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IL DNA ] Il DNA è detto anche “Acido deossiribonucleico”, ed è caratterizzato dalla classica struttura a doppia

elica. Esternamente la doppia elica è caratterizzata dall'impalcatura zucchero-fosfato, ossia è caratterizzata dai

vari gruppi fosfato legati alle molecole di 2-deossiribosio tramite legami fosfodiesterici. Verso l'interno invece

sono rivolte le basi organiche azotate, che si legano in maniera complementare tramite legami N-glicosidici al

fine di stabilizzare e permettere ai due filamenti di formare una doppia elica. Ogni filamento è polarizzato in

quanto presenta un estremità 5' ed un estremità 3' e i due filamenti sono antiparalleli fra loro, ossia uno volge in

direzione 3' → 5', l'altro volge in direzione 5' → 3'.

Il DNA può esistere in diverse forme, DNA-A, DNA-B e DNA-Z:

il DNA-A non è una forma di DNA molto particolare la cui nascita è favorita in un mezzo relativamente

– povero d'acqua. Per tanto è molto difficile ritrovarlo all'interno dei sistemi cellulari

il DNA-Z è una forma rara di DNA la cui esistenza a livello cellulare non è ancora stata dimostrata

– il DNA-B è la forma di DNA più comunemente presente nei sistemi cellulari. Tale forma di DNA

– presenta la particolarità di presentare una doppia elica con andamento a zig-zag. Questo è dovuto al

fatto che il legame fosfodiesterico che collega fra loro i vari nucleotidi non è di 180 gradi (come

dovrebbe), ma di 120 gradi. Quindi la doppia elica non è lineare ma tende andare a zig-zag.

L'andamento a zig-zag della doppia elica porta alla formazione di due solchi: un solco maggiore ed un

solco minore. In questi solchi sono esposti alcuni sostituenti della basi organiche azotate. La loro

esposizione ci rende in grado di capire la loro struttura e composizione in maniera dettagliata.

DISTORSIONI DEL DNA ) talvolta il DNA può creare delle vere e proprie distorsioni strutturali causate da

particolari sequenze di nucleotidi, dette “sequenze pseudo-palindromiche”. All'interno di questa sequenza infatti

ci sono determinati nucleotidi che formano una sorta di pseuso-palindromo del tipo “ACGTTTGAC”. Come

possiamo notare se letta al contrario questa sequenza è quasi identica tranne per adenina e citosina che sono

invertiti. Per questo motivo non è un vero e proprio palindromo, ma uno pseudo-palindromo.

Per via di questa similarità questo tratto del filamento non si lega alla porzione complementare dell'altro

filamento, ma si lega su stesso formando un complesso a forcina. Questo complesso è importantissimo

biologicamente parlando perché viene riconosciuto da determinate proteine per il blocco della trascrizione del

filamento di m-RNA

DENATURAZIONE DEL DNA ) è quel processo volto alla despiralizzazione della doppia elica del DNA. Questo

processo è reversibile, infatti basta regolare la temperatura per regolare il grado di avvolgimento del DNA.

a basse temperature i due filamenti sono avvolti fra loro a formare la doppia elica del DNA

– a alte temperature i due filamenti sono generalmente despiralizzati e separati fra loro

In poche parole la doppia elica del DNA funge come una cerniera lampo. Aumentando la temperatura, aumenta

l'energia e si rompono i legami a ponte idrogeno che interconnettono le varie basi organiche azotate

complementari fra loro, con l'effetto finale che la doppia elica pian piano come la zip di una lampo di apre, e si

formano i due filamenti singoli. Diminuendo la temperatura, diminuisce l'energia ed i legami a idrogeno si

ristabilizzano, con l'effetto che i due singoli filamenti si riassociano a formare la doppia elica del DNA.

Quando aumenta la temperatura e si denatura il DNA si parla di “Effetto Ipercromico”

Quando diminuisce la temperatura e si riforma la doppia elica di DNA si parla di “Effetto Ipocromico”

Ogni tipo di DNA (DNA-A, DNA-B o DNA-Z) presenta una propria caratteristica temperatura denaturazione,

detta anche temperatura di fusione “Tm” che dipende dalla percentuale di coppie Guanina- Citosina presenti nel

DNA. Infatti queste due basi organiche azotate sono legate fra loro da ben tre legami a idrogeno e quindi

necessitano di più energia rispetto alle basi Adenina-Timina, per essere dissociate. Infatti:

Alta concentrazione di coppie G-C → Tm elevata

– Bassa concentrazione di coppie G-C → Tm bassa

L' RNA ] L'RNA è detto anche “Acido Ribonucleico”, ed è caratterizzato generalmente dalla classica struttura a

singolo filamento ripiegato su se stesso (come nel caso dell'm-RNA o dell'r-RNA). Tale filamento è caratterizzato

da ribonucleotidi uniti assieme attraverso legami fosfodiesterici. Le varie basi organiche azotate sono unite

sempre attraverso legami N-glicosidici con la differenza che al posto della timina c'è l'uracile. Vi è un tipo di

RNA che non si trova a singolo filamento, ma è caratterizzato da un doppio filamento, ed ha una struttura molto

complessa, esso è definito come t-RNA. Tale t-RNA si ripiega in modo tale che alcune zone complementari

finiscono per trovarsi vicine e per legarsi fra loro attraverso legami a idrogeno

NUCLEASI ] Le nucleasi sono enzimi del tipo “idrolasi”, ossia con l'aggiunta di una molecola d'acqua rompono

i legami fosfodiesterici che tengono coesi fra loro i ribonucleotidi dell'RNA o i deossiribonucleotidi del DNA.

Le nucleasi possono essere classificate in: Deossiribonucleasi e Ribonucleasi

le deossiribonucleasi sono coloro che rompono i legami fosfodiesterici fra i vari deossiribonucleotidi del

– DNA

le ribonucleasi sono coloro che rompono i legami fosfodiesterici fra i vari ribonucleotidi dell'RNA

Sia le deossiribonucleasi che le ribonucleasi a loro volta si distinguono in “Esonucleasi” e “Endonucleasi”:

1 ] le esonucleasi sono enzimi che tagliano il primo e l'ultimo legame fosfodiesterico che intercorrono

rispettivamente fra i primi due nucleotidi e gli ultimi due nucleotidi che formano un filamento.

Infatti abbiamo coloro che rompono il DNA o l'RNA a partire dall'estremità 3' (dette esonucleasi 3') e quelle che

rompono il DNA o l'RNA a partire dall'estremità 5' (dette esonucleasi 5'). Il taglio può avvenire in due modi:

c'è il taglio di tipo P (molto frequente), che consiste nella rottura del legame fosfodiesterico fra il gruppo

– fosfato e il carbonio 3' di un nucleotide. Non viene intaccato però il legame tra il gruppo fosfato e il

carbonio 5' dell'altro nucleotide

c'è il taglio di tipo T (molto meno frequente), che consiste nella rottura del legame fosfodiesterico fra il

– gruppo fosfato e il carbonio 5' di un nucleotide. Non viene intaccato però il legame tra il gruppo fosfato e

il carbonio 3' dell'altro nucleotide

2 ] le endonucleasi sono enzimi che tagliano i legami fosfodiesterici che legano assieme i nucleotidi interni di un

filamento. Una volta che è avvenuta la rottura del legame fosfodiesterico si vengono a formare oligonucleotidi

chiamati col nome di “frammenti Nick”. Anche nel caso delle endonucleasi il taglio può avvenire in due modi:

c'è il taglio di tipo P (molto frequente), che consiste nella rottura del legame fosfodiesterico fra il gruppo

– fosfato e il carbonio 3' di un nucleotide. Non viene intaccato però il legame tra il gruppo fosfato e il

carbonio 5' dell'altro nucleotide

c'è il taglio di tipo T (molto meno frequente), che consiste nella rottura del legame fosfodiesterico fra il

– gruppo fosfato e il carbonio 5' di un nucleotide. Non viene intaccato però il legame tra il gruppo fosfato e

il carbonio 3' dell'altro nucleotide

In poche parole il filamento viene prima ridotto in tanti piccoli oligonucleotidi (Nick) dall'azione enzimatica delle

endonucleasi. Dopo di che intervengono generalmente le esonucleasi 3' e 5', che partono rispettivamente

dall'estremità 3' e 5' del filamento Nick per poi ridurlo pian piano in tanti singoli nucleotidi.

3 ] Endonucleasi di restrizione sono enzimi dimerici, ossia caratterizzati da due subunità proteiche. Una di queste

subunità si lega ad un frammento Nick di un filamento, mentre l'altra subunità si lega ad un altro frammento

Nick presente sull'altro filamento del DNA. Generalmente i due frammenti Nick sono palindromi fra loro e sono

riconosciuti tramite un sito di restrizione presente in ognuna delle due subunità. Questo tipo di enzima è presente

nei virus, alla quale serve per infettare col proprio materiale genetico, altre cellule, sfruttando proprio le loro

attività metaboliche. Ma è anche molto presente nei batteri, dove tali enzimi servano per difendersi dall'attacco

dei virus (batteriofagi). Un esempio di endonucleasi di restrizione batterico è “EcoR1”, il cui nome deriva da:

“Eco” deriva da escherichia coli

– “R” deriva dal ceppo R

– “1” perché è la prima endonucleasi di restrizione ad essere stata scoperta

Il taglio attuato dalle endonucleasi di restrizione può essere di due tipi, per tanto si possono formare due tipi di

estremità: estremità coesive e le estremità piatte.

le estremità coesive si vengono a formare quando a seguito della rottura del legame fosfodiesterico si

– formano due frammenti di DNA (Nick) che hanno una certa complementarietà fra loro. Quindi pur

essendo separati, nel caso in cui i due frammenti di DNA (Nick) si trovino molto vicini questi si

riattaccano per qualche istante. Ecco perché si definiscono come “coesive”

le estremità piatte si vengono a formare quando l'endonucleasi rompe lo stesso legame fosfodiesterico sia

– su un filamento che sull'altro. Si vengono quindi a formare dei frammenti di DNA (Nick) non

compatibili fra loro , che quindi anche se si trovano molto vicino fra loro, non possono

assolutissimamente riattaccare

In entrambi i casi, le estremità coesive e piatte rimangano comunque specifiche e quindi possono essere riunite

da particolari enzimi dette “Ligasi”. Attenzione, però, soltanto il DNA tagliato da un solo enzima di restrizione

può essere riunito dall'enzima ligasi. Se il DNA è stato tagliato da molti enzimi di restrizione non è più possibile

riunire i vari frammenti fra loro, nemmeno con l'enzima ligasi.

Come funziona la DNA-ligasi??

per prima cosa la DNA-ligasi interagisce con l'ATP e si forma il complesso covalente ligasi-AMP, tramite

– la reazione [ LIGASI + ATP → LIGASI-AMP + 2Pi ]

a questo punto ci sono due frammenti di DNA (Nick), che devono essere legati fra loro.

– Il primo frammento definito come frammento A, ed il secondo frammento definito come frammento B.

il complesso della ligasi-AMP per prima cosa si lega ed attiva il gruppo fosfato all'estremità 5' del

– frammento A

il gruppo OH (del gruppo fosfato dell'estremità 3' del frammento B) si lega attraverso un attacco

– nucleofilo al gruppo fosfato attivato del frammento A. Si forma cosi un legame fosfodiesterico che

collega definitivamente il frammento A ed il frammento B fra loro.

Ci sono delle endonucleasi di restrizione con caratteristiche diverse fra loro, ma in grado di riconoscere la stessa

sequenza di restrizione. Questi tipi di enzimi di restrizione prendono il nome di “Isoschizomeri”.

