Riassunto esame Biologia dei Microrganismi, prof. Rizzello

Classificazione e struttura dei batteri

I batteri sono organismi unicellulari con morfologie diverse. Le più ricorrenti sono cilindrica (bacilli o bastoncini) e sferica (cocchi). Di forma bacillare sono le cellule dei generi Bacillus, Clostridium, Lactobacillus ed Escherichia, mentre di forma sferica sono i generi Staphylococcus, Streptococcus, Lactococcus e Enterococcus.

Forme particolari

Cellule batteriche di forme particolari vengono così classificate:

• Coccoidi, bacilli con lunghezza ridotta tanto da sembrare dei cocchi;
• Vibrioni, bacilli che assumono una forma ricurva a virgola (es. Vibrio cholerae);
• Spirilli, bacilli allungati e spiraliformi rigidi;
• Spirochete, bacilli allungati e spiraliformi flessibili;
• Pleomorfi, capaci di modificare la morfologia delle cellule (es. Corynebacterium).

Infine, le estremità delle cellule cilindriche possono essere differenti nelle diverse specie batteriche; ci sono piatte, arrotondate o biforcute. Di questa tipologia fanno parte, ad esempio, il genere Bifidobacterium, con specie che hanno cellule con estremità bifida.

Catene costituite da due cellule sferiche si dicono diplococchi; se la catena è più lunga si parla di streptococco, mentre se si produce un aggregato disordinato di cellule, si dice stafilococco. Una divisione cellulare particolare avviene lungo tre assi perpendicolari, con formazione delle sarcine: aggregati a forma di cubo con quattro cocchi per lato. Anche i bacilli possono formare catene di due cellule (diplobacilli) o di più (streptobacilli).

Dimensioni e caratteristiche delle cellule procariotiche

Il diametro delle cellule procariotiche arriva fino a 2 μm, mentre la loro lunghezza è tra 0,1 e 8 μm. Anche alcuni eucarioti, in particolare funghi, hanno cellule di queste dimensioni. Considerando il diametro delle altre cellule eucariotiche, le dimensioni delle cellule batteriche sono molto ridotte. Questa caratteristica è responsabile di alcune importanti proprietà biologiche. Il rapporto superficie/volume nelle cellule batteriche è molto elevato rispetto a quello delle cellule eucariotiche. Dunque le procariotiche hanno maggior superficie disponibile per effettuare scambi in entrata e uscita con l'esterno. Le cellule batteriche rispondono così molto rapidamente al variare delle condizioni ambientali esterne, perché la velocità con cui avvengono gli scambi è molto più alta. Questa caratteristica influenza anche la velocità del metabolismo cellulare e di conseguenza la velocità di crescita.

Struttura delle cellule procariotiche

Strutturalmente le cellule procariotiche possono dividersi in tre regioni:

• Regione esterna, rappresentata da appendici attaccate alla superficie cellulare (flagelli, pili e fimbrie);
• Regione costituita da membrana, parete cellulare e in alcuni casi membrana esterna (periplasmatica), capsula (glicocalice) e strato S;
• Regione citoplasmatica contenente genoma, ribosomi, vescicole gassose, magnetosomi, carbossisomi, clorosomi ed eventuali inclusioni di materiale di riserva.

La parete cellulare

La parete cellulare protegge da eventuali danni meccanici e provocati dalla pressione osmotica. È una struttura piuttosto rigida. Il citoplasma contiene soluti a concentrazioni più elevate rispetto all’esterno e l’organizzazione molecolare della parete deve resistere alla pressione osmotica operata dal citoplasma verso l’esterno per evitare di andare in lisi. La parete deve essere sufficientemente elastica, caratteristica che è fornita dal peptidoglicano.

Contiene due derivati polisaccaridici: l’N-acetilglucosamina e l’acido N-acetilmuramico, uniti da un legame glicosidico. Al gruppo carbossilico del secondo, si lega un tetrapeptide (catena di quattro amminoacidi: L-alanina, acido D-glutamico, acido diamminopimelico e D-alanina). Le unità di peptidoglicano costituiscono una lamina e sono collegate fra loro in modo differente, a seconda che i microrganismi siano gram- o gram+.

Nei gram-, il gruppo carbossilico della D-alanina è legato al gruppo amminico libero del terzo amminoacido di un’altra unità di peptidoglicano. Nei gram+, il legame tra le diverse unità di peptidoglicano avviene grazie a particolari ponti peptidici, che generalmente sono dei pentapeptidi. Importante è il legame β-1,4 fra le due unità polisaccaridiche, in quanto può essere tagliato dal lisozima (saliva, lacrime e varie secrezioni) che distrugge la parete batterica disgregandola.

