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Fattori ambientali che influenzano la crescita microbica .................................................................................. 44

Catabolismo e anabolismo ................................................................................................................................ 46

Spore batteriche ................................................................................................................................................ 48

Ciclo di sporificazione .................................................................................................................................... 48

La fermentazione omoacetica ........................................................................................................................... 52

Test fenotipico ............................................................................................................................................... 53

Genetica microbica ............................................................................................................................................ 55

Premessa ....................................................................................................................................................... 55

Struttura del DNA .......................................................................................................................................... 55

Replicazione del DNA..................................................................................................................................... 58

Flusso di informazione ................................................................................................................................... 62

Differenze tra DNA e RNA .............................................................................................................................. 63

Trascrizione dell’informazione ...................................................................................................................... 63

Sistemi di regolazione .................................................................................................................................... 74

Regolazione negativa e positiva della trascrizione .................................................................................... 74

I virus ................................................................................................................................................................. 77

Ciclo vitale ..................................................................................................................................................... 77

Conta del virus ............................................................................................................................................... 79

Il genoma virale ............................................................................................................................................. 79

Resistenza al virus.......................................................................................................................................... 80

Impedimento all’assorbimento ................................................................................................................. 80

Inattivazione del DNA virale ...................................................................................................................... 81

Trasferimento genico e ricombinazione genetica ......................................................................................... 81

Trasformazione .......................................................................................................................................... 82

Coniugazione ............................................................................................................................................. 83

Trasduzione ............................................................................................................................................... 85

Eumiceti ............................................................................................................................................................. 88

La riproduzione asessuale (processo di mitosi) negli eumiceti ..................................................................... 88

Lieviti ............................................................................................................................................................. 89

Muffe ............................................................................................................................................................. 89

La riproduzione sessuale (processo di meiosi) negli eumiceti ...................................................................... 91

Classificazione in funzione del micelio .......................................................................................................... 92

© Laila Pansera - 3

I funghi fruttiferi ............................................................................................................................................ 93

Principi di tassonomia ....................................................................................................................................... 94

PCR – reazione a catena delle polimerasi .......................................................................................................... 96

© Laila Pansera - 4

Microbiologia

La microbiologia coinvolge molte aree disciplinari e

viene applicata in molti contesti: in sostanza è

difficile individuare un settore dove non servano

competenze di microbiologia.

I microrganismi vengono usati sostanzialmente in

tre modi:

• per la PRODUZIONE;

• occorre tenere d'occhio il CONTROLLO;

• occorre EVITARE CHE DANNEGGINO LA

SALUTE o che ALTERINO LE

CARATTERISTICHE del prodotto.

Quindi quando si parla di microrganismi occorre

fare attenzione alla loro utilità ma anche alla

sicurezza, perché esistono microrganismi associati

fenomeni di patogenesi. In altre parole un

microrganismo può avere due utilità, che dipendono dal contesto. Per esempio le muffe nel

gorgonzola sono indispensabili per ottenere il prodotto finale, mentre nella marmellata sono

segno di una cattiva conservazione. Per quanto riguarda i microrganismi patogeni, per loro non

c'è una seconda possibilità, ovvero se sono patogeni lo sono e non possono portare benefici al

prodotto, ma solo danneggiare l'uomo.

Sono moltissime le produzioni alimentari che necessitano di microrganismi per ottenere i loro

prodotti: per esempio il settore caseario (per la produzione di yogurt, burro, etc), la

produzione di bevande alcoliche (ho bisogno di lieviti e batteri), nell'industria del cacao (che

necessita di una fermentazione microbica per ottenere la polvere di cacao), nella produzione

degli insaccati, nella produzione di prodotti da forno (ho bisogno di lieviti e batteri), etc.

È rarissimo trovare alimenti che non contengano una componente microbica.

Per esempio se seguiamo il percorso di un supermercato da reparto frutta e verdura, passando

per il banco frigo con i prodotti caseari, passando per i prodotti con microrganismi probiotici,

fino ad arrivare all'ultimo reparto che quello del vino, notiamo che in tutti questi prodotti sono

dei microrganismi con funzioni diverse.

Altri esempi di utilizzo dei microrganismi possiamo averli nell'industria farmaceutica, dove per

esempio i microrganismi vengono utilizzati per produrre antibiotici, insulina, etc, o nel settore

che si occupa di purificare acqua e reflui contaminati.

© Laila Pansera - 5

Microrganismi

Con la parola microrganismi si intendono organismi di piccole dimensioni per osservare i quali

ho bisogno del microscopio.

Essi comprendono:

BATTERI

▪ FUNGHI

▪ ALGHE

▪ PROTOZOI

Normalmente sono

unicellulari e la cellula è

organizzata in:

• membrana cellulare;

• parete cellulare;

• DNA o materiale nucleare;

• citoplasma.

Occorre distinguere i microrganismi seguendo il percorso storico:

1 Questa nuova

2 suddivisione si basava

sul fatto che al

microscopio si

distinguevano cellule

3 con struttura semplice

da quelle con struttura

complessa.

4

5

Antonj van Leeuwenhoek (1632-1723) è stato il primo ad usare un microscopio rudimentale

e a disegnare i microrganismi per come li vedeva da microscopio.

© Laila Pansera - 6

Esistono quindi TRE DOMINI: BACTERIA, ARCHAEA ed EUCARYA, che differiscono

sostanzialmente per la struttura della cellula.

La cellula eucariote ha una struttura compartimentata:

ha una membrana nucleare in cui è contenuto il nucleo;

▪ ha organelli delimitati dalle loro membrane (mitocondri,

▪ plastidi, etc);

non ha la parete cellulare;

▪ la struttura dei ribosomi è 80s.