DIFFERENZE FRA IL GENOMA PROCARIOTICO ED EUCARIOTICO ]

Le differenze principali sono rispetto alla forma, alla quantità e alla composizione:

il genoma procariotico è circolare mentre il genoma eucariotico è lineare

– il genoma procariotico è nell'ordine delle milioni di paia di basi, mentre il genoma eucariotico è

– nell'ordine delle miliardi di paia di basi. Infatti, mentre nel batterio generalmente abbiamo un genoma

costituito da un solo cromosoma circolare, negli eucarioti (essere umano) abbiamo normalmente un

genoma costituito da ben 46 cromosomi

però i procarioti pur avendo un genoma circolare e ridotto, presentano degli elementi genetici extra,

– detti “Plasmidi”, il cui numero si aggira attorno a qualche decina per ogni batterio. Ogni plasmidio è

una sorta di piccolo cromosoma formato da pochi ma specifici geni, come ad esempio:

- il gene ORI, che permette l'inizio della replicazione del DNA procariotico

- il gene per la resistenza agli antibiotici, è il gene che permette al batterio di sviluppare una certa

resistenza agli antibiotici. Essendo che i plasmidi vengono trasferiti da un batterio all'altro molto

facilmente attraverso coniugazione, anche questo gene viene trasferito facilmente e quindi la resistenza

agli antibiotici si diffonde molto rapidamente in tutto il ceppo batterico

- i geni dispensari, sono geni non strettamente necessari alla vita del batterio, ma che possono rivelarsi

utili in certe condizioni

- i geni per la produzione di tossine, sono geni che codificano per la formazione di sostanze tossiche che

servano a eliminare altre specie batteriche con lo scopo di riprodursi e monopolizzare l'ambiente

- i geni per la coniugazione, sono i geni che codificano per produzione di proteine atte alla formazione

del pilo sessuale, senza il quale non potrebbe avvenire la coniugazione

SISTEMI DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE ]

I sistemi di restrizione-modificazione sono caratterizzati da una serie di enzimi aventi generalmente attività

endonucleasica (endonucleasi) e di metilazione (DNA-metilasi). Per attività di metilazione intendiamo dire la

capacità di determinati enzimi nell'aggiungere un gruppo metile sull'anello della prima adenina, guanina o

citosina che incontrano lungo il filamento di DNA. Durante questo processo il donatore di metili è la molecola

SAM (Solfo-Adenosil-Metionina), che dopo aver donato un gruppo metile diventa SAO (Solfo-Adenosil-

Omocisteina). Se il gruppo metile:

viene aggiunto ad una adenina, si forma la 6-metil-adenina

– viene aggiunto alla guanina, si forma la 1-metil-guanina

– viene aggiunto ad una citosina, si forma la 5-metil-citosina

Il DNA metilato è generalmente protetto dall'azione endonucleasica di altri enzimi. L'unico DNA che può essere

metilato è ovviamente quello endogeno (quello proprio dell'organismo), il DNA esogeno (proveniente

dall'esterno) non può essere metilato e quindi viene immediatamente tagliato dagli enzimi con attività

endonucleasica. Questi sistemi di restrizione-modificazione sono importantissimi per preservare l'integrità del

DNA endogeno e eliminare il DNA esogeno (come ad esempio DNA-virale). In genere abbiamo tre tipi di sistemi

di restrizione, quelli di classe I, di classe II e di classe III:

Sistema di restrizione di classe I, è caratterizzato da enzimi che hanno un attività di restrizione e

– metilazione nella stessa molecola e tagliano in maniera casuale lontano dal sito di riconoscimento

Sistema di restrizione di classe II, è caratterizzato da due enzimi, uno che taglia (avente attività

– endonucleasica) e uno che protegge (avente attività di metilazione). Entrambi presentano un dominio

che è in grado di riconoscere la sequenza di restrizione e tagliarla in maniera specifica vicino al sito di

riconoscimento.

Sistema di restrizione di classe III, è caratterizzato da un enzima avente sia attività endonucleasica che

– di metilazione. Tale enzima è in grado di riconoscere la sequenza di restrizione e tagliarla lontana dal

sito di riconoscimento

Il sistema di restrizione-modificazione è però reso inerte “temporaneamente” nel caso della duplicazione di una

cellula batterica. Infatti a seguito della duplicazione, la cellula madre (caratterizzata da un DNA a doppio

filamento circolare metilato) porta alla formazione di due cellule figlie aventi un DNA a doppio filamento

circolare. Per via del carattere semiconservativo della replicazione del DNA, un filamento è parentale e quindi

presenta anche DNA-metilato che per tanto è protetto dall'azione delle endonucleasi. Un filamento è

complementare e quindi non provenendo direttamente dalla cellula madre non è costituito da DNA-metilato, e

per tanto è soggetto all'azione delle endonucleasi. Questo tipo di DNA, costituito da un filamento protetto (quello

parentale) e un filamento non protetto (quello stampo), prende il nome di “DNA-emimetilato”. Questo però, non

è un problema, poiché nel corso del tempo anche il filamento stampo viene metilato grazie all'azione delle DNA-

metilasi, e quindi tutto il DNA a doppio filamento circolare è salvaguardato dall'azione delle endonucleasi.

REPLICAZIONE DEL DNA

Il processo di replicazione del DNA è un processo biologico definito come, semiconservativo e semidiscontinuo:

semiconservativo perché ciascun filamento parentale funge da stampo per formare un nuovo filamento

– complementare

semidiscontinuo perché uno dei due filamenti si replica in maniera continua secondo la forca di

– replicazione, mentre l'altro filamento è replicato in modo discontinuo nella direzione opposta

I primi a vedere che la replicazione era semiconservativa e semidiscontinua furono Meselson e Stahl nel 1958.

Il loro esperimento fu molto complesso e caratterizzato da molte fasi. Guardiamolo nel dettaglio:

inizialmente fecero crescere dei batteri Escherichia Coli in un terreno di cultura ricco di nutrienti e ricco

– dell'isotopo pesante azoto15

dopo di che videro che gli Escherichia coli iniziavano a metabolizzare l'azoto15. Una volta metabolizzato

– questo isotopo inizia a marcare le varie strutture interne del batterio, come le proteine e soprattutto il

DNA. In questo modo il DNA marcato risultava molto più pesante rispetto alla normalità. Questo DNA

fu denominato come “DNA pesante”

dopo aver aspettato un po di tempo, in maniera tale da garantire che tutto il DNA fosse effettivamente

– marcato, Meselson e Stahl iniziarono a prelevare alcuni batteri Escherichia Coli

gli Escherichia Coli prelevati furono poi lisati (rotti), e da essi fu estratto il DNA pesante

– il DNA pesante fu poi inserito in una provetta contenente una soluzione di cloruro di cesio (CsCl 6 M)

– Questa provetta successivamente fu ultra-centrifugata formando un gradiente di densità.

– Sostanzialmente di vennero a formare degli strati sulla base del fatto che nella provetta vi erano diverse

sostanze aventi una densità diversa fra loro. Generalmente il cloruro di cesio andava verso il fondo della

provetta, mentre il DNA marcato rimaneva nel mezzo poiché la sua densità era minore

successivamente rifecero una seconda procedura analoga, utilizzando però un altro isotopo avente una

– densità minore, l'azoto14. Con questo DNA marcato con l'azoto14 fu quindi ripetuta la ultra-

centrifugazione ed i due scienziati notarono che il DNA marcato con azoto14, una volta centrifugato

risultava sedimentare in una parte più alta, perché la sua densità era ulteriormente minore

a questo punto considerarono tre possibili risultati:

– - il DNA seguiva un modello conservativo

- il DNA seguiva un modello semi conservativo

- il DNA seguiva un modello dispersivo

per vedere quali dei tre fosse quello giusto fecero un ulteriore passo avanti. Presero una colonia di

– Escherichia Coli e vi inserirono due aliquote analoghe di azoto14 e azoto15. I due isotopi iniziarono a

marcare i DNA dei vari Escherichia Coli che nel frattempo replicavano il proprio DNA.

A questo punto i due scienziati lesionarono i batteri per estrarne il DNA marcato.

Il DNA marcato fu quindi ultra-centrifugato e dopo la centrifugazione il risultato fu che il DNA era stato

marcato in parte con l'azoto14 e in parte con l'azoto15 poiché sedimentava ad un altezza intermedia fra

il DNA sedimentato con l'azoto14 ed il DNA sedimentato con l'azoto15

– sicuramente quindi non rispettava il modello conservativo. Per capire quindi se, il modello replicativo

adottato dal DNA era quello semi conservativo o il modello dispersivo fecero un ultimo passaggio.

Presero il DNA marcato con azoto14 e azoto15 e lo inserirono in un ambiente ricco di azoto14.

Effettuando nuovamente tutti i passaggi di prima, il risultato fu che durante la sedimentazione venivano

fuori due bande diverse, una intermedia ed una più leggera. Questo indica che entrambi i caratteri sono

stati replicati e quindi si trattava di un modello semi conservativo!!!

REPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI

Il tratto di DNA batterico che va incontro alla replicazione prende il nome di “Replicone”. La replicazione di

questo tratto di DNA avviene a livello di un grosso complesso multienzimatico chiamato “Replisoma”, che

comprende una elicasi, una primasi e una DNA-polimerasi. Vediamo i tre enzimi nel dettaglio:

L'ELICASI ] è definita comunemente anche come “DNA-B”. Esso è un enzima in grado di rompere i legami a

idrogeno che interconnettono fra loro le varie basi organiche azotata dei due filamenti di DNA. Generalmente

durante la replicazione intervengono due DNA-B, una sul filamento 3' → 5' e un altra sul filamento 5' → 3'.

In poche parole le DNA-B despiralizzano i due filamenti di DNA, dando vita ai due singoli filamenti separati.

L'azione delle DNA-B è resa possibile da tre fattori:

dal consumo di ATP (reazione endoergonica)

– dall'azione enzimatica della DNA-C che non fa altro che posizionare correttamente le DNA-B sui

– filamenti di DNA

dall'azione delle proteine SSBP (Single Strand Binding Proteins) che stabilizzano i due filamenti singoli,

– che altrimenti sarebbero spontaneamente spinti a riformare una doppia elica. Questo accade perché la

doppia elica è sicuramente una conformazione ad energia minore e quindi favorita, rispetto ai singoli

filamenti che hanno conformazione ad energia maggiore.

LA PRIMASI ] è un enzima detto anche “RNA-polimerasi-DNA-dipendente”. La funzione della primasi è quella

catalizzare la formazione del primer, un corto filamento di RNA di circa 10-12 nucleotidi complementare alla

molecola di DNA adiacente, che funge da innesco per la replicazione dei nuovi filamenti di DNA.

Quello che succede sostanzialmente è che:

la primasi si lega inizialmente alle DNA-B (elicasi) formando un complesso chiamato “Primosoma” (che

– è la primasi attiva)

La primasi una volta attivata inizia a codificare per la formazione di un corto filamento di RNA di circa

– 10-12 nucleotidi complementare alla molecola di DNA adiacente, il cosiddetto “primer d'innesco”

Tale primer d'innesco è fondamentale, dal momento che le DNA-polimerasi non sono in grado di

– polimerizzare nuovi filamenti di DNA senza un primer d'innesco ad RNA.

Ecco che quindi le DNA-polimerasi riconoscono il primer e iniziano a polimerizzare i nuovi filamenti

– complementari a filamenti iniziali

LE DNA-POLIMERASI ] La DNA-polimerasi è un enzima caratterizzato da una struttura tridimensionale.

Per capire generalmente com'è costituito questo enzima, possiamo paragonarlo ad una mano, in cui il pollice e

l'indice formano un foro dal quale esce il DNA sintetizzato, le altre tre dita rappresentano il dominio

polimerasico ed il palmo della mano rappresenta il dominio esonucleasico.

Nei batteri vi sono 3 tipi di DNA-polimerasi; la DNA-polimerasi I, la DNA-polimerasi II e la DNA-polimerasi III:

La DNA-polimerasi I è un enzima molto semplice, formato da una struttura monomerica caratterizzata da un

polipeptide di ridotte dimensioni. Tale enzima presenta diversi domini, ognuno dei quali gli permette di svolgere

funzioni ben precise. Ad esempio la DNA-polimerasi I è implicata:

nell'attività polimerasica 5' → 3', anche se svolge questa funzione in maniera molto lenta.

– nell'attività esonucleasica 3' → 5' che determina la capacità di “Proof Reading” (in italiano significa

– rilettura). Infatti alcune volte le DNA-polimerasi possono compiere degli errori nel polimerizzare nuovi

filamenti. Questo comporta una distorsione del filamento di DNA che viene captato dalla DNA-

polimerasi che ferma il processo. A questo punto la DNA-polimerasi inverte il senso di direzione e torna

indietro per capire dov'è l'errore (rilettura). Una volta captato l'errore (che può essere ad esempio una

base organica diversa da quella che deve esserci), esercita l'attività esonucleasica eliminando l'errore

nell'attività nucleasi 5' → 3'

La DNA polimerasi II viene definito anche come “DNA-riparasi”, ed è un enzima capace di riempire o riparare

possibili buchi (Gap) presenti sul filamento di DNA, completandolo del tutto. Tale funzione non a caso viene

definita come “Gap Filling”. Questi buchi (Gap) non devono superare le 100 paia di basi, altrimenti la DNA-

polimerasi II non riesce ad attuare ottimamente la propria funzione.

Il Gap filling è un processo abbastanza lento ma molto accurato e preciso. Infatti la DNA-polimerasi II non

svolge generalmente attività esonucleasica 3' → 5' (Proof Reading) perché non ne ha bisogno, in quanto

commette veramente pochissimi errori durante la propria attività polimerasica 5' → 3'.

In definitiva questo enzima serve soprattutto a riparare tratti di DNA non molto grandi

La DNA-polimerasi III è quell'enzima coinvolto direttamente nella sintesi dei nuovi filamenti di DNA. Tale

enzima è costituito da due parti dette “Cori enzimatici”, una parte è molto grande (core enzimatico maggiore),

l'altra è più piccola (core enzimatico minore). La porzione maggiore presenta 8 subunità, mentre la porzione

piccola presenta 3 subunità (alfa, epsilon e omega) per un totale di 11 subunità proteiche. Ognuna delle subunità

proteiche è denominata con una specifica lettera greca. Ad esempio:

subunità alfa (presenta attività polimerasica)

– subunità epsilon (presenta attività di Proof reading)

– subunità omega (presenta attività esonucleasica)

– subunità tau (serve per tenere assieme i due cori enzimatici della DNA-polimerasi III)

– subunità beta (permette alla DNA-polimerasi III si associarsi al DNA formando una struttura a pinza

– tridimensionale chiamata “Slinding Clamp”)

subunità delta (aiuta la subunità beta a legarsi al DNA, attraverso delle proteine tridimensionali

– chiamate “Clamp Loader”).

Riguardo la funzionalità della DNA-polimerasi III, dobbiamo dire che la funzione principale è quella di

polimerizzare due filamenti complementari a quelli già pre esistenti. I due filamenti di nuova sintesi saranno poi

coinvolti nella formazione di due nuovi DNA a doppio filamento circolare che rappresenteranno il patrimonio

genetico delle cellule batteriche figlie. Per polimerizzare i due filamenti la DNA-polimerasi III deve svolgere

molti processi:

intanto necessita di gruppi OH liberi, senza i quali non può catalizzare la formazione dei legami

– fosfodiesterici che uniscono fra loro i vari nucleotidi. Ecco che quindi subentra la primasi, che sintetizza

una corta catena di RNA che presenta un OH libero in posizione 3', detto “Primer d'innesco”. Non a

caso la DNA-polimerasi è un enzima “Primer-dipendente”, proprio per questo motivo!!

