloroplasti.

Si pensa che la formazione delle cellule eucariotiche sia partita dalla mitosi di singole forme di progenota

(singole forme che si evolvono indipendentemente) che hanno originato i prebatteri e i prearchea.

Queste due nuove forme si sono evolute in protobatterio (con esteri in membrana, che origina anche le alghe) e

in protoarchea (con eteri in membrana).

Dalla loro fusione si è formato il ceppo dei preeucarya (con esteri in membrana), evoluti in eucarya con nucleo

e poi con mitocondrio (simbiosi tra un protobatterio e un eucarya primitivo) e anche nelle cellule delle piante, con i

cloroplasti.

In pratica quindi la cellula eucariote è compartimentata.

1. Interfase

2. Profase 1: le due coppie iniziali di cromosomi omologhi

(ciascun cromosoma si è replicato) si allineano al centro della

cellula

3. Metafase 1: mentre i due cromosomi sono appaiati si possono

verificare “crossover” con scambio di DNA tra i cromosomi

4. Anafase 1: i cromosomi omologhi si separano

5. Metafase 2: si formano due cellule, ciascuna contenente due

serie di cromosomi

6. Anafase 2

7. Telofase 2: c le cellule figlie si dividono nuovamente mediante

mitosi dando così origine a quattro cellule, ciascuna con metà del corredo cromosomico. Queste cellule aploidi

sono i gameti, cellula uovo o cellule spermatiche

CLASIFFICAIZONE DEI MICRORGANISMI

Tutti i microrganismi hanno un optimum di crescita: velocità massima di

crescita in un tempo minimo a determinate condizioni di pH, T, P, H O libera,

2

presenza di O .

2

I microrganismi termofili e ipertermofili non presentano un doppio strato

fosfolipidico della membrana esterna, ma uno strato unico in cui le molecole

sono saldate (membrana rigida) e presentano una serie di proteine accessorie

che aiutano le altre nel folding a T elevate.

L’attività dell’acqua è un rapporto tra la pressione di vapore sulla soluzione e

la pressione di vapore su acqua dura (distillata, deionizzata), che fornisce la

disponibilità di acqua libera (AW) ossia non legata a nessuna molecola.

pressione di vapore

=

AW pressione divapore di riferimento , ovvero acqua

Quando AW =1 si ha totale disponibilità di acqua libera nel microrganismo.

Es. un alimento sotto sale ha valori di AW sotto 0,8-0,7.

I microrganismi alofili estremi possono crescere con elevate concentrazioni saline e in generale con bassa

disponibilità di acqua libera.

IL MICROSCOPIO

È costituito principalmente da due gruppi di lenti:

Oculari: dove appoggio gli occhi, che possono ingrandire fino a 10 volte

 Obbiettivi: gruppo più importante e vicino al campione da analizzare. Possono ingrandire il campione fino

 a 100 volte

I batteri si vedono anche da 50x, il lievito anche da 40x.

L’ingrandimento complessivo avvicinando le due lenti è 1000x

La sorgente luminosa proviene da basso e una serie di lenti direziona la luce in un punto sul vetrino.

Il microscopio ha delle viti per il controllo micrometrico (spostamento in verticale) e macrometrico.

Se devo ingrandire utilizzo molta più luce (diaframma aperto) e quindi le lenti oltre ad ingrandire devono avere una

buona apertura numerica: angolo massimo di ampiezza (u) compreso tra l’asse ottico e il raggio più esterno che

può venire raccolto dall’obbiettivo.

Se c’è dell’aria (immersione non omogenea) i raggi luminosi vengono deviati e quindi vanno persi. È preferibile

quindi utilizzare piccoli ingrandimenti.

Se uso un fluido che ha la stessa rifrazione del vetro il raggio non viene deviato e aumenta la risoluzione

(immersione omogenea)

Il potere risolutivo è la capacità di distinguere due oggetti vicini tra loro:

λ

d= dove n.A.eb = apertura numero dell’obbiettivo e n.A.cond = apertura numerica

+n

n . A . . A .

eb cond

del condensatore

Più l’obbiettivo si avvicina al vetrino più si ingrandisce il diaframma e quindi l’immagine sarà maggiore (passa più

luce). Più l’obbiettivo si allontana e meno ingrandisco perché diminuisce l’apertura del diaframma (passa meno

luce).

La rifrazione della luce dipende dall’angolo di incidenza, dal grado di curvatura della lente e dalla densità

della luce. ' '

indice di rifrazione=(seno del l angoloincidente)/( seno del l angollodi rifrazione)

Quindi

Il microscopio ottico è basato su un sistema di lenti e vista la minima grandezza dei microrganismi se questi

vengono attraversati da un fascio di luce grande non si riescono a vedere perché diventano trasparenti, per cui i

microrganismi devo essere colorati.

