Riassunto esame chimica biologica, Prof. Di Salvo Martino Luigi, libro consigliato Biochimica, Donald Voet, Judith G. Voet

POSIZIONE DEI PONTI DISOLFURO

La tappa finale dell'analisi della sequenza amminoacidica è quella che consente la determinazione della

posizione dei ponti disolfuro (se ve ne sono). É possibile ottenere ciò rompendo un campione di proteina

nativa, con i suoi ponti disolfuro intatti, in modo da ottenere coppie di frammenti peptidici contenenti

ognuno un singolo residuo di Cys impegnato in un legame disolfuro. Questi peptidi possono essere

identificati mediante elettroforesi diagonale. Con questa tecnica il digerito viene sottoposto ad un

elettroforesi bidimensionale con due procedimenti uguali. Dopo la prima corsa, l'elettroforetogramma viene

esposto a vapori di acido performico che ossidano i residui di cistina ad acido cisteico. Dopo la seconda

corsa elettroforetica quei frammenti peptidici che sono disposti sulla diagonale dell'elettroforetogramma, e

quindi non sono stati modificati dal trattamento con acido performico, non contengono legami disolfuro.

Quei frammenti che originalmente contenevano un ponte disolfuro ed erano formati da due peptidi vengono

rotti dal trattamento con acido performico e quindi migrano in modo diverso nella seconda corsa

elettroforetica, spostandosi dalla diagonale. Dopo aver isolato il frammento polipeptidico contenente il ponte

disolfuro, quest'ultimo viene rotto e viene determinata la sequenza dei due peptidi. La posizione dei ponti

disolfuro viene stabilita confrontando la sequenza amminoacidica di questi frammenti polipeptidici con

quella della proteina.

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58. Caratteristiche e funzioni dell'emoglobina e della mioglobina

L'emoglobina è stata la prima proteina la cui massa molecolare è stata determinata accuratamente, la prima

proteina ad essere caratterizzata mediante ultracentrifugazione, la prima proteina la cui funzione è stata

identificata con certezza (il trasporto di ossigeno) e la prima in cui è stata identificata la sostituzione in un

singolo amminoacido causato da una mutazione puntiforme (nell'anemia a cellule falciformi). L'emoglobina,

comunque, non è semplicemente un recipiente per l'ossigeno, ma un sofisticato sistema di trasposto capace

di rifornire delle appropriate quantità di ossigeno i tessuti in una grande varietà di circostanze.

L'emoglobina (Hb) è una proteina tetramerica 22 (oppure, possiamo dire, un dimero dei protomeri ) Le

subunità e sono strutturalmente ed evoluzionisticamente correlate l'una all'altra ed alla mioglobina (Mb), la

proteina monomerica che lega l'ossigeno del muscolo. Un numero molto piccolo di organismi non ha

bisogno di questa proteina, in quanto le loro necessità respiratorie vengono soddisfatte dalla diffusione

passiva dell'ossigeno attraverso il corpo. L'evoluzione di organismi più grandi, invece, richiede lo sviluppo

di un sistema circolatorio che trasporti ossigeno e sostanze nutritive ai tessuti. Il sangue di questi organismi

deve contenere un trasportatore di ossigeno come l'Hb, in quanto la solubilità dell'ossigeno nel plasma

sanguigno (la componente fluida del sangue) è troppo bassa (circa 10-4 M in condizioni fisiologiche) per

consentire un trasporto efficace di questo gas in quantità sufficienti a sopperire ai bisogni metabolici. Molte

specie di vertebrati, invece, hanno sviluppato uno o due sistemi alternativi basati su altre proteine che legano

l'ossigeno: (1) l'emocianina, una proteina contenente Cu che ha un colore blu quando forma un complesso

con l'ossigeno ed è incolore se libera, (2) l'emeritrina, una proteina contenente ferro non emico che assume

un colore rosso porpora quando lega l'ossigeno. Il principale ruolo fisiologico, della mioglobina, invece, è

quello di facilitare la diffusione dell'ossigeno nel muscolo che sta respirando rapidamente. La Mb aumenta

la solubilità effettiva dell'ossigeno del muscolo, il tessuto che respira più rapidamente nelle condizioni di

contrazione. Quindi, in questo tessuto che sta respirando attivamente, la Mb funziona come una specie di

trappola per l'ossigeno per facilitare la sua diffusione. Il ruolo di magazzino per l'ossigeno viene svolto dalla

Mb probabilmente solo nei mammiferi acquatici, come le balene e le foche, che hanno nei loro muscoli

concentrazioni di Mb dieci volte più elevate di quelle dei muscoli dei mammiferi terrestri.

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59. L'EME

La Mb e ciascuna delle quattro subunità dell'Hb hanno legato a sé in modo non covalente un singolo gruppo

eme. L'eme è responsabile del colore rosso del sangue ed è il sito su cui ogni molecola monomerica di

globina lega una molecola di ossigeno (le globine sono le proteine dell'Mb e dell'Hb prive del gruppo eme).

Il sistema di anelli eterociclici dell'eme è un derivato della porfirina ed è costituito da quattro anelli pirrolici

(indicati da lettere) legati tra loro da ponti metinici. La struttura porfirinica dell'eme che contiene numerose

sostituzioni (quattro gruppi metilici, due gruppi propionici e due vinilici) viene detta protoporfirina IX.

L'eme è quindi una protoporfirina IX con un atomo di ferro legato nel centro.