La cellula procariote (archea e batteri) non è

compartimentata: ha il materiale nucleare disperso nella

cellula, non ha organelli, la parete cellulare esiste solo nei

batteri, infine hanno ribosomi 70s.

Un’altra differenza importante tra la cellula procariote e quella

eucariote sono le dimensioni: un batterio può essere grande circa 1 µm, mentre una cellula

eucariote può avere dimensioni 10-50-100 volte maggiori.

1 µm = 10 m

-6

1 µm = 10 mm

-3

µm = (micron o micrometro) © Laila Pansera - 7

Principali caratteri distintivi tra procarioti ed eucarioti

Oltre alle caratteristiche sopra citate ricordiamo

che i procarioti hanno un solo cromosoma, in

alcuni casi anche due, ma in singola copia,

mentre gli eucarioti possiedono più cromosomi e

in doppia copia. I procarioti non fanno la

riproduzione sessuale, in quanto fanno solo

mitosi e non meiosi, mentre gli eucarioti fanno

sia mitosi che meiosi, quindi hanno la possibilità

della riproduzione sessuale. Fra le strutture

citoplasmatiche ricordiamo che i procarioti non

hanno organelli (mitocondri e cloroplasti), a

differenza degli eucarioti che li hanno. In più gli

eucarioti hanno ribosomi 80s, mentre i procarioti li hanno 70s.

Ribosomi

La S che troviamo nella dicitura dei ribosomi non è altro che l’unità di misura della loro

dimensione. In altre parole S è il coefficiente di sedimentazione (in secondi). Per ottenere

questo coefficiente occorre mettere i ribosomi in sospensione in una provetta, mettere una

provetta in una centrifuga e vedere a quanto corrisponde la velocità di sedimentazione, ovvero

in quanto tempo il mio ribosoma raggiunge il fondo della provetta. Più grande è il mio

ribosoma maggiore sarà la mia velocità di sedimentazione.

s = v / ω r

2

v = velocità di sedimentazione (massa, densità propria e del mezzo, al campo centrifugo applicato

ω = velocità angolare del rotore in radianti/s

r = distanza radiale della particella dall’asse di rotazione, cm

Siccome s dipende dalla viscosità, densità del mezzo e dalla sua temperatura, s di una molecola

viene riferito a quel valore che si otterrebbe se il mezzo fosse acqua a 20 °C. I valori comuni di s

per le molecole organiche sono nell’ordine di 10-13 sec che equivale per convenzione a 1 unità

Svedberg (S). Quindi se rRNA a s = 5 10-13 si dice che ha un coefficiente pari a 5S.

Mitosi e meiosi

La mitosi è la divisione della cellula in due cellule figlie.

Avviene sia nei procarioti che negli eucarioti. Invece la

meiosi è la riproduzione sessuata che avviene solo negli

eucarioti. Quindi per gli eucarioti ho due possibilità di

riproduzione: mitosi e meiosi. © Laila Pansera - 8 Procarioti: mitosi

Eucarioti: mitosi Eucarioti: meiosi

Origine degli eucarioti

Gli eucarioti si sono ottenuti dalla fusione di due organismi procarioti (forse un batterio e un

archea). Uno degli organismi si è insediato nell’altro ed è diventato un organello della cellula

complessa che si è formata. Quindi la simbiosi è alla base dello sviluppo degli organismi

superiori. Infatti per esempio i mitocondri sono ciò che rimane di una cellula entrata in

un’altra e ha fatto simbiosi. Arrivo a questa tesi osservando la cellula. All’interno della cellula

eucariotica troviamo due tipi di DNA: quelo contenuto nel nucleo (diviso durante la divisone

della cellula) e quello mitocondriale (ereditato interamente dalla cellula madre). Quindi da

questa osservazione deduco che il mitocondrio sia stata in passato una cellula a parte.

Da quanto tempo i microrganismi esistono sul nostro pianeta?

4 miliardi di anni fa iniziano ad apparire sul nostro pianeta organismi procarioti anaerobi,

siccome l’ossigeno non è ancora presente sul pianeta. Successivamente si sviluppano organismi

fotosintetici e solo 3 milioni di anni fa compaiono i primi ominidi.

Forme dei microrganismi

La forma base dei microrganismi può essere di 2 tipi:

© Laila Pansera - 9

• a bacilli

• a cocchi

Essi poi possono congiungersi con altri simili e costituire formazioni di varia forma, ma i

microrganismi rimangono sempre organismi unicellulari indipendenti che svolgono le loro

funzioni vitali a prescindere dal fatto che siano posizionati adiacenti a loro simili. Otteniamo

così formazioni a catenelle, a petali, a cubo, grumi sferici, catene spiraliformi etc…

Il microscopio

La dimensione più piccola che l’occhio riesce a distinguere è mezzo millimetro (oppure 1 mm

se ci vedo male), un batterio è grande massimo 1 µm, quindi per riuscire a vederlo a 1 mm devo

ingrandire 1000 volte. I microscopi ottici ingrandiscono 1000 o 2000 volte.

© Laila Pansera - 10

Struttura del microscopio

• struttura che contiene una sorgente luminosa,

• piano di appoggio,

• cuore: lenti negli obiettivi (100 o 200 ingrandimenti) + lenti nell’oculare (10x),

• condensatore.

I microscopi hanno obiettivi intercambiabili a seconda dell’oggetto che voglio ingrandire. In

più gli obiettivi sono dotati di una struttura telescopica alla fine dell’obiettivo che è in grado di

rientrare di qualche millimetro se entra a contatto con il vetrino, in modo da non rompere il

vetrino.