La suscettibilità all’attività del lisozima cambia fra gram+ e gram-. Ciò perché nei gram+ al di sopra della parete c’è un’altra membrana che protegge il peptidoglicano. Perciò i gram- sono meno sensibili al lisozima rispetto ai gram+. Nella parete cellulare degli archea non c’è acido N-acetilmuramico, che è sostituito dall’acido N-acetiltalosamminuronico e in questo caso il legame è β-1,3. Quindi gli archea non sono sensibili all’attività del lisozima. Non si parla più di peptidoglicano ma di pseudopeptidoglicano o pseudomureina.

Scissione binaria e sintesi del peptidoglicano

Durante la scissione binaria, la parete è interessata da alcuni fenomeni: la sintesi di nuovo peptidoglicano e l’incorporazione nella parete di neoformazione. Nelle forme bacillari, l’elongazione avviene sia per l’incorporazione del peptidoglicano in forma elicoidale per tutta la lunghezza della cellula (sintesi laterale), che per la sintesi nella regione centrale della cellula batterica, con formazione del setto. Nelle forme cocciche, l’elongazione della parete avviene solo a livello equatoriale. Si allungano a livello centrale con formazione del setto.

Membrana periplasmatica e colorazione di Gram

Nei batteri gram- è presente il periplasma, costituito da uno spazio contenente peptidoglicano, che presenta all’interno la membrana citoplastmatica e all’esterno un’altra membrana (periplasmatica). La membrana esterna dei batteri gram-, detta membrana periplasmatica, ha una struttura fosfolipidica ma sulla superficie esterna presenta uno strato di lipopolisaccaridi, la cui struttura è varia a seconda delle specie batteriche considerate.

In tutti i gram- si possono distinguere tre zone nelle code di lipopolisaccaridi:

• Lipide A, zona più interna;
• Core polisaccaridico, parte intermedia;
• Polisaccaride 0, parte più esterna.

I lipopolisaccaridi sono ritenuti i determinanti antigenici dei batteri gram-, ossia quelle molecole in grado di stimolarne la risposta immunitaria. La membrana serve come barriera selettiva. Come quella citoplasmatica, ha scarsa permeabilità ai soluti idrofilici. Per consentire il passaggio dei nutrienti e l’uscita dei prodotti finali del metabolismo, presenta dei canali, composti da proteine dette porine, che consentono il passaggio non specifico di soluti idrofilici di bassa massa molecolare.

Attraverso la colorazione di Gram, si distinguono batteri gram+ e gram-. Con questa tecnica si può capire in anticipo la presenza di specie patogene e subpatogene nei gram-. La prima fase è il fissaggio: viene distribuita una sospensione cellulare su un vetrino portaoggetti opportunamente pulito. Questo viene avvicinato alla fiamma di un becco Bunsen, provocando l’evaporazione dell’acqua in modo da far aderire le cellule batteriche.

Dopo il fissaggio avviene una colorazione mediante il cristalvioletto: si appongono delle gocce, si attende un minuto e si lava con acqua distillata il colorante in eccesso. Esaminando le cellule in questa fase, sia le gram- che le gram+ hanno colorazione violetta. La terza fase è il trattamento con una soluzione di Lugol: sul vetrino si pongono alcune gocce di tale soluzione (a base di iodio e ioduro di potassio), con lo scopo di stabilizzare il cristalvioletto precedente. La soluzione permane per circa tre minuti, dopo di che sempre con acqua distillata si rimuove la soluzione in eccesso.

A questo punto c’è una fase di decolorazione: sul vetrino si pone etanolo o una miscela di etanolo e acetone per circa 20 sec. A questo punto si avrebbero cellule blu violetto (gram+) e incolore (gram-). Per evidenziarne ulteriormente le differenze, avviene una quinta fase di colorazione con la safranina: questa permane sul vetrino per 1-2 minuti e viene eliminata con acqua distillata. A questo punto al microscopio ottico, a 40-100X, si vedranno le cellule gram+ colorate di blu e le gram- colorate di rosso.

La tecnica che utilizza due colorazioni differenti in microbiologia è detta colorazione di contrasto. La fase fondamentale della colorazione di Gram è la decolorazione, in quanto il decolorante è in grado di attraversare la membrana esterna dei gram-, oltrepassare il periplasma ed entrare nel citoplasma, portando via il cristalvioletto. Nei gram+ non riesce ad attraversare lo strato di peptidoglicano e non c’è decolorazione. Lo stesso vale per la safranina che andrà a colorare soltanto i gram- di rosso.

