Biotecnologie genetico molecolari

2018 Biotecnologie microbiche - Modulo di biotecnologie genetico-molecolari

Anno accademico 2018-2019

Sommario ................................................................................................................. 4

Variabilità e ricombinazione genetica

....................................................................................................................................................... 5

Trasformazione

............................................................................................................................................................ 6

Coniugazione

....................................................................................................................................................................... 6

• Gram- ....................................................................................................................................................................... 7
• Gram+ .............................................................................................................................................................. 7

Trasduzione

..................................................................................................... 7

Ciclo lisogenico - Trasduzione specializzata

............................................................................................................. 8

Ciclo litico - Trasduzione generalizzata

....................................................................................................................................... 9

Acido desossiribonucleico

.................................................................................................................................................. 9

Struttura del DNA

........................................................................................................... 9

Organizzazione e regolazione del DNA

........................................................................................................................................................... 10

• Operone lac ............................................................................................................................................. 11
• Operone ribosomale....................................................................................................................................................... 12

DNA plasmidico

.................................................................................................................................................... 13

Acido ribonucleico

.............................................................................................................................................. 13

Struttura dell'RNA

......................................................................................................................... 14

Flusso dell'informazione genica

............................................................................................................................................ 15

Replicazione del DNA

............................................................................................................................................................ 16

Trascrizione

.............................................................................................................................................................. 17

Traduzione

.................................................................................................................................................... 18

Estrazione del DNA

................................................................................................................................ 19

Determinazione quantitativa

.......................................................................................................................... 19

Curva di denaturazione termica

.............................................................................................................................................................. 20

Elettroforesi

............................................................................................ 22

Determinazione del PM del DNA cromosomale

...................................................................................................................... 23

Valutazione del DNA plasmidico

........................................................................................................................... 24

Elettroforesi bidimensionale

.............................................................................................................. 26

Determinazione del PM del plasmide

......................................................................................... 26

Riassociazione o ibridazione molecolare DNA-DNA

................................................................................................................................................................ 27

Procedura

....................................................................................................................................... 27

• Allestimento del saggio ............................................................................................................. 28
• Calcolo e interpretazione dei risultati............................................................................................................................ 28

Amplificazione in vitro del DNA

.............................................................................................................................................................. 29

La reazione

................................................................................................................................................ 29

• Denaturazione (1)................................................................................................................................................... 29
• Appaiamento (2) ....................................................................................................................................... 30
• Estensione o sintesi (3) ......................................................................................................................... 30

Analisi dei prodotti della PCR

....................................................................................................................................... 30

Costruzione dei primer

......................................................................................................................... 31

Strategie di impiego della PCR

........................................................................................................................................ 31

• Sonda specie-specifica .................................................................................................................................. 32
• Amplificazione divergente.................................................................................................................................................. 32
• Primer universali

Elena Dossi © 1

• Controllo positivo ......................................................................................................... 33
• Amplificazione della regione spaziatrice........................................................................................................................................................ 35
• Inquinamento ............................................................................................................................................... 35
• Typing molecolare........................................................................................................................................................ 35

Multiplex PCR

......................................................................................................................................... 36

Ibridazione su membrana

............................................................................................................................................ 36

Ibridazione dot blot

........................................................................................................................................... 38

Ibridazione southern

......................................................................................................................... 39

PCR quantitativa - real time PCR

................................................................................................................. 40

Sistemi di rilevamento - marcatori

........................................................................................................................................................ 40

• SYBR Green 1 ....................................................................................................................................................... 40
• Sonde TaqMan .................................................................................. 41

Quantificazione real time di un MO in una matrice

..................................................................................................................................... 41

• Quantificazione relativa ............................................................................. 42
• Valutazione dell'espressione genica - Retro-trascrizione................................................................................................................................................. 42

Ingegneria genetica

....................................................................................................................................... 43

Clonaggio molecolare

................................................................................................................................................. 43

