Riassunto esame Biologia dei microrganismi, prof. Mora

Teoria cellulare

Cap. 1: L'albero fitogenetico della vita

L'albero fitogenetico della vita si può suddividere nel seguente modo: I regni dei batteri e degli archea appartengono alle cellule procariote (prive di nucleo) mentre gli eucari sono composte da cellule eucariote nella quale vi appartengono muffe, alghe, funghi, piante e animali.

Procarioti vs Eucarioti

I ribosomi (insieme di molecole più piccole del mitocondrio, ma più grandi della proteina) furono i primi organelli ad essere studiati. Sono stati scoperti tramite la centrifugazione del citoplasma e il simbolo S sta ad indicare il coefficiente di sedimentazione che sta nell’ordine dei 10^-3 secondi ed equivalgono ad una unità Svedberg: s = v / rω².

v = velocità di sedimentazione, ω = velocità angolare del rotore in radianti/s, r = distanza radiale della particella dall’asse di rotazione.

N.B: il termine S dipende dalla viscosità, densità del mezzo.

Crescita cellulare

La crescita dei batteri si stima dal numero di cellule e avviene mediante mitosi. Mentre la crescita di una cellula eucariote si verifica con la crescita in altezza e in larghezza di un individuo e può avvenire per mitosi e per meiosi.

• Mitosi: da una cellula diploide a due cellule diploidi
• Meiosi: da una cellula diploide a quatto cellule aploidi che andranno incontro a riproduzione sessuata per dar vita allo zigote (prima cellula diploide)

La cellula eucariote ha tanti "scomparti", ognuno dei quali ha il proprio DNA; questo ci fa pensare che la cellula eucariote si sia evoluta da una cellula procariote che ha fagocitato varie cellule procariote più piccole.

Il microscopio

Esso è formato da lenti che permettono l’ingrandimento di oggetti 1000 volte più piccoli. La lente dell’oculare ha un ingrandimento che di solito è di 10X e gli obiettivi variano dai 40X ai 100X; per sapere di quante volte si sta ingrandendo si deve fare la moltiplicazione dell’ingrandimento delle lenti (es. oculare 10X e obiettivo 40X ingrandimento di 400X).

La luce serve per far visualizzare gli oggetti osservati e il condensatore (posto sotto il piano portaoggetti) serve a condensare la luce in un piccolissimo e determinato punto del vetrino analizzato.

N.B: più uso un ingrandimento maggiore e più ho bisogno di avvicinarmi.

N.B_2: con un microscopio ottico devo per forza colorare il preparato.

Vi sono anche microscopi che permettono di visualizzare i m.o. anche senza coloranti (freschi); questi microscopi si chiamano a contrasto di fase e funzionano grazie ad un anello formato da un doppio strato nella zona limitrofa che permette di sfasare le onde luminose creando assenza di luce quando colpiscono un m.o. (accelerando o ritardando di ¼ di lunghezza d’onda) che, essendo formato dalla maggior parte di acqua, risulterebbe trasparente.

Composizione cellulare

Cap. 2: Membrana cellulare

La struttura della membrana cellulare è composta da un doppio strato di fosfolipidi, proteine (integrali e periferiche) e polisaccaridi, il tutto stabilizzato da legami idrogeno e interazioni idrofobiche e ioniche. È detta anche a mosaico fluido perché le proteine sono libere di muoversi.

La struttura della membrana degli archea può essere composta in due modi: gli archea batteri hanno questi tipi di membrana che gli permette la sopravvivenza ad alte o a basse temperature.

Le funzioni della membrana sono:

• Barriera permeabile: superficie attiva e selettiva per il trasporto di nutrienti e metaboliti fuori e dentro la cellula
• Sito di ancoraggio: per le proteine coinvolte nel trasporto
• Conservazione dell’energia: sito di generazione e mantenimento della forza proton-motrice

Per il trasporto all’interno e all’esterno della cellula contro gradiente di concentrazione, la cellula usa le proteine di membrana. Il trasporto si può suddividere in:

• Semplice:
  • Uniporto: 1 molecola entra o esce
  • Antiporto: 1 molecola entra e 1 molecola esce
  • Sinporto: 2 molecole entrano o escono
• Traslocazione di gruppo: la sostanza viene modificata chimicamente, es. gli zuccheri vengono fosforilati
• Sistema ABC: il passaggio avviene mediante il consumo di una molecola di ATP; la proteina ruota ed essendoci diverso pH riesce a sganciare il glucosio e gli H⁺ e la proteina successivamente ritorna alla posizione iniziale

Parete cellulare

La parete cellulare è simbolo di distinzione per i batteri; grazie ad essa si possono suddividere in GRAM + e GRAM -.

La parete dei GRAM + è formata da un monostrato e da uno strato esterno di fosfolipidi che perdono la colorazione. Mentre quella dei GRAM - è formata da un pluristrato. Bisogna far notare che la parete non è selettiva, ma rende rigidità e ne impedisce il rigonfiamento alla cellula. Ha anche una funzione meccanica.