Strato S e glicocalice

Nei procarioti, oltre alle strutture fondamentali, possono esserci degli strati esterni aggiuntivi per migliorare l’interazione con l’ambiente esterno. Le strutture esterne possono essere di due tipi:

• Strati S (s-layer), proteici o lipoproteici, che avvolgono le cellule;
• Glicocalici, strati di tipo polisaccaridico. Comunemente il glicocalice si dice capsula o strato mucoso ed è un guscio di consistenza varia che riveste le cellule batteriche.

Anche queste strutture possono fungere da determinanti antigenici. Ad esempio, possono scatenare meningiti o polmoniti batteriche. La produzione di una capsula esterna è una caratteristica positiva nella produzione di yogurt, del quale determina viscosità e aspetto vellutato.

Appendici associate alla parete cellulare

Le appendici dei batteri possono essere essenzialmente di tre tipologie: flagelli, pili e fimbrie. Con lo studio di queste appendici si possono ricavare informazioni tassonomiche.

Flagelli

I flagelli servono al batterio per la locomozione. Se il batterio ha un solo flagello a una sola estremità, si dice monotricho, se ne ha uno a entrambe le estremità, si dice anfitrico. Se ha un ciuffo di flagelli a una o a due estremità si dice lofotrico. Se i flagelli sono distribuiti su tutta la superficie cellulare si dice peritrico.

Il flagello è formato da numerose subunità proteiche di flagellina (proteina). Strutturalmente è cavo e si distinguono tre regioni: filamento, uncino e placca basale. In quest’ultima le subunità proteiche sono disposte a formare una serie di dischi o anelli, il cui numero cambia a seconda che si parli di gram- o gram+. Nei gram- i dischi o anelli sono quattro, nei gram+ sono soltanto due.

Il movimento del flagello è di tipo rotatorio attorno al proprio asse. Quindi, a seconda del senso del movimento del flagello, si avrà il senso del movimento del batterio. Il movimento avviene grazie a complessi proteici in grado di sfruttare la forza protonmotrice. Nei peritrichi, il movimento può essere coordinato coi flagelli che muovono nella stessa direzione. In particolare, si ha una conformazione a ciuffo quando i flagelli avanzano in una direzione. Quando si inverte la direzione dei flagelli, il ciuffo non si forma e si ha capovolgimento casuale della cellula batterica.

Il fatto che un batterio decida di avanzare o andare in una certa direzione è regolato da meccanismi di chemiotassi. Per chemiotassi si intende la capacità di un microrganismo di muoversi verso la concentrazione maggiore di una sostanza attrattiva, o di allontanarsi da una sostanza repellente. Esistono proteine a elevata specificità verso i repellenti o gli attraenti, le quali sono in grado di cambiare conformazione una volta stabilito il legame. Il cambiamento dà il segnale al flagello per la rotazione in un senso o nell’altro. Non tutti i batteri sono dotati di flagelli di locomozione. La chemiotassi è positiva se il batterio si avvicina a un attraente; è negativa se si allontana da un repellente.

Pili e fimbrie

Pili e fimbrie hanno struttura simile fra loro. Sono appendici più corte e tozze dei flagelli e non hanno funzione di locomozione. Sono appendici proteiche di pilina. Si può dire che le fimbrie sono deputate all’ancoraggio delle cellule batteriche a delle particelle solide, mentre i pili sono generalmente strutture cave che possono essere coinvolte in fenomeni di trasferimento di materiale genetico orizzontale (pili sessuali).

Endospora batterica

L’endospora è una forma di resistenza e sopravvivenza della cellula batterica, che assume uno stato di vita latente in cui interrompe le attività metaboliche diventando resistente a fattori ambientali avversi. La sporulazione (attitudine a produrre spore) è geneticamente codificata ed è propria di un limitato numero di specie gram+ appartenenti soprattutto ai generi Bacillus e Clostridium.

