Biotecnologie genetico molecolari - Appunti per esame

LA RIASSOCIAZIONE MOLECOLARE DNA/DNA

Il grado di riassociazione o ibridazione molecolare DNA/DNA rappresenta uno dei cardini su cui si basa la definizione di specie batterica. Allo scopo ricordiamo cosa si intende per SPECIE BATTERICA. Essa è l'unità tassonomica di base della microbiologia, e viene definita come un insieme di ceppi che mostrano caratteristiche fenotipiche e genotipiche tali da poter essere raggruppati in un cluster omogeneo al suo interno, ma che possa essere distinto per almeno una caratteristica fenotipica e per un importante grado di diversità genotipica dalle altre specie ascrivibili allo stesso genere. Per ogni specie descritta e validata dalla comunità scientifica internazionale viene messo a disposizione un ceppo di riferimento (ceppo type) che viene conservato in Collezioni internazionali (ad esempio la American Type Culture Collection= ATCC) e che può essere richiesto e utilizzato negli studi comparativi. CEPPI APPARTENENTI ALLA

STESSA SPECIE DEVONO:

• mostrare un fenotipo simile: questo implica che all'interno di una definita specie i ceppi possono presentare una qualche variabilità fisiologica che rispecchia l'adattamento ad habitat diversi, caratterizzati da differenti pressioni selettive, pur mostrando una origine evolutiva comune che li porta a possedere una serie di caratteristiche fenotipiche che risultano invece comuni a tutti i ceppi, indifferentemente dalla nicchia di isolamento, e che rappresentano le proprietà che caratterizzano e differenziano quella specie dalle altre.
• Un fenotipo simile implica un genotipo simile, ed in questo contesto i ceppi appartenenti ad una stessa specie devono possedere un grado di omologia della sequenza nucleotidica del loro DNA molto alto, che è stato calcolato essere maggiore o uguale al 70%.
• A questo, recentemente, con la messa a punto di nuove tecniche di indagine molecolare, si è aggiunto lo studio delle correlazioni filogenetiche.

Attraverso la determinazione della sequenza nucleotidica del gene codificante l'rRNA 16S: ceppi appartenenti alla stessa specie devono possedere una origine evolutiva comune, di conseguenza l'omologia di sequenza dei loro geni 16S rDNA deve essere superiore al 97-98%. Ricordo che il gene 16S rDNA rappresenta l'orologio molecolare ideale con il quale studiare i rapporti filogenetici tra i microrganismi, è cioè un gene altamente conservato (così come l'intero operone ribosomale), che ha subito durante l'evoluzione poche variazioni, ed è presente in tutte le cellule procariote, dove svolge la stessa funzione.

Il processo di denaturazione e riassociazione del DNA, in condizioni controllate è REVERSIBILE:

• La denaturazione è favorita a T > Tm e a bassa concentrazione salina
• La riassociazione è favorita a T < Tm e ad alta concentrazione salina

Allora possiamo calcolare indirettamente la percentuale di omologia tra i DNA di due ceppi.

di diluizione: 10Moltiplicare fattore diluizione per OD attraverso un'associazione molecolare per via spettrofotometrica.

IBRIDAZIONE PER VIA SPETTROFOTOMETRICA

Rimandando lo studio filogenetico, vediamo come si possa determinare il grado di ibridazione molecolare. Non potendo effettuare la determinazione diretta (che comprenderebbe la determinazione della sequenza nucleotidica completa dell'intero genoma di due microrganismi), sono stati sviluppati diversi metodi indiretti, tra i quali molto diffusa è la determinazione del grado di riassociazione per via spettrofotometrica con DNA in soluzione, perché offre il grande vantaggio di non usare sostanze marcate.