La DNA-polimerasi III riconosce il primer e sfrutta il gruppo OH per catalizzare la formazione di

– legami fosfodiesterici fra i vari nucleotidi iniziando a sintetizzare il nuovo filamento complementare

Nello specifico uno dei due cori enzimatici della DNA-polimerasi III si occupa della sintesi del nuovo

– filamento 5' → 3' (filamento continuo, e necessita di un primer d'innesco solamente), mentre l'altro core

enzimatico della DNA-polimerasi III si occupa della sintesi del nuovo filamento 3' → 5' (filamento

discontinuo, e necessita di più primer d'innesco, per via dei frammenti di Ohkazaki).

Una particolarità è che il filamento 5' → 3' dev'essere ruotato di 180 gradi per essere replicato, portando

– alla formazione di ansa. A questo punto può avvenire la replicazione di entrambi i filamenti.

Nel dettaglio:

la subunità delta riconosce e si lega alla elicasi (DNA-B)

– la subunità delta interagisce con la subunità beta e attraverso l'idrolisi di ATP, stimola le Clamp Loader

– a caricare la subunità beta sul primer d'innesco

una volta che il primer d'innesco è stato legato alla subunità beta, quest'ultima modifica la propria

– conformazione e modifica parzialmente anche la conformazione delle Clamp Loader, che a loro volta

permettano fisicamente ad uno dei due cori enzimatici della DNA-polimerasi III di interagire col DNA

a questo punto arriva la subunità tau, che associa l'altro core enzimatico a quello già collegato

– fisicamente al DNA. In tal modo tutta la DNA-polimerasi III è legata al DNA e può iniziare a scorrere su

di esso, polimerizzando i nuovi filamenti di DNA. Nello specifico uno dei due cori polimerizza il

filamento 3' → 5', l'altro 5' → 3'. Questo meccanismo con cui la DNA-polimerasi III si aggancia al DNA

e scorre su di esso, prende il nome di “Pinza scorrevole”

FASI DELLA REPLICAZIONE: origine, allungamento e terminazione ]

FASE DI ORIGINE ] la replicazione ha origine in una regione ben precisa del DNA batterico, definita come

punto di origine, detto anche come “OriC”. La regione OriC può essere caratterizzata in due modi:

una sequenza di 13 nucleotidi che si ripete tre volte in maniera successiva una dietro l'altra

– una sequenza di 9 nucleotidi che si ripete quattro volte in maniera successiva una dietro l'altra

In entrambi i casi queste sequenze nucleotidiche sono “sequenze consenso. Per sequenza consenso intendiamo

dire che alcuni nucleotidi non sono sempre perfettamente posizionati nello stesso modo, mentre altri nucleotidi

conservano sempre la loro posizione all'interno della sequenza. Tali nucleotidi sono soprattutto adenine e timine,

in quanto sono coloro che si legano con soli due legami a idrogeno, rendendo la zona OriC più favorevole

all'apertura e all'avvio della replicazione. Quello che succede è che:

La DNA-A interagisce e si lega a OriC, determinando la formazione della forcella di replicazione.

– Successivamente intervengono le Topoisomerasi I (dette anche DNA-girasi) e le Topoisomerasi II che

– scorrono davanti alla forcella di replicazione eliminando le tensione dovute al superavvolgimento del

DNA

Successivamente a questo punto intervengono le DNA-C che posizionano le due DNA-B (elicasi) sulle

– porzioni corrette della forcella di replicazione. Le due DNA-B iniziano a rompere i legami a idrogeno che

intercorrono fra le varie basi organiche azotate dei vari nucleotidi, portando alla despiralizzazione della

doppia elica in due filamenti singoli detti “Filamento leader” e “filamento ritardato”

I due filamenti singoli vengono stabilizzati dalle proteine SSBP (Single Strand Binding Protein).

– La stabilizzazione dei due filamenti è fondamentale, in quanto per motivi di energia libera, la

conformazione più stabile è la doppia elica e quindi i singoli filamenti sarebbero spontaneamente

predisposti a riformare la doppia elica.

FASE DI ALLUNGAMENTO ] una volta che si sono formati i due filamenti e sono stati stabilizzati dalle SSBP,

su ognuno di essi interviene la DNA-polimerasi III, per polimerizzare nuovi filamenti complementari.

Il problema iniziale è che la DNA-polimerasi III è primer-dipendente e necessita infatti del primer d'innesco per

poter polimerizzare i nuovi filamenti. Per cui:

la subunità delta riconosce e si lega alla elicasi (DNA-B)

– la subunità delta interagisce con la subunità beta e attraverso l'idrolisi di ATP, stimola le Clamp Loader

– a caricare la subunità beta sul primer d'innesco

una volta che il primer d'innesco è stato legato alla subunità beta, quest'ultima modifica la propria

– conformazione e modifica parzialmente anche la conformazione delle Clamp Loader, che a loro volta

permettano fisicamente ad uno dei due cori enzimatici della DNA-polimerasi III di interagire col DNA.

Nello specifico la DNA-polimerasi non interagisce con qualsiasi parte del DNA, ma con nucleotidi

attivati, detti “Deossiribonucleotidi Trifosfati” i quali invece di avere un gruppo fosfato, ne hanno ben

tre, grazie all'azione catalitica delle pirofosfatasi

a questo punto arriva la subunità tau, che associa l'altro core enzimatico a quello già collegato

– fisicamente al DNA. In tal modo tutta la DNA-polimerasi III è legata al DNA e può iniziare a scorrere su

di esso, polimerizzando i nuovi filamenti di DNA, uno dei due cori enzimatici polimerizza il filamento

3' → 5', l'altro core enzimatico polimerizza il filamento 5' → 3'. (Meccanismo a pinza scorrevole)

Una volta che la DNA-polimerasi è completamente associata ai due filamenti può iniziare a polimerizzare i due

filamenti complementari. L'unica cosa è che quando si parla del filamento Leader il processo va in un modo,

mentre quando si parla del filamento ritardato il processo avanza in altra maniera:

parlando del filamento Leader, per prima cosa viene rimosso il primer d'innesco da un enzima specifico

– detto “Eraser”, ed il DNA mancante (Gap) viene sintetizzato dalla DNA-polimerasi II, grazie alla sua

azione Gap filling. Il DNA sintetizzato per riempire il Gap viene quindi legato al filamento grazie alla

DNA-ligasi tramite l'ausilio di ATP

Parlando del filamento ritardato, per prima cosa non è continuo, ma presenta delle discontinuità, dovute

– al fatto che ci sono alcuni frammenti che, per ingombro sterico, non permettano alla DNA-polimerasi III

di scorrere sul filamento ritardato. A questo punto infatti la primasi sintetizza vari primer d'innesco

all'inizio e alla fine dei vari frammenti di Ohkazaki.

I primer vengono riconosciuti dalla DNA-polimerasi I che con la propria attività esonucleasica degrada

– l'inizio e la fine del frammento di Ohkazaki, eliminandolo. A questo punto il vuoto (Gap) derivante dalla

mancanza del frammento di Ohkazaki, viene riempito dal DNA sintetizzato dalla DNA-polimerasi II,

grazie alla sua azione Gap filling.

A questo punto il DNA sintetizzato per riempire il Gap viene legato al filamento grazie alla DNA-ligasi

– tramite l'ausilio di ATP

FASE DI TERMINAZIONE ] Pian piano la DNA-polimerasi III scorre su tutti e due i filamenti originando i

filamenti complementari ad essi. Al termine del processo ciascun genoma delle cellule batteriche figlie sarà

quindi formato da un filamento parentale ed uno complementare ad esso (di nuova sintesi).

Terminata la replicazione, dei due filamenti uno sarà metilato (quello parentale) e uno non metilato (quello di

nuova sintesi). Per questo si parla di DNA-emimetilato. Tale DNA permette due cose:

il riconoscimento del filamento di nuova sintesi da quello parentale, in quanto uno e metilato, mentre

– l'altro no

permette il controllo della replicazione. Infatti alla fine della replicazione si forma il nuovo genoma e

– doppio filamento circolare. Sulla regione OriC di questo genoma, ci si va a legare la proteina SeqA che

impedisce alla DNA-A si interagire con OriC. In tal modo quindi il nuovo genoma non può andare

incontro immediatamente a replicazione.

Appena ci sarà la necessità di una nuova replicazione SeqA si staccherà dalla regione OriC, e in tal

modo la DNA-A darà inizio ad una nuova replicazione.

REPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI

La replicazione del DNA negli eucarioti è praticamente identica alla replicazione del DNA negli eucarioti, cambia

solo la fase di origine e la fase di terminazione. Infatti:

FASE DI ORGINE ] a differenza del genoma dei procarioti in cui vi è un solo punto di origine (OriC), nel

genoma degli eucarioti ci sono più regioni del genoma che si replicano simultaneamente. Ciascuna regione

prende il nome di “Bolla di replicazione”. A sua volta in ciascuna bolla di replicazione si forma una forcella di

replicazione dal quale inizia la replicazione del genoma. Ogni forcella di replicazione si origina con il seguente

meccanismo:

su un tratto del genoma si lega la proteina ORC

– ORC richiama in quel tratto del genoma le proteine iniziatrici, dette: Cdc1 e Cdc6

– Cdc1 e Cdc6 richiamano a loro volta in quel tratto del genoma la proteina Mcm-2-7, che dà il via alla

– formazione della forcella di replicazione

Dopo che si sono formate le forcelle di replicazione succede che:

intervengono le Topoisomerasi I (dette anche DNA-girasi) e le Topoisomerasi II, che scorrono davanti

– alle forcelle di replicazione eliminando le tensioni dovute al superavvolgimento del DNA

Successivamente a questo punto intervengono delle proteine chiamate S-Cdk e le DDK.

– Le DDK fosforilano ed attivano le DNA-C e le DNA-B (elicasi).

Le DNA-C in tal modo possono posizionare le DNA-B (elicasi) sulle porzioni corrette delle forcelle di

replicazione. Le due DNA-B iniziano a rompere i legami a idrogeno che intercorrono fra le varie basi

organiche azotate dei vari nucleotidi, portando alla despiralizzazione della doppia elica in due filamenti

singoli detti “Filamento leader” e “filamento ritardato”

I due filamenti singoli vengono stabilizzati dalle proteine SSBP (Single Strand Binding Protein). La

– stabilizzazione dei due filamenti è fondamentale, in quanto per motivi di energia libera, la

conformazione più stabile è la doppia elica e quindi i singoli filamenti sarebbero spontaneamente

predisposti a riformare la doppia elica

FASE DI ALLUNGAMENTO ] una volta che si sono formati i due filamenti e sono stati stabilizzati dalle SSBP,

su ognuno di essi interviene la DNA-polimerasi III, per polimerizzare nuovi filamenti complementari.

Il problema iniziale è che la DNA-polimerasi III è primer-dipendente e necessita infatti del primer d'innesco per

poter polimerizzare i nuovi filamenti. Per cui:

la subunità delta riconosce e si lega alla elicasi (DNA-B)

– la subunità delta interagisce con la subunità beta e attraverso l'idrolisi di ATP, stimola le Clamp Loader

– a caricare la subunità beta sul primer d'innesco

una volta che il primer d'innesco è stato legato alla subunità beta, quest'ultima modifica la propria

– conformazione e modifica parzialmente anche la conformazione delle Clamp Loader, che a loro volta

permettano fisicamente ad uno dei due cori enzimatici della DNA-polimerasi III di interagire col DNA.