La sporulazione si suddivide in otto fasi:

• Stadio 0, in cui la cellula è ancora in attività vegetativa;
• Stadio I, filamentazione assiale. I due cromosomi batterici formatisi a seguito di una normale replicazione, assumono l’aspetto di doppio filamento che si dispone lungo l’asse maggiore della cellula;
• Stadio II, divisione asimmetrica. La membrana citoplasmatica, forma un setto spostato verso una delle estremità della cellula, isolando il materiale genetico della futura spora (pre-spora) da quello del resto della cellula (cellula madre o sporangio). Inizialmente la pre-spora contiene solo il 30% del suo cromosoma. Successivamente, una DNAtraslocasi, pompa in essa il restante 70%. Oltre il materiale genetico viene catturata anche una piccola porzione di citoplasma (con ribosomi e RNA), che costituirà il core o protoplasto della spora, formato nel complesso da strutture come citoplasma, membrana, parete e nucleotide;
• Stadio III, invaginazione. La cellula madre ingloba al suo interno la pre-spora, che così sarà avvolta da una doppia membrana citoplasmatica. Ciò interferisce col normale trasporto ionico e dei nutrienti, con conseguente perdita di acqua e abbassamento del pH interno a valori prossimi a 1. Ciò interrompe l’attività metabolica instaurando criptobiosi;
• Stadio IV, sintesi della corteccia. Le due membrane sintetizzano nello spazio fra esse uno strato di peptidoglicano lasso, che conferisce resistenza alle radiazioni, detto corteccia. All’interno della pre-spora, invece, viene incorporata una gran quantità di dipicolinato di Ca;
• Stadio V, sintesi della tunica. Avviene la sintesi di un altro rivestimento detto tunica o parete della spora, formato da uno o più strati proteici che dà resistenza chimica. Può seguire anche la sintesi dell’esosporio, strato più esterno, di natura lipidica. Ciò accade, mentre la prespora va incontro a disidratazione;
• Stadio VI, maturazione. Vengono acquisite le definitive caratteristiche di resistenza senza però evidenti modificazioni morfologiche. La cellula madre va in lisi e la spora viene liberata nell’ambiente;
• Stadio VII, lisi della cellula madre. Tutto il processo a seconda delle specie dura dalle 7 alle 15 ore.

La germinazione dell’endospora batterica, avviene a seguito di un’attivazione che può essere dovuta ad esempio a un riscaldamento a temperature sub-letali. La germinazione è caratterizzata da una serie di eventi degradativi innescati da germinanti, che possono essere nutrienti specifici e anche composti non nutritivi, enzimi (lisozima) o stimoli fisici. L’interazione di un germinante con il recettore specifico, innesca l’attivazione di enzimi che depolimerizzano il peptidoglicano della corteccia, facendo entrare acqua, che insieme alla sintesi di RNA, proteine e DNA, porta a un rigonfiamento della spora detto esocrescita. L’idratazione porta inoltre all’escrezione di alcuni componenti solubili contenuti nel citoplasma, quali Ca, acido dipicolinico, K e altri cationi e alla perdita di resistenza. Contemporaneamente, l’indice di rifrazione si abbassa e le spore perdono la loro tipica rifrangenza presentandosi opache al microscopio.

Elementi genetici della cellula batterica

Gli elementi genetici della cellula batterica sono: cromosoma, plasmidi, elementi trasponibili (sequenze d’inserzione e trasposomi) e virus (presenti solo temporaneamente).

Cromosoma batterico

I batteri hanno generalmente un unico cromosoma circolare, formato da una molecola di DNA a doppia elica, che pur essendo legato a proteine, si può considerare nudo. La lunghezza del DNA è espressa in basi. Una doppia elica di DNA di 4000 basi equivale a quattro paia di kilobasi; quando la lunghezza raggiunge un milione di paia di basi, si parla di megabasi (Mb). La doppia elica è organizzata in domini superavvolti in cui proteine specifiche si legano al DNA rendendolo più stabile. Nell’E. coli sono stati evidenziati circa 50 domini superavvolti. Il suo cromosoma è lungo circa 4,6 Mb e misura circa 1 mm, ma essendo superavvolto, occupa solo il 10% dell’intero volume cellulare.

All’interno di una cellula batterica però, il DNA può essere presente anche in forma rilassata (non superavvolta) ed entrambi questi due stati non sono necessari. Il superavvolgimento serve all’impacchettamento del DNA all’interno della cellula, la forma rilassata è necessaria per la sua replicazione. Gli enzimi coinvolti nella transizione fra questi due stadi, appartengono alle topoisomerasi:

• DNAgirasi che partecipa al superavvolgimento del DNA;
• Topoisomerasi I, che contribuisce alla struttura rilassata.

L’informazione genetica si esprime attraverso tre fasi:

• Replicazione, processo di duplicazione che utilizza uno stampo del DNA;
• Trascrizione, processo di sintesi di mRNA su uno stampo di DNA;
• Traduzione, processo di sintesi delle proteine che utilizza come stampo l’informazione genetica dell’mRNA. La sequenza degli amminoacidi di ogni proteina è determinata dalla specifica sequenza delle basi dell’mRNA.