Biologia dei microrganismi

METODI INDIRETTI METODI DIRETTI

1. Peso totale cellulare (umido o 1. Conta al microscopio

secco) 2. Contatore Coulter

2. Analisi chimica di un componente 3. Conta vitale

cellulare

3. Turbidimetria

Descrizione dei principali metodi utilizzati:

Conta al microscopio (diretto)

Il principio è quello di mettere i

microrganismi su un vetrino,

contarli e trovare la loro

concentrazione. Non uso un

vetrino normale, ma delle camere

di conta con dei solchi tracciati a distanze calibrate in modo da disegnare reticoli con delle

aree note. Contando le cellule presenti in uno dei quadrati ad area definita, moltiplicando poi

per un valore tabulato ottengo una concentrazione. Per ottenere valori veritieri devo fare

diverse conte e poi trovare un valore medio. È un metodo di conta veloce, solo che non

distingue le cellule vive da quelle morte.

Se parto da un alimento liquido devo solo miscelare bene il prodotto, prelevarne una quantità

stabilita e fare la conta al microscopio. Ma se tratto un alimento solido devo procedere in modo

diverso per ottenere un dato di concentrazione: per esempio prelevo una quantità stabilita di

formaggio, la metto in un omogeneizzatore con una soluzione fisiologia sterile, miscelo fino a

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ottenere una matrice liquida. A questo punto procedo con la conta e riferisco il risultato alla

quantità di formaggio prelevata. Esempio:

Conta vitale (diretto)

Questo è il metodo diretto più importante unico

certificato a livello di normative.

Parte dal presupposto che ogni colonia presente sul

terreno di coltura deriva da una cellula. Quindi se conto le

colonie risalgo al numero di cellule di partenza.

Questo metodo si basa sulla conta delle colonie di

microrganismi visibili ad occhio nudo dopo il periodo di

incubazione. Per evitare che i terreni di coltura siano

troppo affollati e non si distinguano le colonie si procede

con diluizioni seriali (e decimali) del prodotto, ad ogni

passaggio della diluizione si ottiene una diminuzione di

10 volte del numero di cellule. Da ogni provetta che

corrisponde a un passaggio della diluizione viene prelevato un campione (di 1 mL se la semina

è per inglobamento, 0,1 mL se è per spatolamento) che poi verrà inoculato e sottoposto a conta.

Solo i terreni che contengono un numero di colonie compreso tra 30 e 300 vengono presi in

considerazione. Il numero di colonie contate viene poi moltiplicato per il fattore di diluizione,

in modo da ottenere il numero di cellule nel campione originario.

L’unità di misura del calcolo non può essere cellule/mL perché non so effettivamente se le mie

colonie sono originate da una sola cellula oppure da streptococchi, diplococchi, tetradi, sarcine

o stafilococchi. Pertanto parlo di UFC (unità formanti colonia) o CFU (colony forming units).

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Se invece ho una bassa concentrazione di microrganismi e devo applicare la conta vitale invece

che diluire devo concentrare. Questo avviene per esempio quando devo procedere alla conta

vitale in prodotti come l’acqua. Un volume noto di prodotto (per esempio 1 L di acqua) viene

filtrato attraverso un filtro a maglia (cutoff) stretta (0,2-0,45 µm), in modo da far passare le

molecole di acqua ma non la componente microbica. Successivamente metto in incubazione in

una piastra il filtro che funge da terreno di coltura e poi conto le colonie formatesi. Posso

analizzare anche l’aria con questo metodo, ne aspiro 1 m , la filtro, incubo e conto.

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Turbidimetria (indiretto)

È un metodo che valuta la torbidità di una sospensione di cellule. Per fare questo tipo di conta

ho bisogno di terreni liquidi e trasparenti in partenza.

Il principio di questo tipo di conta è far attraversare un recipiente (detto cuvetta) contenente

le mie colonie da un raggio luminoso di lunghezza d’onda nota. Viene così misurata da un

detector posto aldilà della cuvetta l’intensità di luce incidente e trasmessa. Lo strumento

appena descritto è lo spettrofotometro. Quello che trovo è detto unità di assorbanza o

optical density (OD) e a fianco di esso è indicata la lunghezza d’onda utilizzata. Nella formula

esprimo il rapporto tra luce incidente e luce tramessa, per avere una valore che aumenta

all’aumentare della torbidità uso il logaritmo. In altre parole ottengo una OD direttamente

proporzionale alla concentrazione cellulare presente.

Il range di lettura è 0-3 OD.

Un esempio per capire come funziona è il

DNA. Quando esso si trova in soluzione

assorbe la luce a una lunghezza d’onda di

260 nm, quindi se voglio misurare la torbidità dei microrganismi attraverso quella del loro

DNA utilizzo quella lunghezza d’onda. Per le proteine il valore è 280 nm. Quando lavoro con

cellule in sospensione uso raggi a lunghezza d’onda nel visibile.

Se uso un sistema spettrofotometrico traccio bene le fasi vitali di una cellula ma non quelle di

morte. Infatti non tutte le cellule dopo morte subiscono la lisi (disgregazione totale della

cellula), e solo per quelle che la subiscono sono in grado di vedere tutte le fasi. Al contrario la

conta vitale mi dà una visuale intera. Tuttavia con la turbidimetria ho il vantaggio

dell’immediatezza del risultato, senza fare campionamenti, diluizioni etc. Posso unire i due

metodi facendo le misurazioni di uno stesso tipo di microrganismo nello stesso terreno, mi

creo una curva di calibrazione. In essa per ogni punto delle curva di crescita ottengo due valori:

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la misurazione in UFC/mL e in OD. Quando poi faccio una delle due misurazioni dalla retta

posso risalire al valore dell’altro tipo di misurazione.