ATTENZIONE ALLE DILUIZIONI:

OD trovata va moltiplicata per fattore di diluizione

Volume totale nella cuvetta: 1000 nanoL

Soluzione di DNA aggiunta: 10 nanoL

Diluizione 10/1000 cioè 1/100

Fattore di diluizione: 100

Moltiplicare fattore diluizione per OD

Volume totale nella cuvetta: 100 nanoL

Soluzione di DNA aggiunta: 10 nanoL

Diluizione 10/100 cioè 1/10

Fattore di diluizione: 10

Moltiplicare fattore diluizione per OD

di diluizione: 10 Moltiplicare fattore diluzione per OD • Del DNA purificato dei due ceppi di cui si vuole valutare il grado di ibridazione. Viene sciolto in tampone ad alta forza ionica (per favorire la riassociazione) e sottoposto a determinazione del valore di Tm e del Tm medio. • Si può così calcolare una idonea temperatura di riassociazione che corrisponde al valore di Tm medio –25 °C. Queste sono le condizioni operative. • Si lavora poi con uno spettrofotometro particolare che prevede la possibilità di operare contemporaneamente con più cuvette e di essere collegato ad un sistema di riscaldamento e raffreddamento programmato delle cuvette nelle quali vengono poste quantità note dei DNA allo studio, preventivamente frammentate, in modo tale da evitare che su un lungo filamento si riasssocino solo regioni parziali. Lo strumento poi dispone di un software che permette di registrare nel tempo il valore di OD a 260 nm. • Si avrannoquindi 4 cuvette: ATTENZIONE ALLE DILUIZIONI: OD trovata va moltiplicata per fattore di diluizione (es. ho fatto diluizione 1:100, la Cuvetta 1 – DNA Omologo Ceppo A OD trovata va moltiplicata per il fattore di diluizione cioè 100) Cuvetta 1 – DNA Omologo Ceppo A Cuvetta 2 – DNA Omologo Ceppo B Cuvetta 3 – Miscela dei due DNA A-B a metà concentrazione ciascuno Cuvetta 4 – Bianco per controllo (Tampone) • In primo luogo lo strumento viene programmato per effettuare una dissociazione completa del DNA (90-94°C per alcuni minuti); successivamente la temperatura viene abbassata il più velocemente possibile alla temperatura calcolata di riassociazione e mantenuta nel tempo. • Da questo momento lo strumento registra il decremento di OD che si registra in funzione del grado di riassociazione, che a sua volta è correlato al grado di omologia che possiedono i due filamenti di DNA presenti nella stessa cuvetta. • Si calcola poi quanto tempo impiegano i campioni ariassociare per il 50% (calcolando il valore di OD teorico a cui corrisponde il 50% di riassociazione).

• Il tempo impiegato dai 2 DNA omologhi (che rappresenta il 100% di omologia) viene poimesso in comparazione con il tempo impiegato dalla miscela dei due filamenti eterologhi, tempo che sarà tanto più vicino a quello dei controlli, tanto più i 2 DNA allo studio risultano simile nella loro sequenza nucleotidica. Da qui si può poi estrapolare la % di omologia genetica.

IL PROFILO PLASMIDICO

La valutazione del profilo plasmidico posseduto dai ceppi batterici, rappresenta un primo passo importante per la valutazione della stabilità e della idoneità di una data coltura ad essere impiegata come coltura selezionata in un processo industriale.

Si ricorda infatti come i plasmidi siano Elementi Genetici Mobili, e come tale possono essere persi o acquisiti dalla cellula ospite, a causa di eventi non ancora completamente chiariti.