Nello specifico la DNA-polimerasi non interagisce con qualsiasi parte del DNA, ma con nucleotidi

attivati, detti “Deossiribonucleotidi Trifosfati” i quali invece di avere un gruppo fosfato, ne hanno ben

tre, grazie all'azione catalitica delle pirofosfatasi

a questo punto arriva la subunità tau, che associa l'altro core enzimatico a quello già collegato

– fisicamente al DNA. In tal modo tutta la DNA-polimerasi III è legata al DNA e può iniziare a scorrere su

di esso, polimerizzando i nuovi filamenti di DNA, uno dei due cori enzimatici polimerizza il filamento

3' → 5', l'altro core enzimatico polimerizza il filamento 5' → 3'. (meccanismo della pinza scorrevole)

Una volta che la DNA-polimerasi è completamente associata ai due filamenti può iniziare a polimerizzare i due

filamenti complementari. L'unica cosa è che quando si parla del filamento Leader il processo va in un modo,

mentre quando si parla del filamento ritardato il processo avanza in altra maniera:

parlando del filamento Leader, per prima cosa viene rimosso il primer d'innesco da un enzima specifico

– detto “Eraser”, ed il DNA mancante (Gap) viene sintetizzato dalla DNA-polimerasi II, grazie alla sua

azione Gap filling. Il DNA sintetizzato per riempire il Gap viene quindi legato al filamento grazie alla

DNA-ligasi tramite l'ausilio di ATP

Parlando del filamento ritardato, per prima cosa non è continuo, ma presenta delle discontinuità, dovute

– al fatto che ci sono alcuni frammenti che, per ingombro sterico, non permettano alla DNA-polimerasi III

di scorrere sul filamento ritardato. A questo punto infatti la primasi sintetizza vari primer d'innesco

all'inizio e alla fine dei vari frammenti di Ohkazaki. I primer vengono riconosciuti dalla DNA-

polimerasi I che con la propria attività esonucleasica degrada l'inizio e la fine del frammento di

Ohkazaki, eliminandolo. A questo punto il vuoto (Gap) derivante dalla mancanza del frammento di

Ohkazaki, viene riempito dal DNA sintetizzato dalla DNA-polimerasi II, grazie alla sua azione Gap

filling. A questo punto il DNA sintetizzato per riempire il Gap viene legato al filamento grazie alla DNA-

ligasi tramite l'ausilio di ATP

FASE DI TERMINAZIONE ] Una particolarità è che il cromosoma degli eucarioti non è circolare ma bensì

lineare. Ciascuna delle due estremità dei filamenti di DNA lineari contengono a loro volta un tratto di sequenze

ripetute che, insieme ad un gruppo di proteine specializzate, formano una specie di cappuccio, che prende il

nome di “Telomero”. Il Telomero inoltre ha la caratteristica di essere pressoché identico in tutte le specie

vertebrate. Questo ci fa dedurre che con tutta probabilità il telomero assolve la stessa funzione in tutti gli

organismi vertebrati. Guardiamo tutto nel dettaglio:

Al momento in cui le forcelle replicative arrivano al livello dei telomeri (estremità terminali dei filamenti) il DNA

a doppio filamento viene completamente despiralizzato e si formano i due filamenti di DNA, quello Leader e

quello ritardato:

quello Leader è sintetizzato senza problemi

– quello ritardato va incontro ad un problema. Dato che le primasi pongono i primer d'innesco ogni 1000

– paia di basi circa l'uno dall'altro, nel caso in cui l'ultimo primer venga a trovarsi a sole 100 paia di basi

dalla fine del filamento, la primasi non può porre un ulteriore primer d'innesco, in quanto sarebbe

troppo vicino all'ultimo. In questo modo però 100 paia di basi del filamento vengono perse, poiché non

vengono sintetizzate dalla DNA-polimerasi III. Ecco perché ad ogni replicazione del DNA eucariote,

i telomeri del filamento ritardato si accorciano!!

Per questo motivo esistono enzimi detti “Telomerasi”.

Le telomerasi sono delle DNA-polimerasi-RNA-dipendenti, infatti anch'esse hanno bisogno del primer

d'innesco ad RNA per svolgere la loro funzione. In poche parole

- sulla porzione terminale del telomero abbiamo la presenza di un filamento sporgente ad RNA che pian

piano tende a formare una sorta di ansa

- quest'ansa viene riconosciuta dalla telomerasi, che ci si lega ad essa, ed inizia a sintetizzare un

filamento di DNA complementare al filamento di RNA sporgente

- questo DNA andrà ad aumentare la lunghezza del telomero

- inoltre generalmente il DNA è non codificante, in maniera tale che

Sulla porzione terminale del telomero abbiamo la presenza a seguito della replicazione, il DNA perso

non sia essenziale (facente parte di un esone), ma sia non essenziale (facente parte di un introne)

In poche parole la telomerasi ha la funzione di mantenere invariata la lunghezza dei telomeri, e la loro azione

viene regolata dalla presenza di alcune proteine specifiche legate al telomero. Quindi:

se queste proteine sono poche, significa che il telomero è di ridotte dimensioni e quindi l'attività delle

– telomerasi è elevata

se queste proteine sono tante, significa che il telomero è di grandi dimensioni e quindi l'attività delle

– telomerasi è nulla (non c'è bisogno di aggiungere altro DNA per allungare ulteriormente il telomero)

Nonostante l'azione delle Telomerasi, il telomero dei filamenti ritardati è destinato pian piano ad accorciarsi, e

l'accorciamento dei telomeri è stato riscontrato anche scientificamente come una causa dell'invecchiamento

cellulare e dell'insorgenza dei tumori. Non ha caso chi ha il cancro, generalmente presenta un attività delle

Telomerasi molto elevata

MUTAZIONI E RIPARAZIONE DEL DNA

Il DNA è continuamente soggetto a mutazioni continue a causa delle numerose attività enzimatiche, della

presenza di agenti esterni, del contatto con radiazioni penetranti o agenti di natura chimica, radicali liberi e cosi

via quant'altro.. Essendo che quindi le mutazioni del DNA sono inevitabili per ovvie ragioni, la cosa importante è

quella di tenere sotto controllo costantemente il numero di mutazioni, limitandone la comparsa ad un numero

più piccolo possibile. Teniamo conto che:

un numero minimo e controllato di mutazioni possono risultare positive, poiché sono coloro che possono

– dare il là all'evoluzione dell'organismo

un numero di mutazioni limitato potrebbe portare all'insorgenza di danni limitati, che la cellula può

– comunque sopperire attraverso dei sistemi di riparazione, senza incombere in danni irreversibili

un numero di mutazioni eccessivo potrebbe portare all'insorgenza di danni elevati che la cellula non

– riuscirebbe a gestire. Per questo motivo la cellula verrebbe danneggiata irreversibilmente, tanto da

portare alla morte della stessa o ad eventi di oncogenesi

Per quanto riguarda un evento di mutazione, dobbiamo distinguere l'RNA dal DNA:

- L'RNA è una molecola che viene sintetizzata continuamente a partire da vari processi biologici come la

trascrizione della sintesi proteica. Per tanto se l'RNA va incontro a mutazione, viene semplicemente degradato

- Il DNA invece è una molecola con una certa longevità all'interno del nostro organismo, ed ogni mutazione può

per tanto avere effetti a lungo termine all'interno del nostro organismo. Inoltre il DNA è la molecola portatrice

dell'informazione genetica, quindi possibili mutazioni o defezioni potrebbero con una certa probabilità essere

riscontrate anche sulla prole. Quindi il nostro organismo per il DNA ha imparato a sviluppare determinati

meccanismi atti a minimizzare gli eventi mutageni e gli errori annessi ad essi. Alcuni di questi meccanismi sono

la capacità di Proof Reading (rilettura) e la riparazione post-replicativa:

la capacità di Proof Reading è attuata dalle DNA-polimerasi e consiste nella capacità di questo enzima,

– di correggere eventuali errori commessi durante la sintesi del DNA, durante la replicazione

la riparazione post-replicativa è un meccanismo atto a correggere errori causati da danni chimico-fisici

– al DNA, o eventuali errori commessi durante il processo di replicazione che la DNA-polimerasi non è

riuscita a risolvere tramite Proof Reading

Se non ci fossero questi sistemi di di riparazione cellulare, il numero di mutazioni ed errori sarebbe talmente

elevato da non permettere la vita. Infatti:

la frequenza del numero di errori della DNA-polimerasi durante la replicazione è 0,0001 (1 errore ogni

– 10000 nucleotidi sintetizzati)

la frequenza del numero di errori con attivo il meccanismo della Proof reading è 0,0000001 (1 errore

– ogni dieci milioni di nucleotidi sintetizzati)

la frequenza del numero di errori con attivi sia il meccanismo della Proof reading che il meccanismo

– della replicazione post-replicativa è di 0,0000000001 (1 errore ogni dieci miliardi di nucleotidi

sintetizzati). Tale valore è compatibile con la vita!!!

Cos'è una mutazione? Quali sono le mutazioni che colpiscono il nostro organismo?

Per mutazione si fa riferimento ad un cambiamento nella sequenza nucleotidica del DNA. In poche parole a

seguito di una mutazione avviene un alterazione del genotipo dell'individuo, che può in alcuni casi, anche portare

ad alterazioni a livello fenotipico. Le mutazioni possono essere classificate sulla base della origine della

mutazione, della lunghezza della mutazione o sulla base della modalità con cui avviene una mutazione:

Sulla base dell'origine possono essere classificate in mutazioni spontanee o indotte:

1 ] Le mutazioni spontanee sono per definizione tutte quelle mutazioni che avvengano in assenza di agenti

mutageni noti, e che quindi avvengono spontaneamente. Questo tipo di mutazione non è molto frequente ma è

comunque inevitabile visto e considerato che ogni meccanismo biologico non è perfetto e porta all'insorgenza di

errori. Ad esempio nel processo di replicazione abbiamo visto che il Proof reading e la riparazione post-

replicativa riducono notevolmente il numero di errori, ma quest'ultimi vi sono lo stesso. Degli errori più

frequenti che avvengono nel processo di replicazione sono l'aggiunta di nucleotide al posto di un altro. Quando la

DNA-polimerasi aggiunge una purina al posto di una pirimidina si ha una “Trasversione”. Quando la DNA-

polimerasi aggiunge una purina al posto di un altra purina o una pirimidina al posto di un altra pirimidina si ha

una “Transizione”.

2 ] Le mutazioni indotte sono per definizione tutte quelle mutazioni che avvengano in presenza di agenti

mutageni noti. Questo tipo di mutazione è molto più frequente rispetto a quelle spontanee, visto e considerato che

il nostro ambiente è ricco di agenti mutageni chimici e fisici. Ad esempio alcune sostanze acide possono alterare

la struttura del DNA. Alcuni mezzi fisici, come i raggi UV del sole il raggi X e i raggi gamma, possono alterare la

struttura del DNA

Sulla base della lunghezza possono essere classificate in mutazioni geniche, cromosomiche e genomiche:

1 ] Le mutazioni geniche sono mutazioni che alterano la composizione di un singolo gene, ed è per questo che

vengono definite anche come “mutazioni puntiformi”. Quando un gene viene modificato si viene a formare un

nuovo gene mutato che prende il nome di “Allele”. Alcune delle mutazioni geniche più conosciute sono:

– Mutazioni missenso. Si hanno quando viene modificata una determinata tripletta. Cambiando la

tripletta viene codificato un altro amminoacido che ha delle caratteristiche chimico-fisiche totalmente

diverse dall'amminoacido codificato precedentemente dalla tripletta non modificata.

Ad esempio abbiamo una tripletta del tipo “AUG” che codifica per l'amminoacido metionina.

Successivamente la tripletta viene modificate in “AUA” che codifica per l'amminoacido isoleucina

– Mutazioni silenti. Si hanno quando avviene la modificazione di una tripletta che però non determina il

cambiamento dell'amminoacido codificato. Ad esempio abbiamo una tripletta del tipo “UUU” che

codifica per fenilalanina. Successivamente la tripletta viene modificata in “UUC” che codifica sempre

per la fenilalanina

– Mutazioni non senso. Si hanno quando viene modificata una determinata tripletta che codifica per un

determinato amminoacido, in una tripletta di stop. La tripletta stop non codifica per nessun

amminoacido e quindi generalmente questo tipo di mutazione determina il blocco della sintesi proteica.

Ad esempio abbiamo una tripletta del tipo “UGC” che codifica per la cisteina. Successivamente la

tripletta viene modificata in “UGA” che non codifica per nessun amminoacido

– Mutazioni neutrali. Si hanno quando viene modificata una determinata tripletta che codifica per un

altro amminoacido che però, ha delle caratteristiche chimico-fisiche molto similari a quelle

dell'amminoacido codificato precedentemente. Per tanto questo tipo di mutazioni pur cambiando la

sequenza amminoacidica, non altera la funzionalità della proteina finale ed è quindi neutrale.

Ad esempio abbiamo una tripletta del tipo “GAU” che codifica per l'acido aspartico. Successivamente la

tripletta viene modificata in “GAA” che codifica per l'acido glutammico. Entrambi gli amminoacidi

sono amminoacidi acidi, aventi caratteristiche chimico-fisiche molto simili fra loro

– Mutazioni frame-shift. Le mutazioni frame-shift sono dovute a delezioni o inserzioni di un numero di

nucleotidi non divisibile per tre. Questo comporta la formazione di una sequenza amminoacidica sfalsata

dispetto a quella originale che a sua volta formerà una proteina totalmente diversa, avente funzionalità

diverse. Ad esempio ho una sequenza nucleotidica del tipo “UUU/AAA/UUU/AAA”. Successivamente

avviene una delezione di cinque nucleotidi (il numero cinque non è divisibile per tre!!) e quello che si

forma è una nuova sequenza nucleotidica del tipo “UUA/AAU/U”. Questa sequenza oltre ad essere più

corta, porterà anche alla codificazione di altri amminoacidi totalmente diversi da quelli iniziali.

2 ] Le mutazioni cromosomica sono mutazioni che alterano la struttura del cromosoma

3 ] Le mutazioni genomiche sono dette anche “Anomalie cariotipiche e sono coloro che modificano il numero di

cromosomi che compone il genoma di un individuo. Ad esempio la trisomia 21 o la trisomia 18 sono mutazioni

genomiche che comportano la presenza di un cromosoma in più rispetto alla normalità.