Sia nell'Mb che nell'Hb, l'atomo di ferro mantiene normalmente lo stato di ossidazione Fe(II) (ferroso) sia se

il gruppo sia ossigenato oppure libero. L'atomo di Fe nell'Hb e nella Mb deossigenate ha cinque

coordinazioni a piramide quadrata con atomi di N: quattro con la porfirina ed una con la catena laterale di un

residuo di His. In seguito ad ossigenazione, l'ossigeno si lega all'atomo di ferro sul lato dell'eme opposto a

quello in cui si trova il legame di coordinazione con l'His; l'atomo di ferro viene quindi ad avere una

coordinazione ottaedrica; cioè i ligandi vengono ad occupare i sei angoli di un ottaedro con al centro l'atomo

di ferro. Alcune molecole piccole, come CO, l'NO e l'H2S, possono coordinarsi alla sesta posizione di

legame sia nella Mb che nell'Hb con un affinità addirittura maggiore a quella dell'ossigeno. Questo fatto può

spiegare le proprietà altamente tossiche di queste sostanze. Il Fe (II) può essere ossidato a Fe (III) formando

metamioglobina (metMb) oppure metaemoglobina (metHb). La metHb non lega l'ossigeno; il suo atomo di

Fe (III) è già coordinato in modo ottaedrico con una molecola di H2O nella sesta posizione di

coordinazione. Comunque gli eritrociti contengono l'enzima metaemoglobina reduttasi, che converte le

piccole quantità di metHb che si formano spontaneamente di nuovo in Hb con il Fe (II).

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60. Legame dell'ossigeno

Il legame dell'ossigeno alla mioglobina viene descritto dall'equilibrio:

Mb + O2 <--> MbO2

con una costante di dissociazione: K = [Mb][O2]/[MbO2 ]

La dissociazione dell'O2 dalla Mb può essere caratterizzata dalla sua saturazione frazionale , 02, definita

come la frazione di siti che legano ossigeno occupati da O2.

02 = [MbO2]/[Mb]+[MbO2] = [O2]/K+[O2]

poiché l'O2 è un gas, la sua concentrazione viene espressa convenientemente dalla sua pressione parziale,

pO2 (chiamata anche tensione di ossigeno). L'equazione precedente può quindi essere espressa

come: 02 = pO2/K+pO2

Il termine p50 è il valore di pO2 quando la metà dei siti di legame della mioglobina sono occupati

dall'ossigeno, cioè quando la saturazione di 02 è uguale a 0,50. Dunque K=p50 e l'espressione della

saturazione frazionale diventa: 02 = pO2/p50+pO2

(equazione valida solo per la mioglobina)

La curva di dissociazione dell'ossigeno dalla mioglobina ha un andamento che descrive una curva di tipo

iperbolico, espressa dall'equazione precedente. La Mb modifica di poco la quantità di ossigeno legato anche

di fronte a grandi variazioni di pO2; per esempio, con una pO2 di 100 torr la 02 è 0,97, mentre per una pO2

di 20 torr la 02 si sposta solo allo 0,88. Al contrario la curva di dissociazione dell'ossigeno dall'emoglobina

ha un andamento di tipo sigmoide (a forma di S), infatti, la quantità di ossigeno legato si modifica

significativamente anche con una piccola variazione di pO2; per esempio, a 100 torr di pO2 la 02 è di 0,95 e

diventa 0,30 quando la pO2 scende a 20 torr nel sangue intero. La curva sigmoide della dissociazione

dell'ossigeno dall'emoglobina ha un importanza fisiologica fondamentale; essa permette al sangue, infatti, di

trasportare più ossigeno ai tessuti di quanto non potrebbe se l'Hb avesse una curva di dissociazione

dell'ossigeno di tipo iperbolico, come quella della mioglobina. Comunque, una curva di dissociazione di tipo

sigmoide è indicativa della presenza di interazioni cooperative tra i siti di legame di una piccola molecola

presenti sulla proteina; cioè i legami di una piccola molecola influenza il legame delle altre. In questo caso il

legame dell'ossigeno aumenta l'affinità dell'Hb per il legame delle altre molecole di O2.

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I primi tentativi di analizzare la curva di dissociazione sigmoide dell'ossigeno dall'emoglobina furono

eseguiti da Archibald Hill nel 1910. Egli considerò una proteina E costituita da n subunità, ognuna delle

quali è in grado di legare una molecola di S, che è detta ligande. Assumiamo che il ligande si leghi con una

cooperatività infinita: E + nS <--> ESn

cioè, la proteina ha tutti i siti (o nessun sito) di legame per il ligande occupati e quindi non possiamo

osservare forme intermedie del tipo ES1 o ES2. La costante di dissociazione per questa reazione

è: K = [E][S]n/[ESn]

e la sua saturazione frazionale viene espressa, come abbiamo visto prima da:

S = n[ESn]/n([E]+[ESn])

Combinando le due equazioni precedenti otteniamo:

S = n[E][S]n/K

_________________

n[E](1+[S]n/K)

che dopo riarrangiamento algebrico e cancellazioni di termini diventa:

S = [S]n/K+[S]n

Quest'ultima equazione descrive il grado di saturazione di una proteina multisubunità in funzione della

concentrazione del ligande. Comunque, per l'emoglobina, se sostituiamo pO2 a (S), come abbiamo fatto per

la mioglobina, l'equazione di Hill diventa:

O2 = (pO2)n/K+(pO2)n

Definendo p50 come il valore di pO2 a cui S corrisponde a 0,50 avremo:

0,50 = (p50)n/K+(p50)n

così che: K = (p50)n

Sostituendo questo risultato all'equazione di Hill per l'emoglobina avremo:

O2 = (pO2)n/(p50)n+(pO2)n

Quindi l'equazione del grafico di Hill per l'emoglobina assumerà la seguente forma:

log(O2/1-YO2) = nlogpO2 – nlogp50

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