Ne consegue che se sulle

molecole di DNA, in cui i plasmidi possono essere identificati in base alla loro dimensione e alla loro mobilità elettroforetica. • Mediante l'utilizzo di sonde molecolari specifiche per i plasmidi di interesse, che permettono di rilevare la presenza di sequenze di DNA caratteristiche dei plasmidi. • Attraverso la trasformazione del ceppo batterico con un plasmide marcatore, che conferisce una caratteristica fenotipica riconoscibile (ad esempio la resistenza ad un antibiotico) solo se il plasmide è presente. • Utilizzando la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction) per amplificare specifiche sequenze di DNA plasmidico e successivamente analizzarle mediante elettroforesi o altre tecniche di analisi del DNA. • Effettuando un'analisi bioinformatica del genoma del ceppo batterico, alla ricerca di sequenze di DNA plasmidico. La presenza di plasmidi può essere confermata anche mediante l'osservazione diretta al microscopio elettronico, che permette di visualizzare le molecole plasmidiche all'interno delle cellule batteriche.

campioni di DNA totale

• Attraverso una Lisi Alcalina che consente di eliminare la maggior parte del DNAcromosomale, durante le fasi di estrazione per evidenziare eventuali molecole plasmidichead alto peso molecolare la cui corsa potrebbe essere simile a quella del DNA cromosomale.

-Durante la lisi il DNA cromosomale, viene ridotto in frammenti lineari.

-Se si innalza il pH della soluzione di lisi con aggiunta di soda concentrata si ottiene larottura dei legami idrogeno e quindi la separazione dei due filamenti.

-I plasmidi invece sono molto meno soggetto alla rottura e quindi la loro struttura nonviene alterata, nemmeno con l'innalzamento del pH.

ELETTROFORSE BIDIMENSIONALE

Per valutare il numero ed il peso molecolare dei plasmidi presenti in un ceppo in studio, bisognaricordare che, a causa della procedura di estrazione, qualche molecola plasmidica in forma nativaCCC si può in parte convertire (per rottura di uno dei due filamenti e conseguente parzialedisavvolgimento)

utilizzando un gel bidimensionale, in cui le bande separate nella prima corsa vengono separate ulteriormente in base alla loro carica elettrica. Per formattare il testo utilizzando tag HTML, puoi seguire le seguenti indicazioni: - Utilizza il tag

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Nella corrispondente forma OC (Open Circle). Ne consegue che, a causa di una diversa velocità di migrazione, la forma CCC e la corrispondente forma OC diano luogo in un gel elettroforetico a due bande con diversa migrazione, pur corrispondendo ad una unica tipologia di plasmide. (Forma CCC + veloce della Forma OC)

Per evitare questo tipo di errore, bisogna mettere a punto una elettroforesi bidimensionale, i cui principi generali si basano sulla capacità di convertire artificialmente (con esposizione ai raggi UV e Bromuro di etidio) il 50% circa del plasmide presente in forma CCC nella sua forma OC, verificando dopo trattamento, la presenza di uno sdoppiamento di bande.

Dopo una prima corsa elettroforetica per separare le diverse bande elettroforetiche e dopo la relativa acquisizione dell'immagine del gel ottenuto, il gel viene trattato con una soluzione di Bromuro di Etidio ed esposto per diversi minuti a radiazioni UV.

Si esegue poi una seconda corsa elettroforetica, utilizzando un gel bidimensionale, in cui le bande separate nella prima corsa vengono separate ulteriormente in base alla loro carica elettrica.

immergendo il gel nella vaschetta, ruotatodi 90° rispetto al caricamento, in modo che ogni banda separata nella prima corsa, abbia lapossibilità di migrare ancora verso il polo positivo.

Al termine di questa seconda corsa elettroforetica, si andrà ad analizzare il profilo ottenuto.

• Ogni singola banda che si è sdoppiata in questa seconda corsa, rappresenta un plasmideoriginariamente presente in forma CCC.

• Mentre bande non sdoppiate che migrano alla stessa distanza delle bande OC generatedopo il trattamento, rappresentano le forme OC originariamente presenti, e di cui nonbisogna tener conto nella determinazione del numero e del peso molecolare dei plasmidipresenti in un dato ceppo.

Per la determinazione del peso molecolare, si deve far riferimento ad un marker interno, unamiscela di molecole di DNA a peso molecolare noto che vengono fatte correre nello stesso gel.

ULTRACENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI CLORURO DI CESIO

Si ricorda infine come se si vuole

ottenere una preparazione di D