Sulla base della modalità di avvenimento, le mutazioni geniche (puntiformi) possono avvenire per sostituzione,

delezione o inserzione:

1 ] La sostituzione consiste in un cambio di uno o più nucleotidi all'interno della sequenza. Ad esempio la

mutazione silente, missenso, non senso o neutrale, sono tutte mutazioni che avvengono generalmente per

sostituzione

2 ] La delezione consiste nella eliminazione di un nucleotide dall'interno della sequenza

3 ] L'inserzione consiste nell'aggiunta di un nucleotide all'interno della sequenza

ORGANIZZAZIONE E STRUTTURA DELLA CROMATINA

La cromatina si trova solo e soltanto negli eucarioti. Essa non è altro che un complesso costituito dal DNA

nucleare che si associa a proteine istoniche (basiche) e non istoniche (acide). La cromatina a sua volta si distingue

in due tipologie, ovvero la eucromatina e l'eterocromatina.

l'eucromatina è formata da DNA nucleare associato a istoni e proteine non istoniche. Il DNA in tal caso

– non è particolarmente condensato a queste proteine, e quindi può interagire con l'ambiente esterno

promuovendo attività di trascrizione e replicazione. Ecco perché l'eucromatina viene definita anche

come cromatina attiva. Essendo una struttura poco condensata al microscopio appare chiara (bianca).

l'eterocromatina è formata da DNA nucleare associato a istoni e proteine non istoniche. Il DNA in tal

– caso è molto condensato a queste proteine, e quindi non può interagire con l'ambiente esterno. Questo

DNA è fondamentalmente inattivo a livello biologico. Ecco perché l'eterocromatina viene definita anche

come cromatina inattiva. Essendo una struttura molto condensata al microscopio appare scura (grigia).

Guardiamo adesso come si vengono a formare i cromosomi.

Generalmente il DNA delle cellule eucariote è lungo circa un metro. Per poter stare all'interno di un nucleo

cellulare quindi dev'essere compattato in maniera inverosimile. Questo compattamento prende il nome di

“Superavvolgimento del DNA”. Tale processo è articolato in varie fasi:

nella prima fase inizialmente ci sono quattro tipi di proteine istoniche (H2A, H2B, H3 e H4). Tali istoni si

– accoppiano due a due, precisamente di formano i dimeri “H2A-H2B” e “H3-H4”. Questi dimeri si

associano fra loro a formare il tetramero “H2A-H2B-H3-H4”. Tale tetramero interagisce con un altro

tetramero identico a formare un ottamero, che rappresenta il cosiddetto “core istonico”.

Il core istonico successivamente si avvolge per due volte attorno alla molecola di DNA nucleare e si lega

ad esso attraverso una quarantina di legami a idrogeno, formando il “Nucleosoma”.

I vari nucleosomi vengono successivamente collegati fra loro da una porzione libera di DNA, detto

“DNA linker”, formando difatto la famosa struttura “a collana di perle”

nella seconda fase interviene soprattutto un altro tipo di proteina istonica definita come “H1”.

– Essa si va a posizionare fra i vari nucleosomi adiacenti, avvicinandoli fra loro. Ogni otto nucleosomi

vicini fra loro formano un solenoide. Via via che si formano i solenoidi, la struttura a collana di perle

assume una compattazione sempre più marcata, fino a raggiungere uno spessore di circa 30 nanometri

nella terza fase le proteine istoniche “H1” continuano a compattare la struttura fino a formare la fibra

– di eucromatina (parte attiva della cromatina)

nella quarta fase la eucromatina viene ulteriormente addensata fino a formare la eterocromatina

– (cromatina inattiva)

nella quinta ed ultima fase l'eucromatina e l'eterocromatina si ripiegano in anse che poi si compattano a

– formare il cromosoma

IL CODICE ISTONICO E LA REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE ] Il codice istonico rappresenta l'insieme

delle modificazioni che subisce la cromatina a livello delle code N-terminali degli istoni. Tale modificazioni

vengono lette da alcuni complessi proteici al fine di regolare lo stato della cromatina. Gli istoni infatti presentano

dei lunghi tratti che sporgono fuori dai nucleosomi definiti come "Code N-terminali". Tali code N-terminali sono

in genere carattarizzate da amminoacidi come lisine, citosine e serine, che possono essere soggette ad una serie di

modificazioni epigenetiche covalenti per opera di enzimi specifici. Alcune di queste modificazioni sono

l'acetilazione, la metilazione e la fosforilazione:

l'acetilazione (aggiunta di un gruppo acetile) avviene a livello delle lisine che compongono le proteine

– istoniche, per opera dell'enzima HAT (Istone Acetile Transferasi). Tale modificazione viene risolta

dall'intervento della HDAC (Istone Deacetilasi), che elimina il gruppo acetile e ripropone la situazione

iniziale. Generalmente l'acetilazione è una modificazione che attiva la trascrizione (attivante), mentre

togliendo il gruppo acetile viene inattivata la trascrizione

la metilazione (aggiunta di un gruppo metile) può avvenire a livello delle lisine o delle citosine che

– compongono rispettivamente le proteine istoniche e il DNA.

- quando la metilazione avviene a livello delle proteine istoniche, vengono modificate le lisine per opera

dell'enzima HMT (Istone Metil Transferasi). Tale modificazione viene risolta dall'intervento della HDM

(Istone Demetilasi), che elimina il gruppo metile e ripropone la situazione iniziale.

- quando la metilazione avviene a livello del DNA, vengono modificate le citosine, per opera della DNMT

(DNA-metil-transferasi). Tale modifica porta all'aggiunta di un gruppo metile sul carbonio 5' dell'anello

citosinico. Dalla metilazione si viene a formare quindi la 5-metil-citosina. Questa modificazione può

essere risolta dall'intervento della DND (DNA Deametilasi), che elimina il gruppo metile e ripropone la

situazione iniziale riformando una citosina

In intrambi i casi la metilazione è un processo inibitorio della trascrizione, mentre la deametilazione

attiva la trascrizione

la fosforilazione (aggiunta di un gruppo fosfato) avviene a livello delle serine che compongono le

– proteine istoniche, per opera dell'enzima HK (Istone Chinasi). Tale modifica viene eliminata tramite le

istone fosfatasi, che eliminano il gruppo fosfato e riprongono la situazione iniziale.

La fosforilazione è un processo che attiva la trascrizione, mentre la defosforilazione la inibisce

Tutte queste modificazioni epigenetiche sono eriditarie, e quindi le modifiche e le caratteristiche del DNA e degli

istoni che compongono la cromatina di una cellula figlia, saranno identiche a quelle della cromatina della cellula

madre. Questo deriva dal fatto che durante la replicazione del DNA, il filamento di neo-sintesi riceve tutte le

modifiche e caratteristiche del filamento parentale. Si parla difatti di "Ereditarietà del codice istonico".

Tali modifiche permettano non solo di regolare lo stato della cromatina, ma anche di regolare l'espressione

genica, infatti quando la cromatina si trova notevolmente complessata agli istoni (eterocromatina) i geni non

sono generalmente attivi, mentre quando la cromatina si trova meno complessata agli istoni (eucromatina) i geni

sono generalmente attivi. Tutte queste modificazioni covalenti non fanno altro che regolare il grado di

complessazione fra DNA e istoni, in maniera tale da formare eucromatina ed eterocromatina a seconda che si

voglia attivare o disattivare determinati geni. Questo processo prende il nome di "Regolazione Trascrizionale".

Si definisce cosi, perché un gene inattivo non va incontro a trascrizione, mentre un gene attivo va incontro a

trascrizione. Difatto attivando e disattivando i geni, viene regolata anche l'attività trascrizionale.

Oltre a tutte queste modificazioni covalenti, ci sono altri mezzi per regolare l'attività trascrizionale, come ad

esempio l'utilizzo di fattori trascrizionali, ossia proteine che grazie alla loro struttura e alla presenza di domini

particolari, sono in grado di legarsi a sequenze specifiche di DNA, andando a regolare l'attività trascrizionale.

I fattori trascrizionali si dividono in: fattori trascrizionali generali e fattori trascrizionali regolativi.

i fattori trascrizionali generali sono proteine presenti in tutte le cellule indistintamente (attivatori e

– repressori). Essi interagiscono soprattutto a livello del sito di legame del promotore, alterandolo.

L'alterazione può essere positiva o negativa. Se positiva significa che a seguito della modifica, il

promotore è in grado di legarsi perfettamente con l'RNA-polimerasi, e questo permette la trascrizione

(attivatori). Se negativa significa che a seguito della modifica, il promotore non è in grado di legarsi

perfettamente con l'RNA-polimerasi, e questo blocca la trascrizione ancor prima che avvenga (inibitori).

Difatto col tipo di modifica apportata, i fattori trascrizionali generali regolano la trascrizione di tutte le

cellule dell'organismo

i fattori trascrizionali regolativi sono proteine che possono variare a seconda del tipo di cellula che

– prendo in considerazione. Ad esempio nell'essere umano ci sono determinati fattori trascrizionali

regolativi negli epatociti, altri nelle cellule nervose e altri ancora nelle altre cellule del corpo.

Questi fattori si legano nella regione antecedente al promotore di un gene, detta sito di controllo.

Una volta legate al sito di controllo possono regolare il grado di attività di quel determinato gene.

Ad esempio, negli epatociti del fegato e nelle cellule nervose i fattori regolativi si legano al sito di

controllo del gene che codifica l'albumina. Nel caso degli epatociti aumentano l'attività trascrizionale di

quest'ultimo. Nel caso delle cellule nervose ne diminuiscono l'attività.

L'effetto finale è che il fegato produce molta più albumina rispetto al cervello!!

LA SINTESI PROTEICA (fase di trascrizione)

Introduzione alla sintesi proteica ] Ci sono geni che codificano per la formazione di proteine istoniche, le quali

sono fondamentali per tanti aspetti. Ad esempio:

le proteine istoniche assieme al DNA tendono a compattarsi a formare la eucromatina e l'eterocromatina

– le proteine istoniche assieme all'r-RNA formano i ribosomi, gli organuli sede della sintesi proteica

– Studiando nel dettaglio la composizione delle proteine istoniche abbiamo visto che più o meno la loro

sequenza amminoacidica è similare in ogni individuo vivente. Questo non può altro che significare che

anche i ribosomi sono molto simili in ogni individuo vivente. Se infatti andiamo a vedere nel passato,

notiamo che i ribosomi sono strutture altamente statiche dal punto di vista evolutivo, in pratica

possiamo affermare che non hanno subito alcun tipo di cambiamento. Questo è dovuto sicuramente al

fatto che i ribosomi devono effettuare uno dei processi più importanti e complessi che ci sia, ovvero la

sintesi proteica. La sintesi proteica è quel processo unidirezionale che permette al DNA di essere

trascritto di m-RNA (trascrizione), che successivamente viene tradotto in amminoacidi (traduzione).

Gli amminoacidi successivamente andranno a legarsi formando proteine tridimensionali

Differenza fra la sintesi proteica negli eucarioti e procarioti ] Quando si parla di sintesi proteica dobbiamo

considerare che avviene differentemente a seconda che si parli di organismi procarioti o eucarioti. Una cosa

diversa sussiste nel luogo della trascrizione. Infatti:

Negli organismi eucarioti morfologicamente parlando sono costituiti da un nucleo, caratterizzato da una

– membrana nucleare che a sua volta separa il materiale genetico (DNA) dall'ambiente citoplasmatico.

Per questo motivo la fase di trascrizione avviene nel nucleo, mentre la fase di traduzione avviene nel

citoplasma a contatto coi ribosomi. Per poter passare dal nucleo al citoplasma e raggiungere i ribosomi,

ricordo che l'm-RNA trascritto deve passare attraverso i pori nucleari. I pori nucleari sono molto stretti,

e per questo motivo solo gli esoni (tratti codificanti di ridotte dimensioni) riescano a passare, mentre gli

introni (tratto non codificanti di notevoli dimensioni) non riescono a passare. Per questo motivo il

filamento di m-RNA subisce il processo di maturazione, in cui vengono eliminati gli introni.

Con l'eliminazione degli introni l'm-RNA può passare tranquillamente attraverso i pori nucleari e

raggiungere i ribosomi nel citoplasma, andando incontro a traduzione.

Negli organismi procarioti morfologicamente parlando non c'è il nucleo, in quando il DNA si trova

– immerso in una regione casuale del citoplasma che prende il nome di “Nucleoide”. Per questo motivo la

trascrizione e la traduzione avvengono entrambe nel citoplasma, una dietro l'altra. La rapidità della

sintesi proteica in questi organismi è notevolmente maggiore, in quanto non vi è la fase di maturazione.

La rapidità della sintesi proteica è di fondamentale importanza, infatti i batteri per sopravvivere devono

essere in grado di adattarsi il prima possibile alle continue variazioni dei parametri fisici-chimici-

ambientali!! TIPI DI RNA TRASCRITTI A PARTIRE DAL DNA

Dal processo di trascrizione il DNA può essere trascritto in vari tipi di RNA, a seconda delle necessità. Essi sono:

m-RNA ] sta per “RNA-messaggero”, ed è una molecola a singolo filamento che una volta trascritta va incontro

alla traduzione e quindi alla formazione di amminoacidi. Quest'ultimi poi si legheranno a formare proteine.

Come abbiamo visto prima nei procarioti il singolo filamento di m-RNA viene trascritto nel citoplasma e

– viene tradotto immediatamente dopo sempre a livello citoplasmatico a contatto coi ribosomi

Negli eucarioti invece la presenza del nucleo, fa si che il singolo filamento di m-RNA venga per prima

– cosa trascritto nel nucleo, successivamente maturato (attraverso processo di maturazione, in cui

vengono eliminati gli introni) ed infine vada incontro a traduzione nel citoplasma a contatto coi ribosomi

t-RNA ] sta per “RNA-transfert”, ed è la molecola che partecipa alla traduzione come trasportatore di

amminoacidi (amminoacil-tRNA) e peptidi (peptidil-tRNA). I t-RNA possono essere di 32 tipi diversi, anche se

hanno praticamente tutti la stessa forma e la stessa dimensione, che varia dalle 73 alle 93 paia di basi.