Percorso della luce nel microscopio: dalla sorgente luminosa la

luce viene convogliata in un diaframma che regola la quantità di

luce, poi la luce va nel condensatore, poi attraversa il vetrino, il

microrganismo e il vetrino copri oggetto e alla fine raggiunge

l’obiettivo.

Gli obiettivi possono essere di 2 tipi:

1. a immersione (con olio)

2. a secco (con aria)

Ovviamente questa distinzione avviene solo quando devo usare il microscopio alla massima

potenza e quindi mi trovo con le lenti vicinissime all’oggetto da analizzare. I primi utilizzano

una goccia di olio sintetico tra l’obiettivo e il vetrino, siccome l’olio ha lo stesso indice di

rifrazione del vetro ottengo una risoluzione migliore perché perdo una minore quantità di

raggi luminosi. Se invece ho dell’aria tra il vetrino e l’obiettivo ottengo una peggiore risoluzione

poiché l’aria ha una diversa rifrazione e fa perdere diversi raggi luminosi.

© Laila Pansera - 11

Per quanto riguarda la luce che regolo col diaframma, più mi avvicino all’oggetto con

l’obiettivo, più luce devo avere e più apro il diaframma. Al contrario, se

mi allontano dall’oggetto perché non ho bisogno del massimo dello

zoom, chiudo il diaframma perché ho bisogno di meno luce dalla mia

fonte luminosa.

Il potere risolutivo è la capacità di distinguere due oggetti vicini fra

loro.

Un virus è molto più piccolo di un batterio (si misura in nanometri), per cui per osservarlo

occorre un microscopio elettronico.

Il fascio di luce intenso rende trasparente il microrganismo che voglio analizzare, per cui devo

adottare delle soluzioni in modo tale da rendere visibile ciò che risulterebbe trasparente.

Per distinguere un oggetto trasparente da uno non trasparente introduco il concetto di oggetto

di fase e oggetto di ampiezza. Nell’oggetto di fase l’onda luminosa attraversa il vetrino e non

subisce una variazione, mentre nell’oggetto di

ampiezza l’onda subisce una variazione e questo

permette di creare delle zone più scure che sono i

microrganismi.

1. Coloro il microrganismo, ovvero aggiungo

sostanze che contrastano in maniera forte con

il mezzo (acqua o vetrino). Questo metodo fa

sorgere un problema: la colorazione influenza

la vitalità dei microrganismi, in altre parole se i

microrganismi vengono colorati muoiono. In

© Laila Pansera - 12

questo modo quando coloro un batterio da oggetto di fase lo faccio diventare oggetto di

ampiezza.

2. Utilizzo un microscopio contrasto di fase. Con questo tipo di microscopio osservo i

microrganismi senza aggiungere nulla alla soluzione. Questo avviene perché il microscopio

ha una struttura particolare. Il diaframma è anulare, quindi la luce passa solo in una corona,

i raggi luminosi vanno al condensatore e convergono nel vetrino. Il fascio di luce al vetrino

può avere due destinazioni: o non colpisce il microrganismo oppure lo colpisce e viene

deviato. Il cuore del sistema è l’anello di fase: un disco di materiale trasparente con una

corona circolare posta sopra. I raggi non deviati toccano l’anello di fase dove è più spesso

mentre i raggi deviati toccano l’anello dove è sottile. Questo meccanismo fa sì che avvenga

la somma di onde diverse, per cui se vengono sommate due onde in fase il risultato è che

vedo trasparente, mentre se vengono sommate due onde con fase invertita vedo scuro. Così

ho la possibilità di vedere il microrganismo. In un microscopio contrasto di fase tutto deve

essere allineato in modo perfetto altrimenti va fuori fase.

Un lievito si può vedere anche con un microscopio ottico normale, ma usando quello contrasto

di fase ottengo una visione quasi tridimensionale.

Nomenclatura binomiale

A differenza della biologia tradizionale in cui il concetto di specie è legato alla riproduzione

sessuata, in microbiologia non è possibile fare riferimento ad essa perché non esiste in tutti i

microrganismi.

L’unità tassonomica più piccola che posso descrivere in microbiologia è la specie. Per cui mi

trovo di fronte a una classificazione di questo tipo:

1. DOMINIO

2. REGNO

3. PHYLUM

4. CLASSE

5. ORDINE

6. FAMIGLIA

7. GENERE

8. SPECIE

9. (CEPPO)

Il ceppo serve per individuare le biodiversità che si trovano all’interno di una specie, ma non è

un’indicazione obbligatoria da utilizzare, per cui non è sottoposto a regole precise di scrittura.

Generalmente si indica con una sigla.

Esempi: Quando indico il genere dico la

Saccharomyces cerevisae è un lievito. prima parola, quando dico la

(genere) (specie) specie devo dirle entrambe.

Bacillus e Clostridium sono due generi di batteri.

© Laila Pansera - 13

La membrana cellulare

La membrana cellulare è una struttura

molecolare che separa l’interno della cellula

dall’ambiente esterno. Essa non ha una

struttura casuale, ma è organizzata nella

maggior parte dei casi in un doppio strato

fosfolipidico.

I fosfolipidi sono dei lipidi con una

struttura particolare:

• una testa polare (idrofilica) che è

costituita da una molecola polare

legata ad uno dei carboni del glicerolo

tramite legame fosfato;

• una coda apolare (idrofobica)

formata da due catene di acidi grassi.

