Riassunto esame Microbiologia, Prof. Polissi Alessandra, libro consigliato Biologia dei microrganismi, Gianni Dehò e Enrica Galli

Appunti di microbiologia applicata

Introduzione alla microbiologia

La cellula è l’unità fondamentale, strutturale e funzionale in cui è organizzata la materia vivente. Le cellule eucarioti si dividono in animali e vegetali. Gli organismi unicellulari come protozoi, funghi, alghe e muffe sono costituiti da cellule eucarioti. Le differenze tra eucarioti e procarioti interessano il nucleo (non presente nei procarioti e materiale genetico disposto in modo differente), il meccanismo di divisione cellulare, la parete cellulare, gli organelli (mitocondri, cloroplasti, apparato di Golgi, reticolo endoplasmatico…), l’apparato per la replicazione del DNA, l’apparato per la trascrizione, per la traduzione e la membrana cellulare. L’assenza di determinati organelli nei procarioti non è associata alla mancanza delle funzioni svolte dagli organelli stessi in quanto vengono attuati processi differenti.

Gli organismi procarioti non costituiscono un gruppo filogeneticamente omogeneo e si dividono in batteri (Bacteria) e archei (Archaea). L’evoluzione ha dato luogo alla formazione dei batteri e degli eucarioti a partire da un progenitore comune. Gli Archaea si sono evoluti a partire dalla linea evolutiva che ha dato origine agli eucarioti e per questo sono differenti rispetto ai batteri, pur essendo procarioti. Negli Archaea sono rimasti dei “resti” derivati dall’evoluzione comune con gli eucarioti. I batteri, rispetto agli Archaea, sono un gruppo più numeroso, includono i procarioti più importanti dal punto di vista medico (patogeni), comprendono poche specie che vivono in condizioni ambientali estreme (temperatura, salinità, pressione…), nessuna specie batterica nota produce metano (gli Archaea sono l’unica specie con un metabolismo che produce metano), includono tutte le specie batteriche che fanno la fotosintesi e presentano importanti dettagli molecolari come la composizione della membrana citoplasmatica, della parete, il funzionamento dell’apparato trascrizionale e traduzionale.

Storia della microbiologia

La microbiologia si occupa dello studio di organismi microscopici, tra cui procarioti, eucarioti ma anche di virus. La microbiologia è la scienza di base con l’obiettivo di comprendere i fenomeni della vita e tratta le applicazioni della scienza alle necessità dell’uomo (utilizzo a proprio vantaggio dei microorganismi e difesa dai microrganismi patogeni). Una cellula batterica bastoncellare ha una lunghezza media di 1-5 micron e una larghezza di 1 micron. La nomenclatura batterica presenta il genere e la specie che vengono indicati in corsivo. La microbiologia consapevole nasce dopo l’invenzione del microscopio ottico.

Il primo microscopio rudimentale è stato costruito dal mercante di stoffe olandese Antony van Leeuwenhoek. Con le sue osservazioni dedusse che i microrganismi non sono visibili ad occhio nudo, sono numerosissimi come numero di individui e di specie e che stanno praticamente ovunque. Originariamente si pensava che i microrganismi si generassero in modo spontaneo a partire dalla materia organica. La teoria della generazione spontanea delle forme dei viventi viene smantellata grazie agli studi di Redi, Spallanzani e Pasteur.

Redi confutò la generazione spontanea per gli organismi più grossi dimostrando che le larve di insetto si originano dalla carne solo grazie alla presenza di larve. Pasteur sfruttò delle fiasche a collo di cigno per smantellare completamente la teoria. Partendo da un liquido organico non sterile, modificò la struttura della fiasca e sterilizzò il liquido utilizzando il calore. Il materiale rimase sterile in quanto la polvere non risaliva il collo. Contaminando il liquido tramite uno spostamento del liquido stesso all’interno del collo della fiasca, si determinava la presenza di microrganismi che rendevano il liquido organico torbido.

Pasteur capì per primo che le fermentazioni sono opera di microrganismi. Scoprì infatti che la fermentazione delle bevande alcoliche era da attribuire a diversi ceppi di lievito. Da lui deriva la pastorizzazione che permette di decontaminare liquidi da microrganismi semplicemente scaldandoli. Si accorse inoltre che è possibile vaccinarsi utilizzando dei microrganismi attenuati, inducendo una risposta immunitaria nell’ospite senza provocare la malattia o provocandola in modo blando.