Strutturalmente parlando ogni t-RNA assomiglia moltissimo ad un trifoglio, ma prima di formare questa classica

struttura, il t-RNA deve andare incontro al processo di maturazione.

All'inizio abbiamo la presenza di un singolo filamento di RNA che presenta un estremità 3'OH ed una

– estremità 5'P.

successivamente rimossa una sequenza intronica dall'estremità 5'P

– dopo di che a livello dell'estremità 3'OH, viene trasformato un codone AUU in un codone ACC.

– Questa parte andrà a costituire il sito di legame per l'amminoacido

a questo punto viene rimosso un introne presente in un ansa, formando l'anticodone

– infine vengono modificate alcune basi organiche azotate, formando l'Ansa D e l'ansa T

Dopo la fase di maturazione, si sono formati ben quattro steli e anse a doppio filamento. Questi steli e anse si

formano in virtù della complementarietà intracatena che consente a brevi tratti di RNA di interagire fra loro a

formare doppi filamenti. Questi steli sono:

Stelo accettore ] non è altro che un tratto di t-RNA che presenta un estremità libera 3', alla quale

– generalmente di lega l'amminoacido corrispondente alla tripletta dell'anticodone

Ansa D ] è un tratto di t-RNA che presenta la 5,6-di-idrouridina, che rappresenta una uridina ridotta da

– due idrogeni. Ricordo che l'uridina è ribonucleoside, che nello specifico è caratterizzato da un uracile

legato ad una molecola di ribosio

Ansa variabile ] è quella parte di t-RNA che può variare le sue dimensioni. Sulla base del tipo si ansa

– variabile, ricaviamo difatti i 32 tipi di t-RNA conosciuti fino ad ora

Ansa dell'anticodone ] è un tratto di t-RNA formato da tre nucleotidi corrispondenti alla tripletta che

– codifica per l'amminoacido legato allo stelo accettore

Ansa T ] è un tratto di t-RNA che presenta che presenta una ribotimidina

r-RNA ] sta per “RNA-ribosomiale”, ed è una molecola a singolo filamento lineare che, può assumere

conformazioni tridimensionale molto complesse. Tale molecola rappresenta l'impalcatura su cui si ancorano le

proteine ribosomiali al fine di formare il ribosoma. Alcuni filamenti di r-RNA

la molecola che si associa alle proteine ribosomiali per formare i ribosomi.

RNA-interference (RNA-i) ] Sostanzialmente dobbiamo sapere che nelle cellule di un mammifero:

una piccola percentuale del DNA va in contro a trascrizione formando m-RNA che a sua volta verrà

– tradotto in amminoacidi

una grande percentuale del DNA produce invece RNA a doppio filamento non codificanti, che

– sembrerebbero i diretti responsabili della complessità funzionale dei nostri meccanismi cellulari.

Questi RNA non codificanti vengono definiti come ncRNA (No Coding RNA) e sono alla base del

meccanismo della “Interferenza a RNA”

L'interferenza a RNA è stato scoperto da Craig Mello e Andew Fire, che per questo vinsero il premio nobel nel

2006. Si tratta praticamente di un meccanismo epigenetico grazie al quale è possibile ottenere una forma di

silenziamento genico, cioè vengono inattivati determinati geni. Questo meccanismo avviene dopo la trascrizione,

in quanto agisce direttamente a livello degli m-RNA.

L'esperimento di Mello e Fire consisteva costruire inizialmente in laboratorio tre RNA differenti:

uno senso (a singolo filamento)

– uno antisenso (a singolo filamento)

– uno a doppio filamento (costituito da un filamento senso ed un filamento antisenso)

Inserirono questi tre RNA in tre gruppi differenti di nematodi e videro che nel nematode i qui avevano inserito il

filamento senso o il filamento antisenso, non succedeva nulla. Nei nematodi in cui avevano inserito l'RNA a

doppio filamento si notavano dei movimenti incontrollati dell'animale. Da qui dedussero che solo l'RNA a doppio

filamento era stato in grado di inibire determinati geni che avevano cambiato il comportamento dell'animale.

Ripetettero l'esperimento anche con altri animali, come ad esempio i vermi, ed anche in tal caso i risultati furono

gli stessi. La deduzione fu che quindi c'erano molecola di RNA a doppio filamento in grado di inibire la

trascrizione ed inattivare cosi determinati geni dell'animale.

L'interferenza a RNA si è scoperto poi col tempo che può avvenire in ben tre modalità:

o viene bloccata la traduzione del filamento di m-RNA

– o viene idrolizzato il filamento di m-RNA, che per tanto non può andare incontro a traduzione

– viene promossa la formazione di eterocromatina (avente DNA inattivo, il quale non subisce trascrizione)

Determinando il blocco della traduzione o l'idrolisi del filamento di m-RNA trascritto, non si viene a formare

nessuna proteina. Infatti ciò che notiamo visivamente è che abbiamo il DNA e l'm-RNA, ma nessuna proteina.

1 ] Guardiamo come avviene il meccanismo dell'interferenza a RNA attraverso l'idrolisi dell'm-RNA:

inizialmente abbiamo gli ncRNA (No Coding RNA). Gli ncRNA vengono tagliati da un particolare

– enzima del tipo ribonucleasi che prende il nome “Dicer”.

Una volta tagliati gli ncRNA, si formano tanti piccoli frammenti più piccoli chiamati “siRNA”.

– Gli siRNA sono caratterizzati da RNA a doppio filamento, di cui un filamento è detto “filamento

passeggero”, l'altro filamento è detto “filamento guida”

successivamente i siRNA vengono caricati in un complesso proteico chiamato “pre-RISC”.

– Tale complesso proteico è caratterizzato da un proteina argonauta, caratterizzata da tre domini detti

“dominio PAZ”, “dominio PIWI” e “dominio MID”

grazie ai propri domini la proteina argonauta è in grado di interagire coi filamenti di siRNA, nello

– specifico abbiamo che:

- il filamento passeggero viene legato al dominio PAZ e viene tagliato in due parti col conseguente

distacco immediato

- il filamento guida viene legato al dominio MID formando il cosiddetto “Complesso RISC”

- il dominio PIWI non è altro che un canale carico positivamente che attrae i filamenti di siRNA carichi

negativamente)

il complesso RISC ottenuto, a questo punto interagisce con un m-RNA bersaglio. Questo accade grazie al

– fatto che il filamento guida, direziona la proteina argonauta verso un filamento di m-RNA bersaglio.

Una volta che è arrivato a destinazione, la proteina argonauta idrolizza in due parti il filamento di m-

RNA grazie alla propria attività ribonucleasica

l'm-RNA non è quindi più in grado di andare incontro a traduzione, per tanto non può più formare

– amminoacidi. Senza gli amminoacidi non si formano le proteine.

Abbiamo quindi terminato il meccanismo dell'interferenza a RNA!!

2 ] Guardiamo come avviene il meccanismo dell'interferenza a RNA tramite il blocco della traduzione dell'm-

RNA: inizialmente abbiamo un filamento di RNA a singolo filamento contente delle basi complementari molto

– vicine che permettano al filamento di ripiegarsi su se stesso formando un RNA a doppio filamento con

un ansa ad una delle due estremità. Tale RNA prende il nome di pri-miRNA

il pri-miRNA è riconosciuto da un complesso multiproteico chiamato “Complesso del Microprocessore”

– che a sua volta è formato da due proteine: la DGCR8 e la Drosha.

Per prima cosa la proteina DCGR8 si lega al pri-miRNA a doppio filamento e riconoscono l'ansa presene

a livello dell'estremità terminale. Successivamente interviene la proteina Drosha che taglia il filamento

di pri-miRNA a livello dell'ansa terminale andando a formare il pre-miRNA

(l'azione del complesso multiproteico del microprocessore avviene completamente nel nucleo)

il pre-miRNA è esportato dal nucleo al citoplasma attraverso i pori nucleari. Questa esportazione è resa

– possibile da proteine come le “Esportine” e le “Proteine Ran GTP”. Infatti le esportine si legano al pre-

miRNA ed interagiscano successivamente con le proteine Ran GTP. Tali proteine vanno incontro a

defosforilazione formando proteine Ran GDP (forma inattiva delle proteine Ran), grazie alla reazione

[Ran GTP → Ran GDP + Pi ]. Tale reazione è fortemente esoergonica. L'energia liberata viene utilizzata

dalle esportine per trasportare i pre-miRNA dal nucleo al citoplasma cellulare

il pre-miRNA una volta arrivato nel citoplasma va incontro ad un processo di maturazione attuato

– dall'enzima Dicer (ribonucleasi), che sostanzialmente lo taglia. Si viene quindi a formare un piccolo

“mi-RNA” a doppio filamento lungo circa 21-24 nucleotidi. Un filamento è detto “filamento passeggero”,

mentre l'altro è detto “filamento guida”

successivamente il mi-RNA viene caricato in un complesso proteico chiamato “pre-RISC”.

– Tale complesso proteico è caratterizzato da un proteina argonauta, caratterizzata da tre domini detti

“dominio PAZ”, “dominio PIWI” e “dominio MID”, con al centro una molecola di magnesio situata nel

sito attivo della proteina, che permette alla proteina argonauta di interagire con altre molecole

sostanzialmente grazie ai propri domini e al sito attivo, la proteina argonauta è in grado di interagire coi

– filamenti di mi-RNA. Nello specifico abbiamo che:

- il filamento passeggero viene legato al dominio PAZ e viene tagliato in due parti col conseguente

distacco immediato

- il filamento guida viene legato al dominio MID formando il cosiddetto “Complesso RISC”

- il dominio PIWI non è altro che un canale carico positivamente che attrae i filamenti di mi-RNA

carichi negativamente)

il complesso RISC a questo punto interagisce con un m-RNA bersaglio. Questo accade grazie al fatto che

– il filamento guida, direziona il complesso RISC verso un filamento di m-RNA bersaglio. Una volta che è

arrivato a destinazione, il filamento guida si lega ad una regione parzialmente complementare del

filamento di m-RNA ed inibisce l'avvio del processo di traduzione

il fatto che sia parzialmente complementare lo si vede dal fatto che, una volta che il filamento guida si è

– legato alla regione dell'm-RNA, si forma una piccola ansa, a manifestare proprio la non totale

complementarietà fra i due filamenti

l'm-RNA non è quindi più in grado di andare incontro a traduzione, per tanto non può più formare

– amminoacidi. Senza gli amminoacidi non si formano le proteine.

Abbiamo quindi terminato il meccanismo dell'interferenza a RNA!!

3 ] Guardiamo come il meccanismo dell'interferenza a RNA promuove la formazione di eterocromatina:

la cellula come abbiamo visto precedentemente è in grado di formare determinati tipi di RNA chiamati

– “si-RNA” e “mi-RNA” che sono in grado non solo di inibire la sintesi proteica, ma anche di regolare lo

stato della cromatina. Per “regolazione dello stato della cromatina”, intendiamo dire che viene regolata

la quantità di eterocromatina ed eucromatina presente nella cellula

nello specifico i siRNA inducono una metilazione a livello dei residui di lisina 9 e lisina 27 che

– compongono l'istone H3. Questo comporta una compattazione della cromatina e la formazione

dell'eterocromatina

invece i frammenti di mi-RNA che partecipano a questo processo si legano nelle vicinanze dei residui di

– lisina da metilare dell'istone H3 ed attivano l'enzima “Istone-metil-transferasi” (HMT). Tale enzima è in

grado di metilare i residui di lisina dell'istone H3 inducendo una compattazione della cromatina e la

formazione dell'eterocromatina

l'eterocromatina formata a partire dai si-RNA e mi-RNA viene mantenuta attraverso altre proteine

– come la HP1 e la SWI6 che si associano alla eterocromatina regolando il giusto grado di compattazione

sno-RNA e maturazione dell'r-RNA ] sta per “RNA nucleolari a piccole dimensioni” ed è costituito da corti RNA

a singolo filamento composti da circa 100-300 nucleotidi. Tali sno-RNA sono particolarmente importanti per il

processo di maturazione dell'r-RNA. La maturazione dell'r-RNA avviene in una regione particolare del nucleo

definita come “Nucleolo”. Durante la maturazione dell'r-RNA, quello che succede è che:

inizialmente alcuni filamenti di sno-RNA si associano con proteine ribosomiali portando alla formazione

– di tante piccole molecole chiamate snoRNP (proteine-ribo-nucleiche a piccole dimensioni)

le snoRNP iniziano ad associarsi al r-RNA immaturo, che prende il nome di “pre-r-RNA”.

– Il pre-r-RNA è sostanzialmente formato dagli sno-RNA-U3 ed una dozzina di proteine snoRNP differenti

fra loro

le pre-r-RNA successivamente vengono modificate grazie all'azione enzimatica del complesso

– “Exosoma”, che sarebbe un complesso multienzimatico caratterizzato da ben 12 esonucleasi diverse

a seguito delle modifiche apportate dall'exosoma, come ad esempio la conversione di una uridina in una

– pseudouridina o la metilazione a livello del carbonio C2 del ribosio di un nucleotide, si ha che il

pre-r-RNA diventa un r-RNA maturo

r-RNA maturo può essere di quattro forme differenti negli eucarioti : r-RNA 28s, r-RNA 18s, r-RNA 5,8s

– e r-RNA 5s. Fra queste forme di r-RNA, possono essere formate tutte tranne l'r-RNA 5s, che viene

codificata da un gruppo di geni differenti ad opera direttamente della RNA-polimerasi III.