Il microscopio ottico a contrasto di fase garantisce

un’osservazione più veloce, riesco a distinguere il microrganismo in

cui si trova evitando di colorarlo (perché quando vengono colorati

muoiono) poiché trasforma un oggetto di fase in un oggetto di

ampiezza (quello in fase diventa trasparente a contatto con il

raggio luminoso, mentre quello di ampiezza è visibile)

- Diaframma anulare: la luce passa attraverso il condensatore e

viene convogliata al vetrino (forma di anello)

- Anello di fase: vetro trasparente, i raggi che non colpiscono

nulla vengono convogliati nella zona più spessa. I raggi che

colpiscono vengono convogliati nella zona sottile.

I raggi diretti sono ritardati o accelerati di ¼ la lunghezza d’onda

quando passano nell’anello di fase

- Piastra di fase: piastra su cui è presente l’anello di fase.

molti raggi passano attraverso la piastra di fase senza

modifiche, evitando l’anello di fase

Due raggi luminosi in

fase che si incontrano si uniranno a

dare un raggio con un’ampiezza uguale alla

somma delle ampiezze dei singoli raggi.

L’ampiezza di contrasto varia in funzione

dei raggi che possono essere in fase o in

inversione di fase.

Immagini luminose in background scuro sono

il risultato di raggi in fase; immagini scure in

background luminoso sono il risultato di

raggi in inversione di fase.

2. membrana, sistemi di trasporto e parete cellulare

MEMBRANE CELLULARI

La membrana cellulare è una struttura che divide l’ambiente interno della cellula dall’ambiente esterno.

La struttura è comune in tutti i viventi e la costituzione prevede

come componente principale i fosfolipidi: molecole formate da

unità di glicerolo, polialcol (3OH), due legami esteri con acidi grassi.

La membrana degli archea può essere a doppio strato lipidico o mono strato lipidico di

tetraedri.

Nel caso del mono strato lipidico il fosfolipide è il bifitanile che ha due teste polari alle due

estremità opposte (nel doppio strato lipidico si ha il fitanile).

FUNZIONI DELLA MEMBRANA

- Barriera permeabile:

rappresenta una superficie attiva e selettiva per il trasporto di nutrienti e metaboliti

nella cellula e fuori dalla cellula

- Sito di ancoraggio:

di proteine coinvolte nel trasporto, nel metabolismo e nella chemiotassi

- conservazione dell’energia:

sito di generazione e mantenimento della forza protone-motrice.

Gli agenti disaccoppianti uniscono le cariche e causano la morte della cellula.

SISTEMI DI TRASPORTO

Per dissociare un acido organico (gruppo carbossilico COOH) la cellula utilizza un pH molto più acido (HCl). Gli acidi

organici stabilizzano l’alimento e sono caratteristici degli alimenti fermentati.

Il trasporto di molecole o ioni può avvenire:

diffusione:

 - attraverso la membrana

- attraverso un poro presente sulla membrana

- diffusione facilitata (uniporto)

trasporto secondario:

 - simporto: i protoni trasportano una molecola o uno ione nella cellula. Non esce niente, a parte gli ioni H+

che vengono espulsi, con dispendio di energia, per ripristinare l’equilibrio di cariche.

- Antiporto: esce la molecola con elevata concentrazione (il lattosio scisso in galattosio e glucosio. Nella

cellula rimane il glucosio ed esce il galattosio). Uno entra e uno esce

sistema ABC:

 detto ATP-binding questo sistema sfrutta un enzima specifico per una molecola per farlo arrivare su un sito di

ancoraggio ancorato nella membrana, regolato da una proteina all’entrata della cellula.

Questo scambio consuma ATP in ADP+P.

traslocazione di gruppo

 PEP-PTS (PEP= fosfoenolpiruvato; PTS= fosfotransferasico)

È un traporto che avviene coinvolgendo gruppi di proteine (solitamente 5). Una proteina è localizzata

transmembrana e le altre svolgono funzioni.

Nel caso del trasporto di uno zucchero nella cellula: lo zucchero viene fosforilato, dal gruppo PEP, che diventa

piruvato, con dispendio di energia e dopodiché il gruppo fosfato viene donato ad uno degli enzimi PTS in modo

contiguo fino all’arrivo dello zucchero nella cellula.

Ogni trasporto è specifico, così la cellula sceglie cosa entra e cosa esce.

LA PARETE CELLULARE

Ha una funzione prettamente strutturale e protettiva, conferisce rigidità e forma ed è formata da polimeri insolubili

in acqua.

Il lievito pur essendo un eucariote ha una parete cellulare diversa da quella dei batteri.

Tipologia di struttura nei batteri:

- GRAM (+):

possiedono una parete monostrato, di densità uniforme formata soprattutto da peptidoglicano.

Dall’esterno verso l’interno: parete (spessa e periplasmatico), membrana e citoplasma.

- GRAM (-):

possiedono una parete a doppio stato formata da uno strato sottile di peptidoglicano e da una membrana

esterna.

Dall’esterno verso l’interno: membrana esterna (doppio strato fosfolipidico), spazio periplasmatico, strato di

peptidoglicano, membrana interna, citoplasma.

PEPTIDOGLICANO

Il peptidoglicano è formato da peptidi + zuccheri

(amminozuccheri).