Koch isolò l’agente responsabile della tubercolosi, scoprì che il Bacillus anthracis è l’agente eziologico del carbonchio, sviluppò tecniche per la coltivazione di microrganismi ancora utilizzate e creò il concetto di coltura pura originata da un solo tipo di batterio. Formulò dei postulati che razionalizzarono per la prima volta il nesso causa-effetto tra un microrganismo e una determinata malattia. L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia e assente negli individui sani; l’agente causale deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine a una popolazione cellulare omogenea; l’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dar luogo alla comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile; l’agente causale può essere re-isolato dall’organismo infettato sperimentalmente.

Winogradsky e Beijerinck studiarono i microrganismi dell’ambiente e il loro ruolo come agenti di cambiamento ambientale. Svilupparono il concetto di coltura di arricchimento. Studiarono i cicli biogeochimici, le comunità di microrganismi e le interazioni tra i microrganismi e altri organismi. Iniziarono lo studio sui microrganismi dell’ambiente che non causano malattie. Beijerinck sviluppò i terreni di arricchimento in quanto precedentemente i microrganismi erano coltivati in terreni complessi e ricchi. Questi terreni consentivano la crescita di molti diversi batteri, in cui la probabilità iniziale e la densità iniziale dei batteri dettavano quale popolazione sarebbe diventata dominante nella coltura. Winogradsky isolò per primo i batteri autotrofi e i chemiolitotrofi.

I microrganismi sono stati strumenti indispensabili per passare dalla biologia di base a quella molecolare. Griffith condusse esperimenti sulla trasformazione batterica, intuendo che il DNA fosse il materiale ereditario. Questo venne definitivamente provato da Oswald. Beadle e Tatum svilupparono la teoria un gene-un enzima usando come organismi test Neurospora crassa. La scoperta della natura di DNA, RNA e proteine è attribuita a studi su E. coli.

Caratteristiche generali dei batteri

La maggior parte dei batteri hanno dimensioni tra 1-2 micron. Possono avere forme diverse e sono divisi in cocchi, bastoncelli, spirilli, spirochete, prostecati, filamenti e ife. Per la maggior parte dei batteri non è possibile distinguerli in base alla forma in quanto una grande quantità ha morfologia di cocco o bastoncello. Le spirochete hanno una forma ondulata e una data rigidità in quanto al loro interno troviamo dei filamenti che costituiscono una sorta di esoscheletro. I prostecati hanno una struttura ondulata che permette loro di aderirsi a detriti soprattutto all’interno delle acque. I batteri filamentosi presentano cellule che crescono unendosi e formando dei nastri.

I batteri possono trovarsi isolati come unicellulari oppure possono essere presenti in aggregati multicellulari. Le aggregazioni possono essere in colonie, miceli e biofilm. Le colonie si manifestano quando si dispone una cellula batterica in un terreno di coltura e questo è utile per osservarli. Un altro aggregato importante che avviene in natura è il biofilm che comprende solo un sottogruppo di batteri. Questa crescita ha importanti conseguenze in campo medico in quanto batteri che sviluppano questa struttura sono più difficili da attaccare tramite antibiotici. Degli esopolisaccaridi formano una struttura protettiva che protegge i batteri da condizioni sfavorevoli esterne. Inoltre, il biofilm è particolarmente adesivo e questo permette loro di aderire bene su superfici biotiche (uomo) o abiotiche. Un esempio è la legionella pneumofila che cresce in ambienti caldi e umidi come le tubature e gli impianti di condizionamento. Sono molto difficili da eradicare e può diffondersi tramite aerosol, andando ad infettare l’apparato respiratorio, provocando polmoniti soprattutto in individui immunocompromessi.

I batteri possono anche crescere in aggregati caratteristici di poche cellule come le sarcine e gli streptococchi come lo streptococcus pneumoniae. Per capire cosa fanno i batteri è necessario condurre studi approfonditi che si basano sulla loro coltura pura, in modo tale da studiarne nel dettaglio le caratteristiche. Il batterio Anabaena sp. Filamentous Cyanobacteria fissa l’azoto in cellule specializzate chiamate eterocisti. Il metabolismo fotosintetico avviene invece nelle cellule non specializzate. Enterococcus faecium è un batterio commensale e in particolari condizioni un patogeno opportunista (quando cambia distretto di occupazione come nel sangue, i polmoni e il sistema linfatico). È presente nella pelle, nel tratto gastrointestinale e nel tratto naso-bocca. Staphylococcus aureus ha la capacità di causare infezioni in vari distretti, ma può occasionalmente far parte della nostra flora batterica quando risiede all’interno del tratto naso-faringe. Cambiando distretto può portare a gravi patologie come le endocarditi. Prende questo nome in quanto durante la crescita produce un pigmento dorato che colora le colonie.