Questa forma di r-RNA 5s, infatti non subisce alcuna modificazione chimica da parte dell'exosoma!!

r-RNA maturo può essere di tre forme differenti nei procarioti: r-RNA 23s, r-RNA 16s e r-RNA 5s

RNA-telomerico ] è una componente strutturale dell'enzima “Telomerasi”

TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

La trascrizione differentemente dalla replicazione, è un processo che non comprende tutto il DNA, ma è un

evento circoscritto al singolo gene. Inoltre la replicazione è un processo che in alcune cellule non avviene, infatti

ci sono cellule che non proliferano mai, mentre la trascrizione avviene continuamente in tutte le cellule viventi.

La trascrizione nei procarioti avviene interamente nel citoplasma, per via dell'assenza del nucleo. Tale processo è

reso possibile grazie alla presenza di un particolare enzima chiamato “RNA-polimerasi-DNA-dipendente”, detto

generalmente anche “RNA-polimerasi”. L'RNA-polimerasi delle cellule procariote è diverso da quello delle

cellule eucariote. Generalmente quello dei procarioti è un enzima caratterizzato da quattro subunità proteiche:

due subunità alfa (alfa-1 e alfa-2)

– due subunità beta (beta e beta')

Talune subunità si legano ad una proteina chiamata fattore-sigma o subunità sigma, ed assieme formano il

cosiddetto “Oloenzima” che permette l'apertura della bolla di trascrizione e l'avvio della trascrizione.

Le due subunità alfa e le due subunità beta sono prevalentemente implicate nella sintesi dell'm-RNA.

Il fattore sigma serve invece per riconoscere il promotore, ossia quella regione del DNA dalla quale ha inizio la

trascrizione. L'enzima RNA-polimerasi ha un attività di Proof reading molto scarsa, per tale motivo fa molti

errori durante la formazione del filamento m-RNA (circa un errore ogni 10000 nucleotidi). Nonostante i molti

errori, tale attività è comunque compatibile con la vita. Inoltre la RNA-polimerasi ricordo che non necessita di

nessun innesco, è sempre processiva ed attiva a svolgere la propria funzione a differenza della DNA-polimerasi

Il processo di trascrizione nei procarioti è caratterizzato da una fase di inizio, di allungamento e di terminazione:

FASE DI INIZIO ] inizialmente il fattore sigma della RNA-polimerasi riconosce il promotore.

Il promotore è una sequenza del DNA procariote molto breve, caratterizzata da due regioni distinte:

la regione meno dieci (regione-10) viene definita anche col nome di “Pribnow box” ed è la regione del

– promotore posizionate a 10 nucleotidi dal punto di inizio della trascrizione. Essa è caratterizzata da 6

paia di basi organiche azotate, tutte adenine e timine. Questa non è una casualità, infatti adenine e

timine sono legate assieme da soli due legami a idrogeno (ricordo che invece citosine e guanine sono

legate da tre legami ad idrogeno), e questo gli permette di essere una regione facilmente despiralizzabile.

Non a caso è proprio in questa regione del promotore che avviene l'apertura del DNA.

la regione meno trentacinque (regione-35), è la regione del promotore posizionata a 35 nucleotidi dal

– punto di inizio della trascrizione

Una volta che il promotore è stato riconosciuto dal fattore sigma, inizia il legame effettivo fra l'RNA-polimerasi e

il promotore.

per prima cosa il fattore sigma riconosce e si lega alla regione -35, formando il cosiddetto complesso

– chiuso, che determina la fase di “Standby”. Nella fase di standby il promotore modica parzialmente la

propria topologia

successivamente il fattore sigma riconosce e si lega alla regione-10, formando il complesso aperto, in cui

– la doppia elica del DNA inizia a despiralizzarsi

al momento in cui il fattore sigma si è legato stabilmente con le regioni -10 e -35 del promotore, si forma

– la cosiddetta “bolla di trascrizione”, che consiste in una sequenza di circa 12 nucleotidi

il fattore sigma interagisce con le subunità alfa-1 e alfa-2 dell'RNA-polimerasi II e si ha la formazione

– dell'oloenzima (fattore sigma + RNA-polimerasi II) che permette l'apertura della bolla di trascrizione e

da il via al processo di trascrizione stesso

FASE DI ALLUNGAMENTO ] una volta che è iniziata la trascrizione l'RNA-polimerasi trascrive solo uno dei

due filamenti di DNA. L'altro filamento non trascritto viene definito come “filamento senso”.

La trascrizione è resa possibile specificatamente dalla subunità beta e dalla subunità beta' della RNA-polimerasi,

che riescano ad allungare il filamento di m-RNA grazie alla nascita di nuovi legami fosfodiesterici che

intercorrono fra particolari nucleotidi attivati, detti “Ribonucleotidi Trifosfati”, i quali invece di avere un gruppo

fosfato, ne hanno ben tre, grazie all'azione catalitica delle pirofosfatasi. Dopo che sono stati polimerizzati una

decina di ribonucleotidi, viene rilasciato il fattore sigma che andrà a riconoscere altri promotori e rimane solo la

RNA-polimerasi attaccata al filamento di DNA. Il filamento di m-RNA continua quindi ad allungarsi fino a che

non andiamo incontro ad uno dei tre fattori di terminazione, quali:

“sequenza di terminazione”, detta anche “sequenza pseudo-palindromica”

– andiamo incontro alla proteina di terminazione Rho

– andiamo incontro ad eventi casuali che causano il distacco precoce dell'RNA-polimerasi dal DNA

FASE DI TERMINAZIONE ] la terminazione del processo di trascrizione può avvenire in tre modi:

ad un certo punto durante la trascrizione del filamento di m-RNA andiamo incontro alla sequenza

– pseudo-palindromica. Tale sequenza determina un incurvamento del filamento di DNA che forma una

struttura a forcina molto robusta per via della presenza di guanina e citosina, che si legano tramite

triplo legame a idrogeno. Questa struttura a forcina robusta destabilizza il legame fra il DNA e l'RNA-

polimerasi, che si distacca inesorabilmente. Col distacco della RNA-polimerasi termina anche la

trascrizione. Questo tipo di terminazione prende il nome di “terminazione Rho-indipendente”, perché

non dipende dalla presenza o meno della proteine Rho

ad un certo punto durante la trascrizione, alcuni geni codificano per la formazione di un complesso

– proteico caratterizzato da 6 subunità, detta “Proteina Rho”. Tale proteina si lega al DNA e lo

destabilizza, separandolo dall'RNA-polimerasi. Con il distacco dell'RNA-polimerasi termina la

trascrizione

ci sarebbe anche un terzo modo, molto più raro, in cui in maniera del tutto casuale si formano dei

– complessi di terminazione che distaccano precocemente il DNA dalla RNA-polimerasi. In tal modo viene

terminata la trascrizione e si viene a formare un filamento di m-RNA non funzionale. Per evitare ciò il

nostro organismo sintetizza continuamente delle proteine con funzione “Co-Trascrizionale”, che vanno

di pari passo alla RNA-polimerasi, stando attente a che tutto il processo vada correttamente!!

TRASCRIZIONE DEGLI EUCARIOTI

La trascrizione negli eucarioti avviene interamente nel nucleo. Tale processo è reso possibile grazie alla presenza

di un particolare enzima chiamato “RNA-polimerasi-DNA-dipendente”, detto generalmente anche

“RNA-polimerasi”. Negli eucarioti, l'RNA-polimerasi è diverso da quello delle cellule procariote. Ed inoltre

mentre nei procarioti abbiamo un unica molecola di RNA-polimerasi, negli eucarioti ne abbiamo ben 4 tipi:

RNA-polimerasi I. Tale enzima si trova nel nucleolo e si occupa dell sintesi degli r-RNA

– RNA-polimerasi II. Tale enzima si trova nel nucleo e si occupa della sintesi degli m-RNA,

– RNA-telomerico e alcuni RNA non codificanti come si-RNA e mi-RNA

RNA-polimerasi III. Tale enzima si trova nel nucleo e si occupa principalmente della sintesi del t-RNA

– RNA-polimerasi mitocondriale

Per capire la presenza dei quattro tipi di RNA-polimerasi fu fatto un esperimento con l'α-amanitina, una tossina

che prodotta da un fungo chiamato “Amanita falloide”. Tale tossina infatti interagisce in maniera differente con i

tre RNA-polimerasi:

non interagisce quasi per nulla con la RNA-polimerasi I

– è estremamente attiva nei confronti dell'RNA-polimerasi II

– è poco attiva nei confronti dell'RNA-polimerasi III

La RNA-polimerasi che interessa a noi nel processo di trascrizione è fondamentalmente la RNA-polimerasi II,

ossia colei che è in grado di trascrivere un filamento di DNA in un filamento di m-RNA

La Trascrizione negli eucarioti abbiamo visto che è resa possibile grazie all'enzima RNA-polimerasi II, che

trascrive un filamento di DNA in un filamento di m-RNA. Il problema è che questo filamento di m-RNA non è

del tutto continuo, ma presenta delle discontinuità, ovvero dei tratti sono molto brevi e codificanti, altri tratti

sono molto lunghi e non codificanti (non codificano per nessuna funzione). I tratti brevi prendono il nome di

“Esoni”, quelli lunghi prendono il nome di “Introni”. Questo è un grosso problema, perché il filamento di

m-RNA, una volta trascritto dalla RNA-polimerasi II, deve passare attraverso i pori nucleari e raggiungere i

ribosomi, per poter essere tradotto. Gli introni però sono troppo lunghi e per ingombro sterico non passano dai

pori nucleari, per questo motivo devano essere eliminati. L'eliminazione degli introni dal filamento di m-RNA è

detto “processo di maturazione”, grazie al quale il filamento di m-RNA potrà essere finalmente in grado di

passare perfettamente attraverso i pori nucleari e raggiungere i ribosomi nel citoplasma cellulare.

La presenza degli esoni e degli introni negli eucarioti è stata vista per la prima volta in assoluta da Chambon nel

1978, grazie al suo esperimento:

Chambon e i suoi collaboratori sfruttarono la funzionalità dell'enzima “Trascrittasi inversa” detta anche

– in gergo “DNA-polimerasi-rna-dipendente”

inizialmente Chambon isolò l'm-RNA citoplasmatico dell'ovoalbumina di pollo tramite un processo di

– estrazione e purificazione

successivamente l'm-RNA citoplasmatico fu fatto reagire con la trascrittasi inversa, ottenendo cosi un

– cDNA (DNA copia)

dopo di che il cDNA fu denaturato ed introdotto equamente all'interno di due provette.

– In una provetta vi era la presenza di m-RNA citoplasmatico. Nell'altra provetta vi è era la presenza di

m-RNA nucleare. Abbiamo quindi due provette contenenti rispettivamente:

[cDNA + m-RNA citoplasmatico ] e [cDNA + m-RNA nucleare ]

Chambon ebbe un idea geniale. Sapeva benissimo che il cDNA e l'm-RNA nelle due provette per via

– dell'energia libera non sarebbero mai potuti reagire e formare conseguentemente degli ibridi.

Per tanto abbassò la temperatura ed utilizzò degli accorgimenti tecnici, riuscendo ad ottenere l'ambiente

ideale nelle provette per poter formare gli ibridi.

A questo punto nelle due provette avremo [cDNA-mRNA citoplasmatico] e [cDNA-mRNA nucleare]

non rimase altro che vedere e studiare nel dettaglio i due ibridi.

– L'ibrido cDNA-mRNA citoplasmatico presentava una doppia elica continua senza punti di discontinuità.

L'ibrido cDNA-mRNA nucleare invece presentava una struttura altamente discontinua caratterizzate da

anse (tratti di DNA di discreta entità) molto lunghe dette “non codificanti” (Introni) e anse più corte

dette “codificanti” (Esoni)

Dalla scoperta di Chambon riuscimmo a capire quindi che il genoma di un organismo eucariote è caratterizzato

da tratti codificanti, molto brevi, detti Esoni e tratti non codificanti, molto lunghi, detti Introni. Gli esoni e gli

introni si intervallano fra di loro formando all'univoco il genoma di un organismo eucariote.

La formazione degli introni, si pensa sia una nota evolutiva per salvaguardarci dalla formazione delle mutazioni

genomiche. Infatti gli introni si comportano metaforicamente da spugne, assorbendo in continuazione grandi

quantità di mutazioni. Questo è dovuto al fatto che essendo molto più grandi rispetto agli esoni, hanno

semplicemente una probabilità maggiore di essere colpiti da mutazioni. Il punto è che una mutazione quando

colpisce un introne non sortisce alcun effetto, poiché l'introne stesso non codifica per nessuna funzione specifica

dell'organismo.

Il processo di trascrizione negli eucarioti è composto da una fase di riconoscimento (detta fase pre-inizio), una

fase di inizio, una di allungamento e una di terminazione. Successivamente abbiamo anche che il filamento di

m-RNA trascritto va incontro alla fase di maturazione e di esportazione per poter decorrere tra i pori nucleari ed

andare nel citoplasma, dove i grazie ai ribosomi potrà essere tradotto in amminoacidi. Abbiamo 6 fasi distinte:

riconoscimento (pre-inizio)

– inizio

– allungamento

– terminazione

– maturazione

– esportazione

FASE PRE-INIZIALE ] tutto nasce a partire da determinate regioni del DNA chiamate “Promotori”.

A differenza dei procarioti, in cui vi è un solo promotore per ogni gene, negli eucarioti abbiamo molti più

promotori simultaneamente. Ogni promotore non è altro che una corta sequenza di DNA composta da tre parti:

regione TATA box. Essa è caratterizzata da ripetizioni di timina e adenina (TA) una dietro l'altra.