Questa struttura fa in modo che i

fosfolipidi in ambiente acquoso si

organizzino spontaneamente in doppio strato.

Il doppio strato non è rigido, bensì fluido, e questa proprietà della membrana è dettata da due

condizioni: il tipo di fosfolipide presente in essa e la temperatura, che tanto è più alta, tanto

aumenta la fluidità della membrana. La temperatura è uno dei fattori ambientali sulla base

della quale vengono classificati i microrganismi ed è un parametro importante per regolare la

presenza dei microrganismi. Per esempio i microrganismi che

vivono ad alte temperature non presentano un doppio strato di

fosfolipidi nella membrana, ma essa è formata da un monostrato

lipidico di tetraedri di diglicerolo. In questo caso avere uno

strato di tetraedri di diglicerolo dona alla membrana più rigidità

perché è la membrana di cellule che vivono ad alte temperature

(batteri estremofili termofili) che altrimenti non resisterebbe.

Molecole tensioattive: in grado di disgregare la membrana cellulare. I saponi sono tensioattivi.

Le funzioni della membrana cellulare sono molteplici:

barriera permeabile: separa l’interno della cellula dall’ambiente

▪ esterno, ma allo stesso tempo è una superficie che attua il trasporto

di nutrienti e metaboliti dall’interno all’esterno e viceversa;

sito di ancoraggio delle proteine, strutture deputate al trasporto

▪ dei metaboliti e dei nutrienti;

conservatore di energia: la membrana non è permeabile alle

▪ molecole cariche (per esempio ioni H e OH ), per cui impedisce

+ -

© Laila Pansera - 14

passaggi incontrollati di ioni e allo stesso tempo tiene le cariche separate, per cui crea

dell’energia (cariche separate=creazione energia). In più la concentrazione elevata di ioni

OH all’interno della cellula fa in modo che il pH all’interno sia più elevato rispetto

-

all’esterno delle cellula.

Sistemi di trasporto

I sistemi di trasporto nella membrana sono generalmente di origine proteica, si inseriscono

nella membrana e veicolano il passaggio delle sostanze dall’interno all’esterno della cellula e

viceversa. Abbiamo diversi tipi di trasporto:

1. Diffusione: la molecola interessata passa attraverso la

membrana o attraverso un poro semplicemente;

2. Trasporto semplice: la molecola interessata passa attraverso

la membrana grazie ad una proteina che ne veicola il

passaggio. Ne esistono di 3 tipi:

• Uniporto: classificabile anche come diffusione

facilitata, una molecola entra nella cellula grazie alla

proteina;

• Antiporto: una molecola entra nella cellula e

contemporaneamente una molecola esce;

• Simporto: due molecole entrano nella cellula e una delle due facilita il trasporto

dell’altra;

Gli ultimi due trasporti vengono anche definiti trasporti secondari, perché per portare

all’interno della cellula una molecola hanno bisogno di un’altra molecola che esca o che

entri insieme a quella interessata. Questi sistemi servono a modulare il trasporto di

moltissime molecole.

Per esempio i microrganismi che intervengono nella formazione dello yogurt sono lo

Streptococcus thermophilus e il Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, che vivono a

temperature tra i 37° e i 42° C. Essi si nutrono degli zuccheri del latte, perciò del lattosio.

Perciò hanno sulla membrana delle proteine atte a trasportare all’interno della cellula il

lattosio. Il processo avviene in questo modo: per portare il lattosio all’interno della cellula

uso il simporto (A), che permette l’entrata nella cellula di ioni H per gradiente (perché

+

sono molto concentrati) che si portano dietro anche lo zucchero. Una volta nella cellula il

lattosio viene scisso in galattosio e glucosio dall’enzima β-galattosidasi, il glucosio viene

utilizzato per il metabolismo del microrganismo mentre il galattosio viene portato

all’esterno della cellula tramite una proteina che agisce per antiporto (B), ovvero viene

sfruttata la concentrazione elevata di galattosio all’interno della cellula per portar dentro

del lattosio utile alla cellula stessa. I due sistemi A e B sono diversi, perché la cellula ha

bisogno che rimanga al suo interno quello che le serve, per cui necessito sistemi specifici.

All’inizio della crescita di questi batteri ho solo il veicolo A, quando inizio ad avere

© Laila Pansera - 15

concentrazione di galattosio inizio a espellerlo e far entrare nuovo lattosio (che è sempre

meno concentrato) nella cellula tramite il sistema B.

+

H lattosio Gal lattosio

simporto antiporto

A B

Lattosio enzima β-galattosidasi Glu + Gal

 

Le proteine che attuano il trasporto delle molecole

hanno una struttura particolare: possiedono degli

spazi in cui vengono posizionate le molecole e

quando le molecole sono in sede la proteina si

capovolge e porta dentro ciò che si era posizionato

nella sede esterna e fuori ciò che era nella sede

interna.

Il fatto che nello yogurt vengano messi questi batteri significa che in esso c’è una grande

quantità di galattosio libero. Un altro caso in cui ho molto galattosio è nella mozzarella,

infatti quando la metto sulla pizza e diventa scura vuol dire che c’è il galattosio. Per questo

devono esserci tipi di mozzarella con poco galattosio, per evitare questo fenomeno.