Il peptidoglicano è presente in tutte le pareti batteriche (no archea anche se fanno parte dei procarioti) ed è il principale responsabile della resistenza della parete. Nei GRAM + i legami crociati sono rappresentati da un ponte peptidico, mentre nei GRAM - i legami crociati sono rappresentati da un legame peptidico diretto. Molti batteri GRAM + possiedono all’interno della parete cellulare gli acidi teicoici responsabili della carica complessiva negativa della superficie cellulare e possono permettere il passaggio di ioni e possono legare cationi bivalenti trasportandone alcuni all’interno.

Colorazione di GRAM

Il termine GRAM deriva dalla colorazione che serve per poter distinguere le due grandi famiglie dei batteri.

Nutrizione e crescita batterica

Cap. 3: Classificazione fisiologica dei microrganismi

I m.o. si possono anche suddividere in base alla loro fisiologia. Per far sì che una cellula viva cresca e si riproduca, ha bisogno di energia che può essere ottenuta in tre modi:

• Sostanze inorganiche
• Sostanze organiche
• Luce solare

In base a cosa utilizzano i m.o. si dividono in:

• Fotoautotrofi: ricavano energia dalla luce solare e la usano per costruirsi le molecole che contengono carbonio (usando anche CO₂)
• Fotoeterotrofi: usano l’energia solare e sostanze organiche CO₂ e vitamine per ottenere fonti di carbonio
• Chemioautotrofi: ricavano la loro fonte di carbonio dalle sostanze inorganiche
• Chemioeterotrofi: ricavano la loro fonte di carbonio dalle sostanze organiche

Terreni di coltura

Un terreno colturale deve fornire al m.o. tutte le sostanze nutritive necessarie alla crescita, alla produzione di energia e alla produzione di metaboliti desiderati. I terreni possono essere divisi in:

• Sintetici: costituiti da materie prime chimicamente pure impiegati a livelli di laboratorio. Più facile standardizzazione qualitativa e quantitativa. Di solito forniscono poca crescita microbica e produzione di metaboliti limitata, ma ci sono delle eccezioni.
• Complessi: contengono anche materie prime grezze e utilizzati su larga scala
• Selettivi: contengono composti che inibiscono la crescita di alcuni m.o. ma non di altri
• Differenziali: contengono un indicatore che ci permette di distinguere le singole reazioni chimiche che avvengono durante la crescita.
• Arricchiti: con aggiunta di nutrienti per facilitare la crescita

N.B: la composizione di terreni per la produzione degli inoculi è generalmente più semplice di quella dei terreni impiegati nella fase di produzione.

Fonti nutrizionali nei terreni di coltura

• Carbonio: la fonte più semplice è la CO₂, ma si usano anche monosaccaridi, disaccaridi, polisaccaridi e residui finali delle cristallizzazioni degli zuccheri.
• Azoto: inorganico (Sali d’ammonio, ammoniaca –unica fonte per i batteri-, idrato d’ammonio, solfati e cloruri) o organico (amminoacidi, proteine e urea).
• Vitamine: fattori di crescita
• Sali minerali
• Acqua: ingrediente importante, non solo in relazione ai volumi necessari per la preparazione del terreno e la termostatazione, ma anche per le sue qualità e per il contenuto di singoli oligominerali.
• Ossigeno: nei processi aerobi.

Ceppo puro

Le piastre di ceppo puro sono il risultato di una serie di passaggi per la purificazione di una colonia selezionata tramite una serie di strisci. Per fare uno striscio di ceppo puro su piastra, per prima cosa si deve dividere la piastra in tre sezioni come da disegno. Successivamente si sterilizza l’ansa e si preleva un po’ di cellule di ceppo puro e si inizia a realizzare degli strisci sulla parte 1. Nella seconda fase si risterilizza l’ansa e poi si continua lo striscio partendo dalla fine del riquadro 1 e finendo nel riquadro 2. Quest’ultima cosa la si fa con il riquadro 3 partendo però dal riquadro 2. Se si ha lavorato bene si avrà una riduzione e separazione delle colonie avendo così colonie ben distinte da poterle analizzare.

Crescita microbica

Quindi solo se i m.o. si trovano in un ambiente favorevole si riproducono tramite scissione binaria creando una popolazione omogenea rappresentabile tramite i seguenti grafici:

Il tempo di generazione è possibile calcolarlo mediante la seguente formula:

• N₀: numero di batteri al tempo 0 (fase iniziale di crescita);
• N_tt: numero di batteri dopo un periodo di crescita esponenziale

Bisogna far notare che ogni specie ha il suo tempo di generazione.

Ciclo di crescita di una popolazione batterica

La crescita batterica è possibile rappresentarla con un grafico:

• Fase di latenza: rappresenta un periodo di adattamento e non si verifica alcuna divisione cellulare
• Fase di crescita: periodo di piena riproduzione ma a velocità costante
• Fase stazionaria: la riproduzione e la morte sono perfettamente bilanciate
• Fase di morte: la velocità di morte supera quella di riproduzione. La morte può avvenire anche per autolisi.

