Biotecnologie genetico molecolari - Appunti per esame

Biotecnologie genetico-molecolari

Perché conoscere e saper applicare le metodologie genetico-molecolari nell’ambito alimentare e microbiologico?

Perché sono in uso nei moderni laboratori di:

• Controllo qualità
• Ricerca e sviluppo
• Ricerca e innovazione

Indispensabili per una risposta rapida e sicura: gli alimenti veicolano microrganismi indesiderati o patogeni. Il laboratorio controllo qualità deve disporre di metodi rapidi per dare una risposta coerente con i tempi di produzione e distribuzione. Lo sviluppo di nuovi processi di produzione in cui sono coinvolte specifiche colture starters deriva dallo studio di nuove colture e delle loro potenzialità. Questo consente l’innovazione di processo e di prodotto.

Cellula procariota come modello di studio e applicazione

La cellula procariota ha una struttura semplice, non contiene organelli specializzati, ma una membrana citoplasmatica dove risiedono molte funzioni (trasporto dei metaboliti e nutrienti, è sede della respirazione per i batteri aerobi, è sede della fotosintesi per batteri fotosintetici). Non possiede un nucleo, ma una regione nucleare, in cui è compattato il genoma cellulare.

Il genoma, a differenza della cellula eucariota, è costituito da una unica molecola di DNA cromosomale (la cellula è dunque aploide). La presenza di una sola molecola, a differenza di 2n cromosomi presenti nelle altre cellule, non deve trarre però in inganno: in quest’unica molecola sono contenute tutte le informazioni genetiche della cellula, che sono tantissime, infatti la molecola contiene più di 1 milione di basi nucleotidiche (i costituenti del DNA), ed è talmente lunga che può essere contenuta all’interno della cellula solo in una forma chiusa, circolare e superavvolta, a formare un gomitolo compatto.

Il riavvolgimento e disavvolgimento del DNA è una operazione complessa che deve essere regolata in modo specifico da numerosi enzimi specializzati; solo attraverso un avvolgimento o disavvolgimento guidato è infatti possibile lo svolgimento delle funzioni vitali della cellula. La semplicità strutturale di una cellula procariota non deve quindi trarci in inganno, anzi, proprio in ragione della sua semplicità tale cellula nel tempo (in termini filogenetici) ha saputo adattarsi agli habitat più diversi (ricordiamo gli archeobatteri estremofili isolati in ambienti molto ostili per altri m.o.) e questo spiega perché dei 3 domini della vita, 2 siano rappresentati da organismi a cellula procariota (eubatteri e archeobatteri).

Cellula eucariota e teoria dell’endosimbiosi

Vi sono tre linee evolutive differenti:

• Archaea: sono batteri procarioti estremofili, ovvero sono stati isolati in ambienti come ghiacciai e hanno una composizione chimica della parete e della membrana diversa da quella degli altri;
• Bacteria: eucarioti;
• Eukarya: eucarioti; sono animali, funghi e piante.

La cellula eucariota è nata dalla simbiosi casuale di due cellule procariote che si trovavano a colonizzare uno stesso ambiente ed in questo erano in difficoltà, una delle due cellule è entrata nell’altra specializzandosi in qualche funzione che ha permesso alle cellule tenute insieme di sopravvivere e adattarsi meglio ai nuovi cambiamenti ambientali. In questa teoria quindi i mitocondri e i cloroplasti sono delle cellule procariote che sono entrate in altre cellule specializzandosi: respirazione-mitocondri e fotosintesi-cloroplasti.

Questi organelli presenti nelle cellule eucariote hanno conservato dell’RNA, del DNA e dei ribosomi che hanno le stesse caratteristiche delle cellule batteriche. Questa scoperta ha permesso di poter studiare le distanze evolutive dei vari microrganismi e di costruire l'albero filogenetico grazie alla scoperta di orologi molecolari, ovvero macromolecole informazionali:

• Distribuite universalmente (da quelle più antiche alle nostre, dalle procariote alle eucariote)
• Funzionalmente omologhe (nelle diverse cellule)
• Conservate nel tempo con poche differenze di sequenza nel tempo

Numero di variazioni di sequenza = misura della distanza evolutiva. Questi studi hanno permesso di individuare come orologio molecolare l’RNA ribosomale 16S che è presente nella subunità più piccola dei ribosomi batterici. L’RNA ribosomiale è stato trovato in tutte le cellule. La sequenza di basi nucleotidiche che porta alla formazione di questo RNA ribosomale ha subito nel corso degli anni pochissimi cambiamenti quindi è una molecola che è stata altamente conservata all’interno di tutte le cellule, con le quali è stato possibile calcolare le distanze evolutive.