3. Traslocazione di gruppo: coinvolge 5 proteine e porta all’interno della cellula zuccheri o

fonti di carbonio. Il sistema è formato da una struttura proteica trans-membrana che

riconosce lo zucchero e vi interagisce direttamente. Ci sono poi altre proteine che

intercettano il fosfoenolpiruvato e lo trasferiscono allo zucchero per legarlo con un legame

fosfato, molto energetico. Per cui lo zucchero che arriva alla proteina trans-membrana

viene subito legato a un piruvato, nel caso sia glucosio, diventa glucosio 6-fosfato. Questo

metodo di trasporto è anche detto sistema PEP-PTS o fosfoenolpiruvato

fosfotransferasi. Il fosfoenolpiruvato è il penultimo intermedio della glicolisi, per cui

questo sistema è legato anche al metabolismo della cellula.

© Laila Pansera - 16

4. Sistema ABC (ATP bynding cassette): in questo sistema di

trasporto consumo una molecola di ATP per consentire

l’ingresso dello zucchero.

Per aumentare il trasporto di zuccheri o molecole in generale all’interno della cellula posso

operare in due modi: il primo, poco efficiente, è quello di cercare di accelerare i processi che mi

permettono l’assorbimento di molecole dall’esterno, il secondo, più utile, è quello di aumentare

la quantità di proteine trans-membrana atte al trasporto delle sostanze interessate. Infatti la

cellula è in grado di aumentare o diminuire le proteine trans-membrana secondo le sue

necessità. © Laila Pansera - 17

La parete cellulare (batterica)

La parete cellulare è una struttura presente nei procarioti (batteri) e non ha niente a che

vedere con la parete presente nelle cellule vegetali, tantomeno con quella presente nei lieviti.

Osservando al microscopio diversi batteri notiamo che esistono due diversi tipi di

organizzazione strutturale della parete cellulare. Incontriamo:

• Gram positivi

• Gram negativi

La parete serve a conferire rigidità alla cellula, per cui è una struttura rigida, come una sorta di

rete costituita da polimeri degli amminozuccheri e peptidi, tenuti insieme da legami covalenti.

Questa è una differenza notevole con la membrana, infatti quest’ultima è costituita da

fosfolipidi non legati fra loro da legami forti, ma solo accostati, per cui la membrana è fluida,

mentre la parete è solida.

La parete, che prende il nome di peptidoglicano, è formata da:

• Una catena formata da due amminozuccheri alternati legati da legame glucosidico: N-

acetil-glucosamina (NAG) e acido N-acetil-muramico (NAM);

• Tramite legame peptidico al NAM legano i peptidi che completano la struttura della maglia:

infatti formano poi ponti interpeptidici fra di loro.

La parete ospita anche acidi teicoici, acidi lipoteicoici e proteine di parete. Gli acidi teicoici

fanno legami covalenti con i gruppi 6-ossidrile dell’acido muramico e possiedono cariche

negative dovute a legami fosfodiestere. Nel momento in cui essi perdono il fosfato diventano

acidi teicuronici. Le proteine invece in alcune specie organizzano uno strato tipo pavimento,

ma non sappiamo l'utilità di questo rivestimento. I

Lactobacillus helveticus possiedono questo strato

abbondante.

La parete ha una funzione molto importante per la cellula

procariote.

Se immergo un microrganismo in una soluzione

ipotonica (con bassa concentrazione in sali), l’acqua per

diffusione entra nella cellula, perché passa da una bassa

concentrazione di sali ad una concentrazione più elevata

© Laila Pansera - 18

(all’interno della cellula). Questa tendenza continua fino a quando la pressione osmotica

all’interno della cellula eguaglia quella all’esterno. Seguendo questa tendenza se la cellula

batterica non avesse la parete che le permette di gonfiarsi e riempirsi entro un certo limite,

continuerebbe a riempirsi di acqua fino alla lisi (rottura provocata dallo scoppio).

Se invece immergo il microrganismo in soluzione isotonica (con la stessa concentrazione di

sali) e la parete viene destrutturata, la cellula non assorbe acqua perché non deve diminuire la

sua concentrazione osmotica, per cui è in equilibrio e viene chiamata protoplasto.

Questo si è potuto verificare facendo in modo che venga destrutturata la parete. Per fare ciò ho

bisogno di un enzima apposito, il lisozima, che si trova nella saliva, nelle lacrime e nel latte.

Non a caso si trova in questi fluidi: infatti questo enzima con la sua attività destabilizzante della

parete batterica protegge dallo sviluppo di microrganismi (batteri) dannosi. Infatti se

destabilizzo la parete cellulare rendo la cellula batterica più vulnerabile e più facilmente

distruttibile.

Due esempi dell’applicazione del lisozima:

In campo alimentare, nella produzione di Grana Padano viene inserito del lisozima (preso

dall’albume d’uovo) all’interno del formaggio. Questo perché nella forma che stagiona per un

lungo periodo possono essere presenti microrganismi anaerobi che a formaggio fresco non

provocano danni, ma durante la stagionatura approfittano della grande presenza di peptidi e

fonti di carbonio (galattosio) per crescere, producendo CO , che provoca il gonfiore e la rottura

2

della forma. Nel Parmigiano Reggiano invece non è consentito l’inserimento di lisozima nel

formaggio, perché il problema della proliferazione di microrganismi non sussiste. Infatti questo

problema è determinato dall’alimentazione dei bovini che producono il latte. Nel caso del

Parmigiano vengono alimentati solo con fieno fresco, per il Grana invece i bovini vengono

alimentati anche con insilati (fermentati vegetali), che possono essere l’ambiente ideale per lo

sviluppo di microrganismi problematici per la produzione di formaggi stagionati.

campo medico, esistono molti antibiotici in grado di bloccare la crescita dei microrganismi

In

perché impediscono loro di sviluppare la parete, come la penicillina e l’avancomicina. Gli

antibiotici sono molecole in grado di interagire con un processo preciso di una cellula e

interferire con la sua crescita, provocandone anche la morte. Per questo gli antibiotici non

funzionano quando agiscono per bloccare un processo già avvenuto, per esempio non posso

usare la penicillina per evitare lo sviluppo della parete di cellule che già l’hanno sviluppata. Gli

antibiotici non possono essere utilizzati per curare infezioni non batteriche, per esempio

l’influenza, di origine virale, non può essere curata con antibiotici.