Streptococcus pyogenes è un patogeno a forma di cocco che causa principalmente le faringiti e le infezioni della pelle nei bambini. Bacillus cereus è un batterio bastoncellare Grahm-positivo che vive nel suolo e può diventare pericoloso in caso di cibi mal preparati che sono stati contaminati dal batterio. Bacillus anthracis forma spore e produce tossine molto pericolose che causano l’antrace, malattia che attacca i polmoni e spesso fatale. È stato usato in passato come agente di bioterrorismo tramite la spedizione per posta delle spore. Bradyrhizobium sp. è un bastoncello simbionte delle piante che fissa azoto nelle radici, favorendone la crescita. Clostridium tetani è l’agente eziologico del tetano che produce una neurotossina che induce paralisi nell’uomo. Lactobacillus sp. contiene delle specie benefiche per l’uomo, utilizzati nell’industria agroalimentare per la produzione di derivati del latte in quanto effettuano fermentazioni che partono dagli zuccheri presenti nel latte. Clostridium botulinum è l’agente eziologico responsabile del botulismo, inducendo una paralisi flaccida che impedisce la contrazione del muscolo. Corynebacterium diphtheriae è un batterio che causa difterite spesso letale nei bambini non vaccinati. Vibrio cholerae ha una forma tipica a boomerang che porta ad una fortissima disidratazione e diarrea, dovute alla produzione della tossina colerica.

La cellula procariote

Si dividono in Bacteria e Archaea. La cellula procariote presenta il materiale genetico immerso nel citoplasma e all’interno del nucleoide. La parte più complessa è la struttura di rivestimento in quanto al di fuori della membrana plasmatica ci sono almeno due strutture che comprendono la parete cellulare e la capsula. Esternamente inoltre troviamo il flagello e i pili. Nella cellula procariote sono abbondanti il carbonio, l’azoto, l’ossigeno, l’idrogeno, lo zolfo e il fosforo che sono precursori di enzimi e molecole fondamentali all’interno della cellula. Gli elementi meno abbondanti sono il potassio, il magnesio, il calcio, il ferro, il manganese, il cobalto, lo zinco e il molibdeno. In laboratorio sappiamo riprodurre la crescita solo di una minima parte dei batteri conosciuti. La grande maggioranza delle macromolecole è occupata dalle proteine. I lipopolisaccaridi si trovano solo all’interno dei batteri Gram negativi.

La membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica è definita a mosaico fluido e presenta un doppio strato fosfolipidico. Troviamo proteine integrali di membrana e proteine associate alla membrana. La struttura secondaria delle proteine di membrana della membrana plasmatica è ad alfa-elica. Troviamo proteine periferiche che si associano al foglietto interno della membrana prendendo contatto diretto con i fosfolipidi, oppure prendendo contatto con altre proteine di membrana. Le lipoproteine possiedono una modificazione lipidica post-traduzionale che comprende l’aggiunta di un’ancora lipidica che permette loro di rimanere ancorate al foglietto esterno della membrana plasmatica. Gli opanoidi sono dei lipidi molto simili agli steroidi e sono presenti all’interno della membrana plasmatica. La membrana degli Archaea presenta differenze nella struttura della membrana plasmatica.

Nella membrana citoplasmatica batterica troviamo due specifici fosfolipidi come la fosfatidiletanolammina (etanolammina) e la fosfatidilserina (serina). Il grado di saturazione dei fosfolipidi varia in base alle condizioni ambientali in quanto la membrana può diventare più o meno fluida. Le membrane degli eucarioti contengono anche steroli, sostituiti dagli opanoidi nei batteri e conferiscono rigidità alla membrana plasmatica. Negli Archaea il legame che unisce il glicerolo alla porzione lipidica non è un legame estere ma un legame etere. Questo rende la struttura della membrana più resistente alla rottura termica. La seconda differenza è che le catene idrocarburiche degli Archaea non sono lineari ma sono ramificate. Questo influenza la fluidità del doppio strato lipidico e consente loro di adattarsi a temperature estremamente elevate. Un’altra differenza riguarda la chiralità del glicerolo in quanto negli Archaea troviamo l’L-glicerolo (fosfato in posizione 1) mentre nei batteri troviamo il D-glicerolo (fosfato in posizione 3). Le catene idrocarburiche degli Archaea sono dette isopreniche in quanto derivano dalla polimerizzazione di unità isopreniche.