I ribosomi

Il ribosoma è una struttura che si auto-assembla in due subunità ripiegate (la subunità maggiore e la subunità minore) costituite dall'RNA ribosomiale, in presenza di 70-80 proteine ribosomiali, che si trovano all'esterno oppure nelle cavità presenti all'interno dell'rRNA ripiegato. Nei Bacteria, negli Archaea, nei mitocondri e nei cloroplasti, il ribosoma completo attivo ha due subunità, distinte da un coefficiente di sedimentazione (70S = unità Svedberg).

• La subunità più grande ha una densità di 50S
• La subunità più piccola ha una densità di 30S

Queste subunità per essere attive contengono dell'RNA ribosomale:

• Quello presente nella subunità più piccola ha densità di 16S e viene chiamato rRNA 16S
• Quello presente nella subunità più grande ha due tipi: una densità di 23S e viene chiamato rRNA 23S, una densità di 5S e viene chiamato rRNA 5S

Invece negli Eukaria il ribosoma completo attivo ha due subunità, distinte da un coefficiente di sedimentazione (80S = unità Svedberg).

• La subunità più grande ha una densità di 60S
• La subunità più piccola ha una densità di 40S

Queste subunità per essere attive contengono dell'RNA ribosomale:

• Quello presente nella subunità più piccola ha densità di 18S e viene chiamato rRNA 18S
• Quello presente nella subunità più grande ha tre tipi: uno con densità di 23S e viene chiamato rRNA 23S, uno con densità di 8S e viene chiamato rRNA 8S, uno con densità di 5S e viene chiamato rRNA 5S

Questi rRNA hanno le stesse caratteristiche ma essendo 16S più piccolo è stato considerato come un orologio molecolare. Il ribosoma 16S è codificato da un gene specifico chiamato 16S-rDNA, target presente con una sequenza poco variata tra i vari microrganismi che può essere utilizzata per mettere a punto delle metodiche senza necessariamente conoscere a priori con quale ceppo abbiamo a che fare.

Funzioni vitali di una cellula

• Adattarsi e sopravvivere in un dato habitat: e questo comporta esprimere quelle specifiche caratteristiche fenotipiche che consentono alla cellula di utilizzare un dato substrato, o adattarsi ad un cambiamento ambientale.
• Riprodursi, affinché la propria progenie sia in grado di colonizzare un dato habitat: e questo comporta la costituzione di nuove cellule figlie dotate dello stesso patrimonio genetico della cellula madre.
• Evolversi, là dove le condizioni ambientali sono tali da ridurre drasticamente le possibilità di sopravvivenza: e questo comporta in particolari condizioni, la capacità di compiere dei processi di ricombinazione genetica, allo scopo di acquisire qualche caratteristica fenotipica utile (ricordiamo che i batteri non sono in grado di compiere una riproduzione sessuale), cambiare per una cellula significa quindi modificare o acquisire nuove informazioni.

I processi di ricombinazione genetica

Sono i principali meccanismi con cui la cellula cerca di evolversi. I processi più noti di ricombinazione genetica sono: trasformazione, coniugazione e trasduzione.

• Unidirezionali, i batteri hanno bisogno di modificare il proprio DNA cambiandosi una piccola porzione del DNA cromosomale che deriva da una cellula donatrice e viene acquisito da una cellula ricevente.
• Parziali, la cellula non può acquisire porzioni di DNA troppo grandi
• Occasionali, fatti solo quando la cellula deve cambiare per resistere a un dato ambiente

L’esito di questi processi di ricombinazione non sono noti alla cellula, che rischia di metter in atto questi meccanismi sperando che questi possano migliorare la sua vita e non peggiorarla; per questo questi eventi in natura avvengono con bassa frequenza.