Sensibilità dei due metodi: la conta vitale ha una sensibilità elevatissima, ovvero riesce a

visualizzare anche solo una cellula, invece la turbidimetria ha una sensibilità di 10 UFC/mL.

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Non è un valore alto, ma la crescita microbica in ambito alimentare arriva fino a 10 -10

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UFC/mL.

Coulter counter o citometro di flusso (diretto)

È un sistema particolare che parte dal principio che sfrutta il flusso delle cellule in sospensione

acquosa. La prima parte dello strumento consiste in due tubi concentrici, in quello esterno

scorre del liquido di trascinamento, mentre in quello interno scorre il mio campione di cellule.

Per un principio idrodinamico, se i due liquidi vanno a velocità diverse quando si uniscono

rimangono separati e le cellule del mio campione si dispongono una dietro l’altra. Qui entra in

gioco un sistema di conta, costituito da laser e detectors. Le cellule attraversano la luce dei

laser che cambia di intensità e queste variazioni vengono rilevate dai detectors. In questo

punto (FSC) ho già una prima classificazione in base alle dimensioni. Poi le cellule passano

attraverso altri step che rilevano la fluorescenza a determinate lunghezze d’onda per

determinare altre caratteristiche delle cellule. Alla fine del percorso (SSC) viene misurata

anche la luce deviata dalle cellule, ulteriore informazione. Dopo questa misurazione ottengo 6

valori numerici per ciascuna cellula. Questo macchinario non mi fornisce solo una conoscenza

numerica delle cellule presenti nel campione, ma anche qualitativa. Alla fine della misurazione i

miei dati vengono raccolti in grafici composti da nuvole. Ciascuna nuvola è costituita da tanti

punti quanti sono i microrganismi di quel tipo. In linea teorica questa misurazione scende

anche a una sensibilità di 1 cellula/mL e posso raccogliere 90.000 eventi per ogni misurazione.

Questo metodo è nato in ambito medico per analizzare il sangue, poi è stato portato in

microbiologia ed è molto utilizzato per valutare la qualità delle acque e per monitorare gli

acquedotti. © Laila Pansera - 32

Ciclo cellulare della Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae è un lievito, quindi un eucariote. È un organismo diploide, con 16

cromosomi in coppia. Per questo motivo può andare incontro a riproduzione vegetativa, ma

anche a riproduzione sessuata.

Gemmazione

La divisione cellulare di tipo vegetativo del Saccharomyces cerevisiae prende il nome di

gemmazione e avviene attraverso una serie di fasi:

• Fase G1, pre-sintetica;

• Fase di sintesi del DNA (fase S);

• Fase mitotica, di separazione vera e propria.

La cellula figlia che si genera è in uno stato fisiologico diverso rispetto alla cellula madre,

ovvero non presenta le condizioni adeguate per dividersi. Per cui esiste una fase cellulare

affinché la figlia possa entrare nella fase G1. Questa sfalsatura temporale rende non corretta

l’equazione per calcolare il tempo di generazione di queste cellule. Ciò nonostante la curva di

crescita di queste cellule è molto simile a una curva di crescita microbica tradizionale. Non tutti

i lieviti si dividono per gemmazione.

Questo tipo di riproduzione avviene quando la cellula si trova in condizioni favorevoli.

Riproduzione sessuale

Quando la cellula si trova in una situazione di stress nutrizionale o ambientale, per esempio

non può usare i nutrienti, oppure è circondata da molecole come l’etanolo che limitano il suo

metabolismo, essa dà origine a delle spore. Quindi da una cellula di lievito diploide si generano

4 spore aploidi avvolte da un asco (sono infatti definite ascospore, ascosacchetto), 2 a e 2 α.

Esse possono venire separate e dare origine a linee cellulari aploidi stabili. In condizioni

particolari cellule di tipo sessuale opposto (1 a e 1 α) possono andare incontro a coniugazione:

vengono in contatto e si fondono per dare origine a una cellula diploide. Questo fenomeno è

molto utile perché fa in modo che ci sia un rimescolamento genetico. Durante la coniugazione

le spore a riconoscono le α a livello molecolare: infatti le due spore secernono peptidi con due

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sequenze ben precise ma diverse, e sulle superfici delle due spore ci sono dei ricettori che

permettono di riconoscere i peptidi prodotti dall’altra spora, per cui se le due cellule sono a

contatto e i ricettori riconoscono i feromoni peptidici, avviene la fusione.

N.B.: spore e coniugazione esistono anche nei batteri, ma hanno significati diversi.

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Metabolismo energetico

L’evento chiave nell’evoluzione degli organismi è stata la capacità di stabilire una separazione

di cariche o potenziale elettrochimico attraverso la membrana citoplasmatica.

La separazione di cariche viene attuata da organizzazioni subcellulari strutturate sulla

membrana: possono essere le catene di trasporto degli elettroni ma anche un enzima, l’ATP-

sintasi.

La separazione di cariche può essere considerata la forza trainante nella generazione di ATP,

ed è quindi il