• Fasi del clonaggio ........................................................................................................................................... 44

Vettori di clonaggio

..................................................................................................................................................... 44

• Vettore pBR322...................................................................................................................................................... 46
• Vettore pUC19.......................................................................................................................................................... 46

Sequenziamento

................................................................................................................................... 46

• Sequenziamento manuale ............................................................................................................................ 47
• Sequenziamento automatico

Elena Dossi © 2

Come modello di studio per le biotecnologie si assume la cellula procariote, caratterizzata da un’unica molecola di DNA a doppio filamento (cellula aploide), detta DNA cromosomale. Inoltre, al suo interno non sono presenti né il nucleo né tutti gli organelli specializzati tipici invece della cellula eucariote: infatti in una cellula batterica tutte le funzioni cellulari (trasporto di metaboliti e nutrienti, respirazione per i batteri aerobi e fotosintesi per i fotosintetici) sono svolte al livello della membrana citoplasmatica, mentre il genoma si trova condensato nella regione nucleare.

La molecola di DNA cromosomale è costituita da 2 a 4 mln di basi nucleotidiche e ha una forma chiusa, circolare e superavvolta, a formare una sorta di gomitolo compatto (conformazione CCC). Il riavvolgimento e il disavvolgimento del DNA cromosomale sono regolati in modo specifico da numerosi enzimi specializzati per garantire le funzioni vitali della cellula.

Molti batteri possiedono del DNA extra-cromosomale (plasmidi), acquisito in particolari condizioni e costituito da una o più molecole di DNA circolare covalentemente chiuso e di piccole dimensioni. Esso si replica e si esprime in modo indipendente dal DNA cromosomale della cellula ospitante, ovvero si può replicare più volte a seconda delle necessità della cellula che sintetizza gli enzimi necessari. Se la cellula necessita di attivare un prodotto le cui informazioni si trovano sul plasmide in quantità elevate, farà in modo di replicare tante volte lo stesso plasmide.

Inoltre, il plasmide può codificare per specifiche proprietà – come resistenza agli antibiotici, enzimi detossificanti, endodesossiribonucleasi di restrizione, enzimi deputati alla degradazione di composti organici particolari (toluene, benzene e idrocarburi) – che possono essere sfruttate dalla cellula in particolari condizioni. Quindi, mentre il DNA cromosomale porta tutte le informazioni geniche indispensabili per la cellula, sulle molecole plasmidiche si trovano soltanto delle informazioni aggiuntive che possono favorirla in alcune condizioni.

Inoltre, i plasmidi non sono necessariamente mantenuti dalla cellula per tutta la vita, bensì possono essere acquisiti o persi a seconda delle condizioni (Mobile Genetic Elements), motivo per cui non recano informazioni fondamentali, e mediano il processo di trasferimento orizzontale, ovvero possono essere trasferiti alle cellule che vivono nello stesso habitat insieme a tutte le informazioni che recano.

Per contro, i plasmidi sono usati nel clonaggio molecolare, ovvero vengono usati come vettori per trasferire una certa informazione da una cellula all’altra (insulina trasferita da cellula animale a E. coli). Un particolare plasmide è l’episoma che si integra nel DNA cromosomale, entrando a fare parte del genoma della cellula, attraverso il riconoscimento di alcune regioni del doppio filamento.

La semplicità strutturale della cellula procariote spiega l’albero filogenetico della vita sulla Terra. Infatti, una cellula strutturalmente così semplice si è perfettamente adattata ai cambiamenti ambientali nel corso del tempo (in termini filogenetici): per questo si pensa che la prima cellula comparsa fosse ancora più semplice di una cellula procariote e che da questa si siano evolute le diverse tipologie di cellule presenti oggi.

