Riassunto Biologia molecolare

Srepressione, LacI nel dominio 1 del nucleo e impedisce inibizione repressione (in questo caso abbiamodell’espressione). Il monomero del repressore prevede un dominio N-t HTH (è quello che lega il DNA) collegato alnucleo dalla cerniera. Il nucleo è costituito da due domini (1, 2) e al C-t abbiamo una lunga elica con tante leu orientatedalla stessa parte (dominio di dimerizzazione). L’induttore si lega in una tasca nel nucleo e cambia conformazione allatesta, che non può legarsi al DNA. L’operatore vede delle sequenze palindrome a ripetizione invertita GTGTG AATTGche sono presenti da entrambi i lati: la testa di ogni subunità del repressore lega i due siti ripetuti. Con il legamedell’induttore, le teste vengono spostate, si allontanano e non riescono a prendere rapporti con questi siti. In totale cidell’inizio del gene lacZ ed è quello con maggiore affinità per il repressore, poisono 3 siti O: O1 che si trova a

cavalloabbiamo O2 (a valle) e O3 (a monte). Il repressore ha elevata affinità per questi siti (non si trova libero in soluzione) edegli altri due: si forma un’ansa nel DNA che inibisce la sintesi.per questo lega O1 e contemporaneamente unoL’effetto dell’induzione non è quello di staccare il repressore dal DNA (non sta in soluzione) ma di cambiarglilocalizzazione (lega sequenza casuali nel DNA e non l’operatore).forma di controllo, sull’operone lac abbiamo anche una repressione da catabolita: se c’è il glucosio,Oltre a questaanche in presenza di lattosio, si preferisce usare quello. In presenza di glucosio, abbiamo dei bassi livelli di cAMPalzano: l’elevata concentrazione di cAMP attiva il sistema CRP (o CAP) (controllomentre quando cala i livelli sipositivo). Il cAMP effettua un controllo allosterico sulla proteina e la attiva: CRP si lega al sistema lac funzionando daregolatore positivo e interagendo con la polimerasi per

facilitarla nel riconoscimento. Il sito di legame è anche in questocaso costituito da sequenze ripetute invertite.Il repressore trp regola l'operatore trepEDCBA (funziona da corepressore), il regolatore trpR (autoregolazione, consistenel blocco della traduzione di una proteina quando questa viene accumulata) e il gene aroH. Questi 3 costituiscono ilregulone del repressore trp. Gli operatori riconosciuti dal repressore presentano una sequenza correlata di 21 bp conda basi conservate). L'operatore non ha una localizzazione fissa.sequenza ripetute invertite (caratterizzateL'espressione genica può essere controllata anche a livello della traduzione mediante l'uso di codoni (se uso codoni piùl'efficienza di trascrizione (mRNA più stabili sono tradotti piùdifficili da reperire il messaggero viene poco tradotto),efficientemente) e mediante controllo autogeno (repressione della traduzione impedisce legame tra ribosoma e mRNA).

proteine regolatrici (elementi trans-agenti) operano determinando un cambio conformazionale nel bersaglio (controllo allosterico) mentre gli RNA regolatori (tipo i miRNA), che possono assumere particolari strutture secondarie, operano per appaiamento anche parziale delle basi. L'attenuazione controlla la capacità della RNA polimerasi di leggere oltre un attenuatore (terminatore intrinseco a forcina). Se serve esprimere i geni che stanno dopo la forcina (come i geni per la biosintesi del triptofano), il terminatore non deve essere riconosciuto. Nel caso del trp abbiamo una proteina, TRAP, formata da 11 subunità che lega l'mRNA del trp interrompendone la traduzione. Quando è presente triptofano, l'aa si lega a ciascuna subunità della TRAP e la attiva, permettendole di inibire l'espressione del messaggero. In assenza di trp, la proteina anti-TRAP lega gli 11 monomeri e inibisce la TRAP: si ha biosintesi di trp. Oltre a questa forma di

controllo (regolazione repressione negativa) c'è anche l'attenuazione. La regione leader è costituita da promotore, operatore, leader e attenuatore. Prima dell'attenuatore (a livello del quale si può formare la forcina) vi è una breve sequenza codificante che presenta due codoni successivi per trp. Quando l'enzima polimerasi arriva a questo punto, se trp-tRNA è raro (i livelli di trp sono scarsi), l'enzima fa una pausa che permette alla forcina di formarsi. Quando manca trp, la regione 2 viene coperta dall'enzima che sta sostando in attesa del tRNA e le regioni 3 e 4 possono appaiarsi a formare la forcina: si effettua terminazione a livello dell'attenuatore. In presenza di trp, invece, la polimerasi sosta sulla regione 1, 2-3 possono appaiarsi e non si verifica la formazione della forcina. Il trp-tRNA funziona da corepressore. La strategia per riboswitch prevede che nella regione 5'UTR vi siano delle strutture.

