Riassunto Biotecnologie Microbiche - Unità' Didattica: Biotecnologie Genetico-Molecolari

PCR QUANTITATIVA

Una evoluzione della PCR è la real-time o amplificazione in tempo reale. Questa permette di seguire l'amplificazione in tempo reale tramite un termociclatore collegato ad un detector che ci permette di andare a rilevare l'aumento di fluorescenza. Questa amplificazione è valutata in una determinata fase dei cicli di amplificazione ovvero la fase esponenziale, dove l'efficienza è pari a 100. Se si inserisce nella miscela per la PCR classica un fluorocromo marcatore di fluorescenza e si riesce a registrare l'aumento di fluorescenza con l'aumentare dei cicli di amplificazione, si riesce a seguire all'interno del termociclatore, il quale è collegato a un detector di fluorescenza e a un software che permette di registrare i dati. Grazie a questo possiamo ottenere una curva con sulle ordinate l'aumento della fluorescenza e sulle ascisse il numero dei cicli di amplificazione. Nella fase esponenziale sono

Direttamente proporzionali anche alla quantità di ampliconi che si generano. In una prima fase la fluorescenza se aumenta è minima e può essere difficilmente registrabile dal detector. Uno dei tre parametri fondamentali è infatti la linea di base ovvero la linea in cui la fluorescenza per la sensibilità dello strumento non può essere registrata. All'aumentare del numero di cicli si incomincia a registrare un livello di fluorescenza finché non raggiunge un plateau, e si riduce di molto l'efficienza. A ogni ciclo di amplificazione bisogna avere il doppio dell'amplicone che si sta quantificando. Seguendo questa curva vengono identificati due parametri fondamentali, la linea soglia (threshold) e CT (ciclo soglia). La threshold è un valore che viene determinato dall'operatore ed è un valore di fluorescenza alla quale dovrebbero intersecare tutte le curve di amplificazione dei campioni da analizzare nella fase esponenziale.

I ciclisoglia invece rappresenta il n° di cicli che stanno sopra la threshold. Il valore di CT serve per comparare i vari campioni perché una volta fissato il valore soglia, si vanno a vedere quanti cicli servono per raggiungere quel valore di CT.

Ci sono due tipologie di marcatori fluorescenti: il più usato nei laboratori è il SYBR green, ovvero un marcatore aspecifico che però si lega a tutti i doppifilamenti di DNA che sono in formazione durante i cicli di amplificazione. Nellamiscela andrà inserito il DNA, i primer e la molecola fluorescente. Mentre siforma l’amplicone, il marcatore si lega ed emette fluorescenza che nella faseesponenziale è direttamente proporzionale al n° di ampliconi ottenuti. Esso puòessere usato ad esempio durante un’amplificazione per fare una verificadeterminando la curva di melting dell’amplicone ottenuto: se si ottiene solo unpicco che ha un valore corrispondente alla Tm che mi aspetto

Significa che non ci sono contaminazioni, altrimenti se ottengo due o più picchi significa che ho ottenuto due o più ampliconi con Tm differenti.

In alcuni laboratori specializzati si usano sonde specifiche come le sonde TaqMan, ovvero un oligonucleotide specifico per un solo amplicone. Questa è complementare con una regione interna dell'amplicone ed è caratterizzata da due gruppi fluorocromi che si chiamano reporter che è ad alta energia ed emette fluorescenza e il quencher che è un fluorocromo a bassa energia che quando è vicino al reporter spegne la sua fluorescenza. Si deve quindi usare una DNA polimerasi che ha attività nucleasica per riuscire a degradare la sonda che si è liberata, liberando il reporter dal quencher permettendo di rilevare la sua fluorescenza che sarà direttamente proporzionale al numero di ampliconi che si sta formando.

Per ogni emissione di fluorescenza data dal reporter corrisponde una copia del DNA amplificato.

Si possono avere due tipi di quantificazione, quella assoluta e quella relativa. La quantificazione assoluta è il primo esempio di amplificazione della q-PCR e permette di valutare in tempo reale quante cellule di un determinato mo sono presenti in una determinata matrice in tempo breve. Prima però bisogna tarare la q-PCR per quel determinato mo.

Innanzitutto, si necessita di una sonda specie-specifica per rilevare solo quella specie microbica da quantificare. Una limitazione della q-PCR è che dobbiamo trovare una sonda con una lunghezza massima di 700 basi per ottenere un'efficienza vicina al 100%. Successivamente si necessita di un ceppo type per il mo per il quale va messa a punto la q-PCR per effettuare delle curve di taratura. Il ceppo type si fa crescere nelle condizioni ottimali e poi si deve determinare il numero delle cellule presenti e lo si effettua preparando diverse soluzioni a titolo noto di cellule che vanno da concentrazioni elevate a non. Da ogni

soluzione a titolonoto viene poi estratto il DNA che viene quantificato, si esegue la q-PCR e siottiene la retta che mette in correlazione il numero di CT ottenuti e la quantitàdi DNA presente in ogni campione. Si sa che a un determinato valore di CTcorrisponde una certa quantità di DNA che a sua volta corrisponde a unaquantità di cellule. Se si ottiene una retta con pendenza negativa, si ha lataratura per quel determinato mo e si può quindi estrarre il DNA totale dallamatrice in cui si vuole ricercare quantitativamente la presenza del mo e quelDNA estratto sarà sottoposto alla q-PCR. Il valore di CT ottenuto verrà inseritonella retta di taratura e mi dirà la quantità di DNA di quel mo presente.