Gram positivo e Gram negativo

I batteri Gram positivi possiedono una

▪ parete cellulare di spessore normale e una

sola membrana cellulare; © Laila Pansera - 19

I batteri Gram negativi possiedono una parete sottile posta tra una membrana interna ed

▪ una esterna.

La differenza tra Gram positivo e negativo non è irrilevante, perché una parete molto sottile

conferisce alla cellula una vulnerabilità maggiore, in più se la parete è circondata da due

membrane è facilmente attaccabile da tensioattivi.

La colorazione di Gram serve a distinguere Gram positivi da Gram negativi. Il procedimento è

il seguente: dopo la distribuzione delle cellule su un vetrino e l'eliminazione dell'acqua in

eccesso (perché le cellule sono in sospensione), avviene il fissaggio, ovvero scaldo il vetrino su

una fiamma per fissare le cellule. Ora arriva la procedura vera e propria:

1. colorazione primaria: tratto il batterio con cristalvioletto;

2. mordente: aggiungo liquido di Lugol (soluzione di ioduro di potassio e iodio), che si

complessa sia con il cristalvioletto che con il materiale cellulare;

3. decolorazione (fase più importante): aggiungo etanolo in maniera copiosa. Esso scioglie la

membrana fosfolipidica. A questo punto riconosciamo i Gram positivi perché sono ancora

colorati di blu, mentre nei Gram negativi la sottile parete non riesce a mantenere il

precipitato colorato, per cui la cellula perde il suo colore. Osservando al microscopio i due

tipi di cellula ora notiamo che i Gram positivi sono blu, mentre quelli negativi sono

trasparenti;

4. colorazione di contrasto: aggiungo un secondo colorante, la safranina, di un colore più

tenue, così da non coprire le cellule colorate in blu, ma da dare colore alle cellule

decolorate; alla fine della colorazione le cellule blu sono Gram positivi, mentre quelle rosa

sono Gram negativi.

La colorazione di Gram è utilizzata a livello ospedaliero per poter somministrare l'antibiotico

più idoneo. La colorazione andrebbe sempre fatta su colture microbiche non troppo vecchie: se

metto in coltura microrganismi per più di 24 ore i Gram positivi formano degli strati zuccherini

al di sopra della parete e una volta colorati assumono una colorazione simile a quella dei Gram

negativi.

Biosintesi del

peptidoglicano e funzione

degli antibiotici

La struttura della parete cellulare è molto

complessa, quindi non può essere

costruita per intero all'interno della

cellula e poi portata al suo posto intera.

Per questo all'interno della cellula

vengono prodotti e assemblati dei

dipeptidi, che poi vengono trasportati

© Laila Pansera - 20

all'esterno della cellula, si legano con altri dipeptidi e formano i tetrapeptidi, che si legano con

lo zucchero.

Molti antibiotici, come la penicillina e la cefalosporina, hanno la funzione di bloccare il

meccanismo che forma la parete cellulare. Essi interagiscono con alcune proteine coinvolte

nella costruzione della parete oppure con i precursori degli elementi che formano la parete e

impediscono la formazione della parete stessa. Per esempio la vancomicina agisce quando

viene trasportato il dipeptide D-alanina – D-alanina e si lega ad esso, sottraendolo alla sintesi

della parete. Il microrganismo però può produrre un meccanismo di resistenza all'antibiotico:

può riuscire a sostituire il dipeptide con una struttura simile ma non attaccabile dalla

antibiotico (perché gli antibiotici agiscono in maniera specifica e cambiando il target del

antibiotico non agiscono più): in questo caso il dipeptide diventa D-alanina – D-lattato, la

parete continua il suo sviluppo senza interferenze da parte del antibiotico.

Da ricordare c’è che l’antibiotico coadiuva quello che fa dopo il sistema immunitario, cioè se

l’antibiotico fa il suo effetto di diminuire i microrganismi patogeni, poi il sistema immunitario

reagisce.

Nel mondo ci sono dei parametri da rispettare per quanto riguarda l’utilizzo di microrganismi a

livello alimentare, perché non possono essere introdotti con l’alimentazione microrganismi che

favoriscano la proliferazione e lo sviluppo di batteri patogeni nel corpo umano. In particolare i

batteri per uso alimentare devono rispondere ai requisiti stabiliti da organizzazioni

internazionali:

• per gli USA l’organizzazione è la FDA (Food and Drug Administration) e devono portare

la sigla GRAS (Generally Recognized As Safe);

• per l’Europa, secondo l’EFSA (European Food Safety Authority) devono portare la sigla

QPS (Qualified Presumption of Safety).

Nello yogurt ho miliardi di cellule vive che vengono ingerite, esse hanno la struttura D-alanina

– D-lattato, quindi resistono alla vancomicina, ma non sono microrganismi patogeni quindi non

è un problema. Ma se questa resistenza agli antibiotici dei microrganismi è stata acquisita da

altri microrganismi e può essere trasferita a nuovi microrganismi sorge il problema, perché

una volta ingeriti questi batteri essi potrebbero trasferire la loro resistenza a microrganismi

patogeni che potrebbero proliferare nell'organismo. Un microrganismo per essere definito QPS

può essere resistente ad un antibiotico ma questa resistenza deve essere tipica della specie,

quindi non acquisita e non trasferibile. In altre parole le resistenze agli antibiotici sono

rilevanti solo quando sono trasferibili ad altre specie.