Misurazione della crescita microbica

Per misurare la crescita batterica vi sono diversi metodi, ma che non distinguono le cellule morte da quelle vitali. Vi sono metodi:

• Indiretti:
  • Peso totale cellule (peso umido e peso secco)
  • Analisi chimica di un costituente cellulare
  • Turbidimetria: misura la crescita nelle soluzioni liquide e si basa sulla misurazione della luce assorbita da una sospensione di m.o.; non molto accurata, ma è in tempo reale
• Diretti:
  • Conta al microscopio
  • Contatore coulter
  • Conta vitale
  • Piastramento per inglobamento (terreno liquido)
  • Piastramento per spatolamento (terreno solido)
  • Piastramento con filtrazione

Per poter eseguire una conta vitale significativa bisogna (non necessariamente) eseguire delle diluizioni al campione. Una piastra leggibile ha un numero di UFC (unità formante colonie) compreso tra 80 e 300. Per la conta si prende la prima piastra leggibile con la diluizione più bassa, si contano le colonie e il numero ottenuto lo si moltiplica per la diluizione.

Effetti delle condizioni ambientali sulla crescita microbica

Vi sono vari aspetti ambientali che possono influenzare la crescita microbica e in base all’adattamento del m.o. e del fattore si possono dividere in diverse categorie:

• pH:
  • Neutrofili (pH neutro)
  • Alcalofili (pH > 7)
  • Acidofili (pH < 7)
• Ossigeno:
  • Aerobi obbligati (necessitano di ossigeno come ultimo accettore di e^-)
  • Aerobi facoltativi (possono utilizzare l’ossigeno oppure altre molecole in stato ossidativo)
  • Microaerofili (richiedono ossigeno a bassa concentrazione)
  • Anaerobi obbligati (vivono in anaerobiosi)
• Temperatura:
  • Psicrofili (2 - 20°)
  • Mesofili (10 - 40°)
  • Termofili (40 - 80°)
  • Ipertermofili (60 - >90°)
• Disponibilità di acqua:
  • Alofili estremi (aw < 0,91)
  • Modestamente alofilli (aw = 0,91)
  • Non alofili (aw = 1,00)

Queste quattro categorie sono molto importanti per sapere come fa crescere o non un determinato microrganismo.

Fisiologia microbica e metabolismo

I microrganismi sono caratterizzati da una grande versatilità metabolica, sia tra le varie specie sia all’interno della stessa specie o ceppo. Ad esempio, E. coli può produrre energia per respirazione o fermentazione, può utilizzare l’O₂ come accettore finale di elettroni (respirazione aerobia) o al contrario respirare in condizioni anaerobiche utilizzando un diverso accettore terminale di elettroni, inoltre può utilizzare il glucosio e il lattosio come fonte di carbonio ottenendo tutte le biomolecole necessarie (aminoacidi ecc.).

In base alla presenza di un unico prodotto finale di fermentazione o di più prodotti, possiamo distinguere i microrganismi rispettivamente in:

• Omofermentanti
• Eterofermentanti

Gli eterofermentanti non usano in genere la glicolisi, ma utilizzano delle vie alternative di catabolizzazione del glucosio, come lo shunt degli esoso-monofosfati (o via dei pentoso-fosfati). In tale via si ha l’ossidazione diretta del glucosio-6 fosfato a acido 6-fosfogluconico e per decarbossilazione e ulteriore ossidazione si ha la sintesi del pentosofosfato. Il pentosofosfato, ad opera dell’enzima chiave fosfochetolasi, è scisso in 3-fosfogliceraldeide e acetilfosfato. A partire dalla 3-fosfogliceraldeide si ha la stessa sequenza di reazioni della glicolisi e quindi la formazione di acido piruvico che viene ridotto ad acido lattico. L’acetilfosfato per riduzione dà origine all’acetaldeide che verrà ridotta ad etanolo. Questa via metabolica è impiegata da alcune specie appartenenti al genere Leuconostoc e da alcune specie di Lactobacillus.

La respirazione è invece un processo in cui si ha una completa ossidazione del substrato organico. Il ciclo di Krebs è richiesto proprio per tale processo: infatti, l’acido piruvico, dopo la conversione in Acetil CoA, imbocca la via degli acidi tricarbossilici, ciò conduce a una completa ossidazione del glucosio a CO₂ e alla formazione di intermedi che verranno utilizzati per la biosintesi di molecole come gli aminoacidi (aspetto anabolico del ciclo di Krebs). L’accettore finale di elettroni (nella respirazione aerobica) è l’O₂ che non riceve subito gli elettroni da parte del NADH, ma dopo una sequenza di passaggi in cui sono coinvolti vari complessi enzimatici della catena di trasporto degli elettroni.