Trasformazione

Acquisizione di DNA libero senza contatto tra 2 cellule. È il processo più semplice, non implica un vero e proprio contatto tra cellule. La cellula può vivere in un ambiente in cui è presente del DNA cromosomale o dei frammenti di DNA che derivano dalla lisi e dalla morte di altre cellule che sono presenti nell’ambiente e le cui macromolecole si stanno degradando. Quindi dei sensori chimici segnalano alla cellula che è presente del DNA cromosomale esterno, che proviene da un’altra cellula batterica. Se la cellula ha necessità di evolversi, metterà in atto quello che viene chiamato stato di competenza, ovvero attiverà una serie di informazioni presenti sul proprio DNA cromosomale al fine di sintetizzare proteine ed enzimi che sono specifici per il processo di acquisizione di quel DNA esterno alla cellula. Quindi è un processo voluto e mediato dalla cellula. La cellula attiverà:

• Proteine di trasporto specifiche presenti a livello della membrana e della parete
• Nucleasi che vanno in parte a degradare DNA esterno trasformandolo da doppio filamento a singolo filamento più facile da acquisire.
• Proteine stabilizzanti specifiche per evitare che il DNA acquisito si ripieghi su se stesso e lo portano nella zona del DNA superavvolto.
• Proteina recA, funzione di lettura: cercare lungo il DNA cromosomale se ci sono dei siti in cui il DNA esogeno può integrarsi grazie alla presenza di particolari basi nucleotidiche alle quali il filamento di DNA può legarsi. Cerca quindi sequenze omologhe tra DNA esogeno e DNA cromosomale.
• Se la proteina trova il sito di inserimento, attraverso una serie di enzimi specifici che tagliano il DNA cromosomale e permettono l’inserimento del DNA esogeno.

Al termine si ha l’integrazione e si ha un DNA cromosomale modificato rispetto a quello nativo.

Esito positivo: DNA è riuscito ad integrarsi e quella frazione di DNA contiene delle informazioni tali da migliorare la cellula che sono rimaste intatte e possono essere espresse, la cellula avrà acquisito delle caratteristiche in più che permettono la sopravvivenza.

Esito negativo:

• 1° Caso- il DNA esogeno non si è integrato nel DNA cromosomale, ma esso viene degradato da specifici enzimi per poter utilizzare i vari componenti come le basi nucleotidiche per la sintesi di nuove molecole da parte della cellula.
• 2° Caso- DNA esogeno che si è inserito non porta nessuna informazione utile per la sopravvivenza, oppure perché il DNA esogeno si è inserito all’interno di un gene che si è inattivato.

Coniugazione

Trasferimento DNA attraverso contatto tra 2 cellule. Prevede il contatto diretto tra due cellule, nei gram negativi avviene con la formazione del ponte coniugativo mediato dal pilo F. (gram+ avviene senza contatto ma con mediazione di feromoni).

Cellula Donatrice F+: cellula che possiede il plasmide e che produce pilo F.

Cellula Ricevente F-: cellula che non possiede il plasmide e non può produrre pilo F.

Processo più semplice: Poco efficiente, non porta cellula F- ad avere nuove informazioni.

• La cellula F+ prende contatto con un’altra cellula F- e si forma il ponte coniugativo che è un pilo cavo all’interno.
• Attraverso il ponte passa uno dei due filamenti di cui è costituito il DNA plasmidico, attraverso un particolare meccanismo chiamato meccanismo di rolling-circles (srotolamento).
• Quando si forma il ponte coniugativo, il plasmide F si rompe in un punto di uno dei due filamenti e attraverso un meccanismo di rotazione circolare uno dei due filamenti si srotola dal plasmide e passa attraverso il ponte coniugativo e raggiunge la cellula ricevente F-.
• Quando tutto il filamento del plasmide è entrato nella cellula F- si attivano in entrambe le cellule (donatrice e ricevente), dei meccanismi di replicazione del filamento complementare.
• Proteine ed enzimi specifici vanno nelle due cellule (F+ e F-) a ricostituire il filamento complementare e a formare un nuovo plasmide F completo.

Quindi la cellula F+ ha donato la capacità alla cellula F- di diventare F+.

Processo più efficiente: La coniugazione diventa efficiente come meccanismo di ricombinazione quando il plasmide F è presente nella cellula donatrice sotto forma di episoma.

Il plasmide F possiede poche caratteristiche informazionali, però possiede 2 siti chiave:

• Il punto OriT che è l’origine di replicazione, tagliato per permettere al singolo filamento di passare alla cellula ricevente.
• Sito di inserimento che viene riconosciuto a livello del DNA cromosomale per poter essere integrato.