Morganella morganiEsempio: problema relativo a nel pesce fresco. E’ unenterobatterio gram -, produttore di istamina e si trova negli sgombroidi. Puòcausare un accumulo di istamina. Se il pesce fresco viene conservato male

Può Morganella aumentare questo batterio. Per poter quantificare dunque la è stata messa a punto una q-PCR; si è trovata una sonda specie-specifica di cui si conosceva l'amplicone e il suo valore di Tm, quindi questa si è svolta questa q-PCR grazie al marcatore SYBR green. Dopo una retta di taratura eseguita con un ceppo type, questo è stato fatto crescere, si sono contate le cellule presenti ed effettuate sospensioni a titolo noto di cellule. Da ognuna è stato estratto il DNA che è stato quantificato e misurata la concentrazione ottenendo infine i valori di CT. Una quantità minore di DNA corrisponde ad un CT elevato. Il limite di questa analisi sta nel fatto che il numero delle cellule calcolato rappresenta il valore totale cioè sia le vive che le morte perché si valuta il DNA. Se voglio indicare solo le vive, devo ricorrere all'estrazione dell'RNA perché è indice di una cellula ancora vitale.

Il protocollo di estrazione non è molto diverso da quello del DNA. Esso però va conservato a -80°C. Una volta estratto tutto l'RNA (anche quello messaggero), deve essere retrotrascritto nel corrispondente DNA perché instabile tramite retrotrascrittasi inversa che dall'RNA mi porta ad avere il cDNA ovvero il DNA complementare. Questo potrà essere sottoposto a q-PCR ed ottengo il numero di cellule vive. Posso fare anche una quantificazione relativa se devo comparare due campioni e capire in quale dei due ho maggiore contaminazione di un certo mo. In questo caso mi fermo alla valutazione del CT, estraggo dai due campioni il mo e dopo aver estratto il DNA dai due campioni, si effettua la q-PCR che mi darà due valori differenti, tramite i valori di CT posso capire dove è più presente un mo. Questo può essere sfruttato anche quando voglio valutare che un gene venga espresso in una condizione rispetto ad un'altra. Quando siparla di estrazione di RNA. Devo innanzitutto conoscere la copia di primer che mi permette di amplificarlo, successivamente va ritrascritto in cDNA e si effettua la q-PCR che darà un valore di CT che mi dice quanto quel gene è espresso. Esempio: l'istamina è il prodotto di una reazione enzimatica che è catalizzata da un'istidina decarbossilasi che è codificata da un gene specifico. Si è voluto vedere se cambiando le condizioni di pH questo gene esprimesse il meno possibile poiché è causa dell'accumulo di istamina. Si è fatta crescere allora Morganella morgani in due condizioni diverse di pH, 5 e 7. Sono state raccolte le cellule, estratto l'RNA totale, convertito in cDNA, sottoposto a q-PCR amplificando il gene per l'istidina decarbossilasi. I due valori di CT paragonati sono risultati che quello con valore minore aveva espresso maggiormente il gene perché.c'era una quantità maggiore. Bisogna però considerare anche un controllo interno perché mi valuta se l'RNA estratto dai campioni è comparabile e quindi se la variazione di CT che ho osservato è reale. Per questo si usa un gene come quello che codifica per il 16sr-DNA, o comunque un gene che codifica per un'informazione fondamentale per la cellula e quindi è stato conservato nel tempo e viene sempre espresso dalla cellula. Se i valori CT verranno uguali significa che ho estratto correttamente l'RNA da entrambi i campioni e che quindi la differenza di ciclo soglia ottenuta è reale. SEQUENZIAMENTO Esso prevede in primo luogo di sequenziare un solo filamento dei due complementari. In funzione del gene che voglio sequenziare, con la PCR si ottiene l'amplicone di quel gene che viene purificato e si prepara un'altra PCR di sequenziamento dove viene introdotto un solo primer che lavora su un filamento. La miscela di PCR

Il sequenziamento prevede l'impiego dell'amplicone, del primer, della DNA polimerasi, dei nucleotidi trifosfato e a questi vengono aggiunti delle concentrazioni di nucleotidi terminator ovvero adenina, timina, guanina e citosina modificati nel 3' OH del ribosio. Bisogna avere quindi i 4 nucleotidi trifosfato terminator modificati in 3' insieme ai nucleotidi trifosfato normali da inserire nella miscela.

Il sequenziamento può essere manuale o automatico. Nel sequenziamento manuale bisogna preparare 4 provette per la PCR di sequenziamento, all'interno viene posta la miscela di reazione e uno dei 4 nucleotidi terminator. La sintesi dei vari ampliconi quindi si blocca dove l'adenina terminator ad esempio si lega alla catena nascente e blocca l'azione della DNA polimerasi. L'avere anche nucleotidi trifosfato normali, implica che durante i cicli di amplificazione, si ottengono ampliconi di lunghezza differente in base a dove si è legato quello terminator.

Al termine dei cicli