Se io somministro antibiotici ad un animale, essi poi finiscono in tutti i prodotti dell'animale

stesso. Somministrare antibiotici per curare delle infezioni degli animali è legale, mentre

somministrarli a scopo preventivo è vietato dalla legge, perché in questo modo non faccio altro

che selezionare i microrganismi in grado di resistere agli antibiotici, arricchisco le loro

comunità, sia che siano buoni sia che siano patogeni, mentre i microrganismi più deboli

vengono eliminati dagli antibiotici. Fino a qualche anno fa non era illegale la pratica della

© Laila Pansera - 21

somministrazione di antibiotici ad animali che non ne avevano bisogno, ora che è illegale

questa procedura viene fatta in alcuni casi di nascosto.

© Laila Pansera - 22

La parete cellulare dei lieviti (eucarioti)

La parete dei lieviti ha uno spessore di

circa 100-200 nm e costituisce il 15-

25% della massa secca della cellula.

Essa ha una composizione distinta in

base alla specie di lievito presa in esame

e ha una struttura completamente

diversa rispetto a quella dei procarioti.

Non ha una struttura regolare, ma

disordinata. Trovo, dopo uno spazio

periplasmatico tra la parete vera e

propria e la membrana:

• uno strato sottile di chitina (polimero di N-acetilglucosammina): essa si concentra, oltre

che omogeneamente su tutta la cellula, nelle zone dove avviene la

gemmazioneriproduzione asessuata; in alcune specie è quasi assente, mentre nei lieviti

filamentosi è presente in percentuali maggiori. In Saccharomyces cerevisiae la chitina svolge

diverse funzioni, infatti è un recettore di tossine killer, mantiene l’integrità osmotica e

morfologica ed è il maggior costituente delle cicatrici di gemmazione;

• uno strato di glucani (polisaccaridi anche ramificati) e mannani;

• uno strato di mannoproteine, polimeri del mannosio legati a proteine, che rappresentano

la parte superficiale della parete e si legano tra di loro mediante interazioni idrofobiche e

ponti disolfuro, e si legano al glucano mediante legami covalenti;

Il tipo di composizione delle mannoproteine e dei glucani dipende da individuo a individuo

della stessa specie. La differente tipologia di parete di questi individui è rilevante quando i

lieviti vengono usati per la fermentazione. Essi infatti possono:

 flocculare (andare verso il fondo, bottom yeast) se la matrice del lievito ha una densità

maggiore rispetto al liquido in cui è emersa;

 flottare (andare in superficie, top yeast) se la matrice del lievito intrappola la CO che

2

porta il lievito verso la superficie come una bolla.

Se ho un’infezione da lievito non la curo con antibiotici ma con fungicidi.

© Laila Pansera - 23

Nutrizione e crescita batterica

Per sapere come avviene la crescita di un microrganismo è necessario capire quale sia per esso:

• la fonte di energia

• la fonte di carbonio

Differenzio quindi 4 categorie in base a come i microrganismi recuperano l’una e l’altra:

1. organismi FOTOAUTOTROFI

recuperano energia dalla luce e carbonio dalla CO 2

sono i più indipendenti nella crescita, i primi colonizzatori di un

ambiente

2. organismi FOTOETEROTROFI

recuperano energia dalla luce e carbonio dalla sostanza

organica

3. organismi CHEMIOAUTOTROFI

recuperano energia dalla sostanza inorganica (ammonio,

nitrati..) e carbonio dalla CO 2

sono i primi colonizzatori di ambienti senza luce, tipo fondali

oceanici

4. organismi CHEMIOETEROTROFI

recuperano energia e carbonio dalla sostanza organica

Di quest’ultima categoria fanno parte la maggior parte degli essere

viventi, noi compresi. Noi ci occupiamo di questa categoria perché i

batteri che hanno a che fare dell’alimentazione vi appartengono.

Terreni di coltura

I terreni di coltura sono soluzioni di nutrienti usate per far crescere i microrganismi in

laboratorio.

Essi vengono preparati in contenitori appositi detti piastre Petri, in cui vengono inseriti i

nutrienti necessari per la crescita dei microrganismi scelti. I terreni di coltura possono essere

solidi o liquidi ma generalmente vengono preferiti quelli solidi perché i microrganismi che

vengono fatti crescere al loro interno rimangono isolati in colonie e non si mescolano fra loro,

in questo modo le colonie sono visibili ad occhio nudo. Per ottenere un terreno di coltura solido

(gelatinoso) devo aggiungere dell’agar nella soluzione di acqua e nutrienti. L’agar è un

polisaccaride che si trova nelle alghe rosse ed è utilizzato come addensante dei terreni di

coltura per le sue caratteristiche importanti:

• è un substrato inerte perché non può essere utilizzato dai microrganismi come fonte di

carbonio;

• non interferisce con il pH e con la disponibilità degli altri nutrienti;

© Laila Pansera - 24

• è presente come una polvere insolubile, si scioglie in soluzione acquosa a 100° e indurisce a

40°, ma una volta solido resiste a temperature fino agli 80°.