Si tratta di polimeri inclinati di NAG (N-acetil-glucosammina) e

NAM (acido N-acetil-muramico).

Al NAM si legano 4 amminoacidi (catena tetrapeptidica) e si

forma un legame peptidico tra due catene degli amminoacidi. In

questo modo a struttura risulta ordinata ed organizzata.

Il legame beta 1-4 è rotto dall’enzima lisozima, che è in grado di idrolizzare la parete cellulare e controlla lo

sviluppo dei microrganismi presente in un ambiente.

Le cellule batteriche se poste in un ambiente acquoso interagiscono per osmosi con l’acqua.

- Soluzione ipotonica: la concentrazione dei Sali è maggiore nella cellula per cui l’acqua comincia ad entrare

nella cellula batterica, fino a farla esplodere.

- Soluzione isotonica: (fisiologica 9 g/L di NaCl). La parte viene digerita dal lisozima e il contenuto della cellula

fuoriesce dalla parte. Si crea il protoplasto.

I GRAM(-) sono più fragili perché contengono poco peptidoglicano e sono anche meno sensibili alla colorazione.

ANTIBIOTICI

Le molecole antibiotiche sono prodotte da microrganismi e sono attive contro i microprocarioti (sono specifici) e

funzionano solo su microrganismi in fase di crescita.

Sono permeabili alle membrane e quindi entrano nella cellula senza sistemi di trasporto.

Diversi tipi di antiobiotici:

- Battericida: ad alte concentrazioni uccidono i microrganismi

- Batteriostatica: bloccano i meccanismi vitali della cellula (sintesi della parete: penicillina o la vancomicina che

si lega ad un dipeptide come D-Ala-D-Ala e blocca l’attività della cellula.)

- Biocida: interagiscono con molte strutture della cellula: non ha un bersaglio preciso. Esempio la candeggina

(ipoclorito di sodio)

SISTEMI DI TRASPORTO CHE AUMENTANO LA RESISTENZA DEL MICRORGANISMO

1. Cambio del bersaglio dove si va a legare l’antibiotico: modifica target (cambio del sistema enzimatico o

della sequenza amminoacidica es: D-Ala-D-Ala in D-Ala-D-Lat per resistere alla vancomicina)

Il problema si presenta se avviene uno scambio genetico tra un batterio patogeno e uno non patogeno, che

acquisisce la resistenza.

2. Si smonta la struttura antibiotica: per la penicillina alcuni batteri hanno l’enzima b-lattanasi che romper

l’anello b-latturonico)

3. Sistemi di trasporto per espellere le molecole tossiche (efflusso)

È importante ricordare che l’antibiotico non guarisce, ma riduce la carica batterica riducendo la capacità del

microrganismo di replicarsi.

Se ad esempio ho un microrganismo che cresce a 4°C e uno che cresce a 30°C e metto l’alimenti in frigo

aggiungendo poi la penicillina, questa andrà a combattere il batterio che sta proliferando (quella che cresce a 4°C),

mentre non attaccherà quello che non si sta replicando.

COLORAZIONE DI GRAM

Attraverso la colorazione possono distinguere se si tratta di un GRAM(+) o un GRAM(-). Si osserva con il

microscopio ottico.

1) Si mette con l’ansa il microrganismo sul vetrino

2) Si lasci asciugare

3) Si passa il vetrino su una fiamma per fissarlo

4) Si colora

La fase di colorazione comprende 5 passaggi:

1. Colorazione primaria: dopo aver preparato lo striscio si tratta il campione con il cristalvioletto

2. Mordente: si copre il preparato con una soluzione di ioduro di potassio e iodio che si complessa sia con il

cristalvioletto che con il materiale cellulare

3. Decolorazione: si “lava” con qualche goccia di etanolo per lavare via il colorante superfluo

4. Lavaggio con acqua

5. Colorazione di contrasto: tratto il preparato con safranina

La seconda colorazione si fa perché nella fase di decolorazione i GRAM(+) mantengono il colorante fissato sulla

parete (insolubile in HO), mentre i GRAM(-) hanno il colorante che è fissato sulla membrana esterna e quindi

quando passa l’etanolo porta via lo strato fosfolipidico con il colorante.

Per questo utilizzo la safranina, un colorante rosa che ridà colore ai GRAM(-) decolorati, mentre non cambia il colore

dei GRAM(+) che rimangono violetto.

PARETE DEI GRAM(+)

Sulla superficie della membrana si trovano acidi

lipoproteici:

- Acidi teicoici:

molecole che conferiscono carica negativa alla

superficie della cellula, dovuta al legame estere del

fosforo.

Sono legati covalentemente al gruppo 6-ossidrile

dell’acido muramico

- Acidi lipoteicoici:

sono uguali agli acidi teicoici con la differenza che

“sfondano” la membrana di peptidoglicano,

arrivando alla membrana plasmatica

- Acidi teicuronici:

sono in forma ciclica e non hanno il gruppo

fosforico.

PARETE DEI GRAM(-)

Presentano lipopolisaccaridi (LPS) riconosc