Le membrane plasmatiche degli Archaea possono essere formate da eteri tra due catene isoprenoide e un glicerolo (doppio strato fosfolipidico) o da tetraedri di glicerolo (monostrato fosfolipidico) che rendono la membrana ancora più resistente. Nei batteri troviamo invece esteri compresi tra due acidi grassi e un glicerolo.

La membrana citoplasmatica isola dall’ambiente extracellulare; rappresenta una barriera di permeabilità; mette in contatto e controlla gli scambi con l’ambiente cellulare grazie alla permeabilità selettiva; accumula energia chimica ed elettrica (forza proton-motrice); trasforma energia elettrica, chimica o luminosa in forza proton-motrice; trasforma questa forza in energia chimica e cinetica; percepisce le variazioni ambientali e trasmette segnali ai sistemi metabolici, chemiotattici e genetici; secerne prodotti extracellulari ed è la sede della biosintesi di costituenti delle strutture extracitoplasmatiche. Sulla membrana plasmatica dei procarioti avvengono i processi di produzione e trasformazione dell’energia chimica. Negli eucarioti questi processi avvengono sulle membrane interne dei mitocondri. Nei procarioti si ha la cattura e la trasformazione dell’energia luminosa che negli eucarioti avviene nei cloroplasti.

I trasporti attraverso la membrana

La membrana plasmatica presenta una permeabilità selettiva che varia da molecola a molecola. Le proteine di trasporto presenti nella membrana aumentano la velocità di ingresso dei soluti. La diffusione semplice non necessita di un consumo di energia, ma sfrutta un gradiente di concentrazione. Un trasportatore specifico aumenta la velocità di trasporto. Quando tutto il trasportatore è saturato dal substrato non si hanno più trasportatori disponibili e la curva della velocità si appiattisce. La diffusione facilitata sfrutta delle permeasi e delle porine.

Al contrario il trasporto attivo sfrutta energia metabolica per trasportare molecole contro gradiente di concentrazione. Si divide in trasporto primario che utilizza energia metabolica primaria e trasporto secondario che utilizza l’energia potenziale di un gradiente elettrochimico. La diffusione facilitata aumenta il flusso ma non consente l’accumulo del soluto. Il trasporto attivo secondario si divide in simporto (stessa direzione) e antiporto (direzioni opposte). La traslocazione di gruppo è molto utilizzata dai batteri e presenta una modificazione chimica della sostanza trasportata come ad esempio la fosforilazione. Tipicamente i canali sono formati da 12 domini transmembrana ad α-elica. Tra i trasportatori semplici nei batteri troviamo il simporto del fosfato, la permeasi Lac (simporto), l’antiporto sodio-protone, l’uniporto potassio e il simporto del solfato. La traslocazione di gruppo sfrutta il sistema della fosfotrasferasi PTS che comprende la proteina II C transmembrana che permette l’ingresso del glucosio nella cellula ed è associata alla proteina II B, II A, HPr e l’enzima I. Questa via parte dal fosfoenolpiruvato PEP che viene fosforilato liberando un gruppo fosfato trasferito alla proteina I, iniziando il ciclo fino a giungere alla proteina II che sfrutta l’energia liberata per importare il glucosio e fosforirarlo. Nel sistema PTS troviamo proteine specifiche e proteine promiscue. In Escherichia coli troviamo proteine glucosio-specifiche (EII A, EIIC, EIIB) e mannosio-specifiche (EII A, EIIC ed EIIB). Le proteine promiscue si possono interfacciare con entrambi i rami, permettendo l’importo di glucosio e mannosio. Questo permette un’azione ottimizzata per la cellula batterica in quanto necessita di sintetizzare meno proteine specifiche.

Il sistema di trasporto ABC presenta trasportatori ABC (ATP-Binding Cassette) che sono composti da 3 proteine. La proteina ABC è a livello citosolico mentre all’esterno troviamo una proteina legante periplasmatica che si lega alla sostanza trasportata, modificando la propria struttura e aumentando la propria affinità per la proteina canale.