Le colture microbiche possono essere inoculate (distribuite) in tre modi:

• in superficie, con un’ansa

• in superficie, per spatolamento

• per inclusione (ovvero all’interno della matrice dove crescono più protetti)

Se uso la tecnica di superficie la coltura viene distribuita con un’ansa su

una parte della piastra Petri con la tecnica dello striscio, poi la zona in cui

sono stati messi i microrganismi viene diluita passando l’ansa e

trasferendo le cellule in altre zone della piastra allo scopo di lasciare i

microrganismi il più possibile distanziati l’uno dall’altro. A questo punto

chiudo la piastra col coperchio e la pongo nel contesto atmosferico

(temperatura, umidità etc) necessario per fare in modo che i

microrganismi crescano e si dividano. Questo periodo è detto di incubazione e una sua

peculiarità in terreno solido è il fatto che la piastra venga messa a testa in giù in modo che se si

forma la condensa sul coperchio non cada sul terreno di coltura creando un substrato bagnato

che permette alle cellule di muoversi e mescolarsi. Alla fine di questa fase io posso riconosce ad

occhio nudo degli agglomerati di microrganismi, detti colonie batteriche. Ciascuna colonia

batterica che posso vedere è originata da una cellula che si è duplicata molte volte.

Un altro metodo per inoculare i microrganismi in superficie sul terreno di coltura è quello di

diluirli e poi prelevarne una goccia e

metterla sulla piastra, spargendola con la

spatola.

Se vedo molte colonie vicine sono in

presenza di un tappeto.

Se invece inoculo per inclusione devo

prima inserire i microrganismi nella piastra

e poi mettere sopra il terreno che ingloba le

cellule e poi solidifica.

Le caratteristiche visive

delle colonie mi danno

indicazioni su che tipo di

microrganismi le componga.

Le colonie vengono

classificate secondo forma,

spessore, margine e colore. © Laila Pansera - 25

La caratteristica fondamentale che deve avere un terreno di coltura è quella di essere sterile,

così come il contenitore e tutti gli strumenti utilizzati per la coltura microbica. In caso contrario

introdurrei microrganismi estranei rispetto a quelli che devo mettere in coltura. La

sterilizzazione che applico per trattare gli strumenti e il terreno di coltura è detta assoluta, e a

differenza di quella alimentare che può lasciare la presenza di certi microrganismi, essa non

può permettere la contaminazione del terreno da parte di altri microrganismi. Consiste in un

trattamento termico con calore umido, che supera le temperature di 100° per un periodo di

tempo e in sovrappressione in modo da non lasciare microrganismi vivi. Un terreno è sterile se

viene messo in incubazione senza essere inoculato e non produce colonie.

Nei terreni di coltura devo mettere tutto ciò che serve a un

microrganismo per crescere. Per sapere cosa dare a uno specifico

microrganismo devo vedere la struttura della sua cellula.

Dalla tabella emerge che le principali fonti nutrizionali per un terreno

di coltura sono carbonio, azoto e fosforo. In particolare il carbonio si

trova in quasi tutte le parti della cellula (membrana, parete..), l’azoto

nelle proteine e nelle basi azotate, il fosforo serve per costruire le

membrane degli acidi nucleici. Nella preparazione del terreno di coltura

non tengo conto dell’idrogeno perché è presente nelle molecole

organiche e dell’ossigeno perché è presente nell’aria e nelle molecole

organiche. Al terreno di coltura devo aggiungere anche i sali minerali.

Il modo in cui vengono somministrati questi nutrienti è diverso in base

al tipo di microrganismi interessati.

Tra le fonti di carbonio, la più semplice e al contempo la principale è la CO , poi ho anche gli

2

zuccheri semplici oppure i polisaccaridi, ma più complico la composizione del nutriente, più

devo essere sicuro che le cellule che devo mettere in coltura siano in grado di metabolizzarlo e

ricavarne il carbonio (per esempio se fornisco amido la cellula deve possedere enzimi

amilolitici). Tra le fonti principali di azoto ricordiamo NH , nitrati, nitriti, amminoacidi, peptidi

3

e proteine. Generalmente si tende a utilizzare zuccheri semplici e amminoacidi o peptidi.

Il fatto che un microrganismo richieda certe fonti di nutrimento piuttosto che altre mi permette

di creare dei terreni di coltura selettivi. Per esempio se devo isolare i microrganismi che

usano come fonte di carbonio lo xilosio, metto nel terreno di coltura solo lo xilosio. Se invece

voglio isolare microrganismi resistenti alla vancomicina, inserisco nel terreno di coltura la

vancomicina, così da far morire gli altri microrganismi.

Crescita

Considerando i batteri procarioti, cioè quelli che si riproducono solo in maniera vegetativa e

nei terreni di coltura da una cellula isolata producono una colonia, essi crescono per crescita

microbica. © Laila Pansera - 26

Questo termine indica l’aumento del numero di cellule. La

crescita microbica segue una divisione (scissione) binaria,

ovvero da una cellula si ottengono due cellule identiche

dopo la duplicazione del DNA (una sola molecola, un

cromosoma batterico) e la ripartizione delle strutture

cellulari.

La crescita microbica segue un andamento esponenziale,

ovvero dopo un intervallo fisso il numero di cellule

raddoppia (linea verde). La linea rossa indica il

corrispondente andamento logaritmico. L’intervallo fisso è

detto tempo di generazione ed è il tempo necessario

perché il numero delle cellule raddoppi durante il periodo

della crescita esponenziale.

Posso calcolare il tempo di generazione con un semplice

esperimento e con un calcolo matematico. Per prima cosa

devo contare le cellule ad intervalli di tempo regolari, poi

devo applicare la seguente formula:


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze e tecnologie alimentari
SSD:
Docente: Mora Diego
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher panseralaila di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia dei microrganismi e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Mora Diego.

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