Questi due siti possono essere presenti in punti diversi del plasmide e questo cambia poi l’esito della coniugazione: quando il plasmide si è inserito e ha l’origine dello srotolamento in un punto diverso rispetto a quello di inserimento si integra nel DNA cromosomale in questo modo:

• Quando la cellula F+ viene a contatto con una cellula F- e si forma il ponte coniugativo, questo induce il plasmide a srotolarsi ed essendo legato al DNA cromosomale, questo srotolamento porta a far passare attraverso il ponte coniugativo, tutto il plasmide e insieme al plasmide entra anche il filamento del DNA cromosomale a cui il plasmide F era legato come episoma.

Questo vuol dire che se le cellule stessero in contatto per molto tempo potrebbe passare nella cellula F- tutto il plasmide o parte di esso e tutto un filamento del DNA cromosomale. Questo non avviene perché le cellule nel corso dell’evoluzione hanno imparato ad avere un tempo di contatto molto breve perché la cellula non è in grado di ricevere tutto il DNA di un’altra cellula. Ma il tempo di contatto breve fa sì che nella cellula ricevente passa il plasmide o una frazione di esso e una frazione soltanto del DNA cromosomale della cellula donatrice. Questo implica che la cellula ricevente non ha acquisito solo il plasmide F ma ha anche delle informazioni che provengono dal DNA cromosomale variabilità genetica. Queste cellule prendono il nome di Hfr+ (alta frequenza di ricombinazione)

• Hfr+ F+ se tutto il filamento del plasmide F è entrato perché i due siti, quello di integrazione del DNA e quello di origine di srotolamento erano nello stesso posto e quindi l’intero plasmide ha cominciato a srotolarsi dall’inizio fino alla fine oppure saranno delle cellule.
• Hfr+ F- se tutto il filamento del plasmide F non è entrato perché lo srotolamento ha iniziato quando il plasmide era inserito in modo tale che il sito di srotolamento coincideva con metà della molecola circolare che si è linearizzata per inserirsi nel cromosoma.

Trasduzione

Trasferimento di DNA mediato da un fago. Processo che viene mediato dai fagi (virus specifici per i batteri). Il virus è un’entità dannosa per le cellule perché è un parassita intracellulare obbligato, ovvero una volta che entra nella cellula può dar luogo a due cicli:

• Ciclo litico: fago si riproduce subito
• Ciclo lisogenico: fago integra il proprio acido nucleico nel genoma della cellula e resterà quiescente fino all’attivazione del ciclo litico.

I virus hanno un capside proteico che protegge un genoma virale che è solo a DNA o a RNA e questo spiega il fatto che essi hanno bisogno di entrare nella cellula per compiere il ciclo vitale che è legato all’aumento della progenie.

Trasduzione generalizzata

Relativa ad uno sbaglio che un fago compie durante il ciclo litico.

• L’infettazione inizia con il riconoscimento tra il batteriofago e la superficie cellulare.
• Fago inietta all’interno il proprio genoma, mentre la struttura esterna rimane all’esterno della cellula; a seconda poi che il genoma sia a DNA o a RNA, si attivano i meccanismi cellulari per cui si formano tante coppie del genoma virale e si formano le strutture proteiche che servono a contenere il genoma virale quindi la cellula dal momento dell’infezione fino la morte lavora per costruire nuove particelle virali (fino a 200 in breve tempo).
• Nel citoplasma nel ciclo di infezione si avrà la formazione della varie parti dei fagi che dovranno essere assemblate.
• Nel frattempo le macromolecole informazionali della cellula si degradano lasciando frammenti di DNA cromosomale.
• Può capitare che durante l’assemblaggio, per sbaglio all’interno del capside viene inserito una frazione del DNA cromosomale della cellula e non il genoma virale fago aberrante.
• Verrà fatto fuoriuscire dalla cellula durante la fase di lisi e sarà ancora in grado di infettare un’altra cellula ma quello che inietterà nel ciclo successivo non sarà DNA virale ma sarà quella frazione di DNA cromosomale della cellula.
• Quindi la cellula che riceve il DNA da questo fago aberrante non solo sopravvive all’infezione, ma si ritrova nel citoplasma una frazione di DNA cromosomale che può a seconda del tipo di DNA integrarsi o meno all’interno del proprio cromosoma e permettere alla cellula di acquisire informazioni in più e cambiare la propria sequenza.

Trasduzione specializzata

Relativa uno sbaglio che un fago compie durante il ciclo lisogenico. Viene chiamata specializzata perché...