Nell’albero filogenetico si individuano i tre domini della vita, di cui due a cellula procariote:

• Batteri
• Archeobatteri (batteri estremofili tipici di ghiacciai, solfatare, fosse oceaniche ecc.) con una cellula simile a quella dei batteri ma con strutture adattate agli ambienti proibitivi in cui vivono;
• Eukaria (animali, piante, funghi).

Secondo la teoria dell’endosimbiosi, in particolari condizioni due cellule procariote sono venute a contatto in una stretta simbiosi, tale per cui una delle due è entrata nell’altra a formare gli attuali mitocondri (“centrale elettrica” della cellula). Esistono evidenze scientifiche di questa teoria: infatti i mitocondri contengono del DNA ribosomale simile a quello dei batteri.

In tutte le cellule – dalle più antiche alle più recenti – è stato individuato un “orologio molecolare” che nell’arco dei miliardi di anni ha mantenuto la sequenza dei suoi costituenti e che oggi consente di valutare la distanza evolutiva. Questo “orologio molecolare” è l’RNA ribosomale 16S, presente nella subunità più piccola del ribosoma batterico. Il gene 16S è stato quindi trovato in tutte le cellule batteriche e nei mitocondri degli organismi eucarioti.

Il ciclo vitale di una cellula si basa su tre fondamentali processi:

• Replicazione del DNA
• Trascrizione del DNA in RNA messaggero (m-RNA)
• Traduzione in fenotipo a livello dei ribosomi cellulari mediante l’RNA ribosomale (r-RNA) e l’RNA transfer (t-RNA).

Infatti, le funzioni vitali di una cellula sono innanzitutto l’adattamento e la sopravvivenza in dato habitat: ciò comporta esprimere quelle specifiche caratteristiche fenotipiche che le consentono di utilizzare un certo substrato o di adattarsi ad un cambiamento ambientale. In secondo luogo, la cellula deve riprodursi, affinché la propria progenie sia in grado di colonizzare l’habitat: ciò comporta la costituzione di nuove cellule figlie dotate dello stesso patrimonio genetico.

Inoltre, la cellula deve evolversi laddove le condizioni ambientali sono tali da ridurre drasticamente le possibilità di sopravvivenza: in particolari condizioni quindi la cellula deve saper compiere dei processi di ricombinazione genetica, al fine di acquisire caratteristiche fenotipiche utili.

Variabilità e ricombinazione genetica

Nei geni possono accumularsi dei cambiamenti (mutazioni), come la sostituzione di una base azotata con un’altra:

• Transizione purina/purina o pirimidina/pirimidina;
• Transversione purina/pirimidina.

Una mutazione di questo tipo può portare alla conversione di un codone in un altro e quindi ad una proteina contenente un amminoacido diverso. Tale mutazione può non essere sempre così irrilevante per l’attività della proteina, perché può avere infatti delle ripercussioni importanti.

Tuttavia, esistono mutazioni ben più complesse e significative, come delezioni o inserzioni di grandi tratti di DNA oppure delle regioni di DNA possono spostarsi da un locus ad un altro, determinando dei cambiamenti molto più drastici e una maggiore probabilità che uno o più geni vengano inattivati (frameshift).

Le mutazioni sono eventi che si mantengono stabili nelle generazioni successive e sono rilevate con un fenotipo alterato. Tuttavia, possono anche avvenire solo a livello di genoma senza manifestarsi a livello fenotipico (mutazioni silenti).

Scambiando materiale con l’ambiente, la cellula si riproduce e si evolve in funzione degli stimoli ambientali. I primi processi di variabilità genetica studiati a fondo riguardano la ricombinazione genetica che ad oggi viene riprodotta in vitro per migliorare i ceppi microbici. I processi di ricombinazione genetica sono caratteristici solo delle cellule batteriche (negli eucarioti la riproduzione è sessuata che garantisce l’evoluzione con il crossing-over) e sono unidirezionali, parziali e occasionali.

Quando un MO sta bene in un determinato ambiente tende a rimanere tale s...