secondarie di appaiamento alternativo nell'RNA in grado di avere attività catalitica (ribozima). Quando si accumula glucosammina-6-P la molecolasi lega a livello dell'mRNA dell'enzima glucosammina sintetasi. Vi sono anche degli small-RNA che sono complementari e legano specifiche sequenze bersaglio influenzandone l'attività. La proteina OxyR in caso di stress ossidativo va ad attivare la sintesi di oxyS, un RNA regolatore trans-agente (con strutture stelo-ansa) che interagisce del bersaglio. In questo modo, si ha il blocco dell'espressione di diversi geni (flhA e con la sequenza di Shine-Dalgarnor poS). In tutto questo, oxyS è aiutata da Hfq (proteina aiutante, facilita l'esposizione dei bersagli). all'interno di quelli che per un altro gene sono introni) che Negli eucarioti abbiamo dei geni annidati (geni presenti codificano per un RNA antisenso (PHO84 è il gene trascritto sul filamento codificante, CUT è

complementare al messaggero ed è il suo antisenso: solitamente CUT viene degradato ma quando la cellula invecchia si conserva, lega. Anche i miRNA sono una forma di controllo dell'espressione. PHO84 e recluta deacetilasi che agiscono sugli istoni). Scienze biologiche, unibo FM genica (lin4 produce un RNA di 22 nt che va a legare lin14, inducendo la sua degradazione; dicer è un'elicasi ed endonucleasi che ha come bersaglio l'RNA di lin4). I miRNA sono usati nella tecnica dell'interferenza da RNAi.

I fagi sono virus che infettano i batteri e possono andare incontro a due diversi cicli: uno litico che prevede la lisi e la morte della cellula ospite e uno lisogeno che vede il genoma virale integrarsi nel cromosoma batterico (profago) e venir duplicato con esso. Il genoma virale ricombina con il cromosoma batterico (nel caso del fago lambda lo fa grazie ad un gene precoce ritardato). In caso di determinate condizioni ambientali avverse (induzione), il profago

può essere escisso dal cromosoma batterico e intraprendere il ciclo litico (il repressore viene inattivato per taglio proteolitico tra i domini N-t e C-t). I virus, non essendo infettivi, devono essere espressi seguendo un ordine ben preciso, in modo da avere al momento giusto la giusta quantità di proteina: la prima fase è la fase precoce (tra infezione e inizio replicazione; enzimi regolatori e con attività polimerasica per trascrivere e replicare il DNA fagico) e la seconda è la fase tardiva (da replicazione a lisi batterica; abbiamo la sintesi delle componenti virali che poi, una volta pronte, verranno assemblate). La fase precoce immediata prevede l'espressione di pochissimi geni ad opera della polimerasi dell'ospite. Un gene espresso in uno stadio servirà per accedere a quello successivo. Il fago lambda può intraprendere entrambi i cicli.l'inizio è lo stesso. I geni precoci immediati sono solo due: cro e N(pN è l'antiterminatore); i geni precoci ritardati codificano per alcuni regolatori: cII e cIII e per Q (pQ è l'antiterminatore); i geni tardivi sono molti di più (23) e codificano per le proteine strutturali. Se Q è efficace abbiamo l'antiterminazione e si entra nella fase tardiva (ciclo litico) ma se sono efficaci cII e cIII (attivano il repressore lambda) si ha la lisogenia. N e cro hanno ciascuno il proprio promotore (il primo girato verso sinistra e il secondo verso destra) che viene riconosciuto dalla polimerasi dell'ospite; se avviene antiterminazione si prosegue con i geni precoci ritardati (stesso promotore). I geni tardivi hanno un promotore (P') a parte e sono raggruppati. A livello di PL e PR vi sono gli operatori ad essi sovrapposti. Al centro vi è il gene per cI (repressore lambda). Quando è presente il repressore

lambda, questo si lega in forma di dimero ai siti degli operatori in modo da inibire l'espressione dei geni precoci. Essendo il promotore per il repressore "alle spalle" di PR, la polimerasi su PRM è stimolata dal contatto con il repressore lambda sull'O. Questa rappresenta la regione di immunità: se un ospite è già stato infettato da un altro fago (lamboide), il presente all'interno dell'ospite va a legare il DNA iniettato a livello degli O, impedendogli di attuare qualsiasi attività. Il repressore lambda è costituito da due domini: uno N-t che lega il DNA e uno C-t che si occupa della dimerizzazione. I due sono collegati da un connettore (quando avviene taglio proteolitico per inattivare il repressore è questa parte che viene tagliata). L'affinità per il DNA aumenta quando il repressore dimerizza perché, in questo modo, vengono contattate due regioni contemporaneamente: la

La sequenza di legame è palindromica ripetuta e invertita, è lunga 17 bp e abbiamo l'elica 3 di 9 aa e l'elica 2 di 7 aa che è imperfetta. Nella regione N-t (elica di riconoscimento) costituiscono il dominio HTH di legame al DNA. L'elica 3 contatta il DNA (1 aa ogni 3 o 4 contatta due perpendicolari: basi adiacenti sul DNA) mentre l'elica 2 prende rapporti con l'ossatura zucchero-Pi per stabilizzare il legame. Anche la proteina cro ha un dominio simile ma lega preferenzialmente altre sequenze (mentre il repressore ha maggiore affinità per O1, cro per O3). Sempre all'N-t, abbiamo una coda di 6 lisine che abbraccia l'altra faccia del DNA. Due monomeri dimerizzati si trovano a 34 Armstrong di distanza: occupano due scanalature principali (è la distanza per un giro completo). Il repressore in forma di dimero si lega in maniera cooperativa: il legame del primo dimero (su O1) stimola il legame degli altri (prima su O2 e

Infine sullo stesso O3 sovrapposto a PRM quando la concentrazione è elevata). Questo è un circuito autoregolato: il repressore funziona da regolatore positivo per stimolarne la produzione a livello di PRM (è un promotore che ha bassa affinità per la polimerasi e necessita di un fattore di trascrizione per essere attivato).