– Generalmente è situata a 25 nucleotidi di distanza dal punto di inizio della trascrizione

regione CAAT box. Essa si trova a 80 nucleotidi dal punto di inizio della trascrizione

– regione GC box. Essa si trova a 100 nucleotidi dal punto di inizio della trascrizione

Inizialmente la regione TATA box viene riconosciuta da particolari proteine dette “Fattori trascrizionali”.

Tali proteine via via che si legano alla TATA box formano un complesso multiproteico che richiama a loro la

RNA-polimerasi II. A questo punto la RNA-polimerasi II si lega a questo alla TATA-box formando il complesso

“Pre-Trascrizionale”. A questo punto il dominio CDT (che rappresenta la coda della RNA-polimerasi II) viene

parzialmente fosforilato. La fosforilazione del dominio CDT è fondamentale perché permette l'attivazione a tutti

gli effetti della RNA-polimerasi II. Tale fosforilazione avviene grazie a due proteine specifiche. Infatti:

inizialmente abbiamo l'intervento della proteina TFIIE. Tale proteina enzimatica è sostanzialmente una

– elicasi. La TFIIE si lega inizialmente al dominio CDT della RNA-polimerasi II, determinando l'apertura

della doppia elica del DNA. Si formano quindi i due filamenti singoli

successivamente abbiamo l'intervento della proteina TFIIH. Tale proteina una volta che la TFIIE ha

– attuato la sua funzione, va ad interagire con l'RNA-polimerasi II fosforilandone una serina in posizione

5' nel dominio CDT. Questa fosforilazione attiva la RNA-polimerasi II, che può iniziare a polimerizzare i

filamento di m-RNA

Una cosa molto importante è che vicino alla regione TATA-box abbiamo la presenza di determinati elementi di

controllo (costituiti da corte sequenze di DNA) che interagiscono con altre proteine specifiche in grado di indurre

o inibire il processo di maturazione dell'm-RNA trascritto. Alcuni di questi elementi di controllo sono:

gli elementi “Enhancers”, che sono in grado di attivare il processo di sintesi e maturazione dell'm-RNA

– gli elementi “Silencers”, che sono in grado di inibire il processo di sintesi e maturazione dell'm-RNA

FASE INIZIALE ] dopo che l'RNA-polimerasi è stata attivata, inizialmente vengono polimerizzati tanti piccoli

frammenti di RNA che poi vengono immediatamente rimossi. Tali frammenti di RNA prendono per tanto il nome

di “Filamenti di RNA trascritti abortiti”. Una volta che sono stati rimossi questi frammenti, può avvenire la vera

e propria trascrizione del gene

FASE DI ALLUNGAMENTO ] in questa fase l'attività della RNA-polimerasi II è massima. Tale enzima quindi

polimerizza un lungo filamento di m-RNA complementare al filamento di DNA del gene. L'RNA-polimerasi II

però ogni tanto attua delle pause dovute a dei cambi di conformazione. Tali pause vengono risolte dai cosiddetti

“Fattori di allungamento”, detti anche “Proteine TFIIS”, che permettono di cambiare nuovamente la

conformazione della RNA-polimerasi II e riprendere l'azione polimerasica in maniera quasi immediata

FASE DI TERMINAZIONE ] il filamento di m-RNA viene trascritto fino a che ad un certo punto l'RNA-

polimerasi II sintetizza una particolare sequenza detta “sequenza segnale di poliadenilazione”, che forma a sua

volta una sorta di struttura a forcina. La struttura a forcina può determinare la terminazione della trascrizione

in due modi diversi:

la struttura a forcina viene riconosciuta da particolari fattori proteici che attivano una serie di

– endonucleasi che tagliano il filamento di m-RNA determinandone il distacco dalla RNA-polimerasi II e

la fine della trascrizione

la struttura a forcina induce direttamente un cambiamento conformazione della RNA-polimerasi II.

– Questo cambiamento conformazionale induce un distacco dell'enzima dal filamento di m-RNA e la fine

della trascrizione

FASE DI MATURAZIONE ] una volta che la RNA-polimerasi ha terminato la trascrizione del nuovo filamento

di m-RNA, quest'ultimo è ricco di punti di discontinuità, ovvero è formato da tratto brevi e codificanti detti

“Esoni” che si intervallano con tratti molto lunghi e non codificanti detti “Introni”.

Gli introni come abbiamo visto precedentemente nel riassunto, per ingombro sterico non possono passare

attraverso i pori nucleari e quindi devono essere tagliati, in maniera tale da permettere all'm-RNA trascritto di

passare attraverso i pori nucleari ed andare incontro a traduzione nei ribosomi. Il processo che porta alla

eliminazione degli introni è definito come “Maturazione dell'm-RNA” e si divide in tre fasi:

Capping: La prima fase è quella del “CAPPING” che consiste nella formazione, sull'estremità 5' del filamento di

m-RNA, di un cappuccio detto (CAP). Tale cappuccio è caratterizzato da un nucleotide guaninico metilato detto

“Metil-guanosina”, che si viene a formare tramite una serie di fasi rese possibili da determinati enzimi specifici

richiamati dalla CDT della RNA-polimerasi II. Vediamole in dettaglio:

Per prima cosa una fosfatasi rimuove un gruppo fosfato dall'estremità 5' del filamento di m-RNA

– Per seconda cosa una Guanil transferasi aggiunge una GMP (guanosin mono fosfato) sull'estremità 5'

– del filamento di m-RNA. La GMP viene aggiunta con un orientamento invertito, in modo tale che

l'estremità 5' dell'm-RNA si leghi alla catena di m-RNA stessa tramite un tipico legame 5' → 5',

formando difatto una sorta di cappuccio

Per terza cosa una Metil transferasi aggiunge un gruppi metilico al cappuccio precedentemente formato,

– andando a formare difatto il tipico cappuccio di Metil-guanosina

al termine di ciò arriva una proteina CBC che si lega al cappuccio

La formazione del cappuccio è importantissima i quanto permette all'estremità 5' del filamento di m-RNA di:

di non essere digerito da enzimi esonucleasici

– la proteina CBC del cappuccio permette al filamento di m-RNA di essere riconosciuto e trasportato

– attraverso i pori nucleari

infine il cappuccio è importante per il riconoscimento del filamento di m-RNA da parte del ribosoma per

– iniziare la traduzione

Poliadenilazione: La seconda fase è quella della “POLI-ADENILAZIONE”, che consiste nella formazione,

sull'estremità 3' del filamento di m-RNA, della cosiddetta “Coda di Poli-A”. Tale coda di Poli-A è polimerizzata a

partire dall'azione catalitica di un enzima specifico chiamato “Poli-A-polimerasi”, che non fa altro che

permettere la sintesi di una sequenza poliadenilica di 200 nucleotidi sull'estremità 3' del filamento di m-RNA.

Essa si forma attraverso un processo articolato da varie fasi, vediamole in dettaglio:

Inizialmente ci sono due proteine dette “CstF” e “CPSF” che riconoscono il segnale di poliadenilazione e

– si spostano verso l'estremità 3' del filamento di m-RNA

le CstF vengono distaccate grazie all'azione endonucleasica di alcune endonucleasi

– CPSF a questo punto richiama l'enzima Poli-A-polimerasi” sull'estremità 3' dell'm-RNA.

– La Poli-A-polimerasi si lega all'estremità 3' grazie al gruppo ossidrile libero, attraverso un legame di

condensazione

successivamente la Poli-A-polimerasi inizia a richiamare molte proteine che legano una dopo l'altra un

– serie di adenine, formando una lunga catena poliadenilica detta “Coda di poli-A”

arrivati alla duecentesima adenina, la Poli-A-polimerasi si stacca dall'm-RNA e la poliadenilazione è

– dunque terminata

Splicing: La terza fase quella dello “SPLICING”, che consiste nella eliminazione degli introni e nel successivo

legame fra i vari esoni rimasti. Al termine dello splicing quindi si viene a formare un m-RNA del tutto

codificante, formato dai soli “Esoni”. Tale processo è reso possibile da un complesso costituito da proteine (con

attività enzimatica) e frammenti di sn-RNA. Tale complesso prende il nome di “Spliceosoma”. Ed è composto da:

100 proteine enzimatiche complessate da frammenti di sn-RNA, chiamate “snRNP”

– 50 proteine enzimatiche non complessate da frammenti di sn-RNA, chiamate per questo “non-snRNP”

– 5 frammenti di sn-RNA fatti da 100-300 ribonucleotidi del tipo U1, U2, U3, U4, U5 e U6.

– Tali sn-RNA sono importanti perché permettano di riconoscere le estremità degli introni, in maniera tale

da posizionare lo spliceosoma correttamente.

Inoltre generalmente quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di

sn-RNA fatti per lo più da U1, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U1”.

Quando invece uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per

lo più da U2, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U2”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U3, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U3”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U4, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U4”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U4, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U4”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U5, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U5”.

Quando infine uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per

lo più da U6, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U6”.

Lo spliceosoma riconosce nello specifico tre porzioni dell'introne del filamento di m-RNA trascritto. Esse sono:

il sito di splicing 5', caratterizzato dalla sequenza GUAAGU

– il sito di splicing 3', caratterizzato dalla sequenza CAG

– il punto di ramificazione dell'introne, caratterizzato da un nucleotide adeninico (A)

Guardiamo come avviene in dettaglio il processo di splicing, che può essere diviso in tre gradi fasi:

prima e seconda reazione di trans-esterificazione

– azione dello spliceosoma

– ricongiungimento fra i vari esoni

Prima e seconda reazione di trans-esterificazione:

inizialmente avviene la prima reazione di trans-esterificazione. Tale reazione vede formarsi il legame fra

– l'OH legato al carbonio 2' del punto di ramificazione intronico ed il gruppo fosfato dell'estremità 5'

dell'introne. Questo legame porta alla rottura del legame fosfodiesterico tra il primo nucleotide

dell'introne e l'ultimo nucleotide dell'esone adiacente, formando la cosiddetta “Struttura a cappio”.

Successivamente avviene la seconda reazione di trans-esterificazione. In questa fase il gruppo OH in

– posizione 3' dell'esone induce la rottura del legame fosfodiesterico tra il primo nucleotide dell'introne e

l'ultimo nucleotide dell'esone

il risultato è che grazie alla prima reazione di trans-esterificazione viene tagliata la parte terminale

– dell'introne, mentre grazie alla seconda reazione di trans-esterificazione viene tagliata la parte iniziale

dell'introne. A seguito di ciò quindi l'introne può essere rimosso completamente

Azione dello spliceosoma:

la rimozione dell'introne è carico dello spliceosoma.

– Quello che succede è che lo spliceosoma riconosce nello specifico tre porzioni ad esso complementari

dell'introne prim'anzi tagliato. Esse sono:

- il sito di splicing 5', caratterizzato dalla sequenza GUAAGU

- il sito di splicing 3', caratterizzato dalla sequenza CAG

- il punto di ramificazione dell'introne, caratterizzato da un nucleotide adeninico (A)

inizialmente l'adenina del punto di ramificazione si lega alla proteina BBP che induce il legame dello

– spliceosoma U1 a livello dell'estremità 5' dell'introne.

Dopo di che anche il secondo spliceosoma U2 si lega sempre all'adenina del punto di ramificazione

– poi arrivano anche gli spliceosomi U4, U5 e U6 che si legano fra loro formando una sorta di trimero.

– Anche tale trimero si lega all'adenina del punto di ramificazione. Nel momento esatto in cui il trimero si

lega al punto di ramificazione, vi è un cambio conformazionale che permette l'uscita degli spliceosomi

U1, U2 e U4. Solo gli spliceosomi U2, U5 e U6 rimangono adesi al punto di ramificazione, determinando

cosi la rottura dei legami fosfodiesterici terminali. Con ciò vi è il distacco fisico della parte terminale e

della parte iniziale dell'introne

ricordo che il maggior protagonista della rottura dei legami fosfodiesterici è lo spliceosoma U6, il quale

– funge da ribozima, un enzima in grado di degradare il legame fosfodiesterico che intercorre fra i vari

ribonucleotidi. Mentre invece lo spliceosoma U4 non è un caso che inizialmente sia associato ad U6 e poi

venga allontanato. Infatti esso funge da inibitore per U6. Quando U4 e U6 sono assieme lo spliceosoma è

inattivo. Quando U4 e U6 sono separati, U6 può attuare la sua funzione enzimatica

Ricongiungimento fra i vari esoni:

al momento in cui è stato eliminato l'introne, gli esoni adiacenti vengono riuniti fra loro, attraverso una

– proteina specifica chiamata “EJT” (complesso di giunzione esonico). Quello che succede è che le

proteine EJT riconoscono le proteine SR (che a loro volta marcano le estremità dei vari esoni post-

splicing. Una volta riconosciute iniziano a catalizzare la reazione di formazione dei vari legami

fosfodiesterici fra i vari nucleotidi dei tratti iniziali e terminali degli esoni, permettendo cosi la

formazione finale di un filamento di m-RNA maturo, completamente caratterizzato da esoni!!

Splicing alternativo: è un processo che porta alla formazione di differenti m-RNA maturi a partire da uno stesso

filamento di m-RNA ancora immaturo. Tali m-RNA maturi successivamente una volta tradotti daranno vita a

proteine isoformi, ma non identiche. Lo splicing alternativo caratterizza circa il 75% dei geni umani, ed è molto

importante per il nostro organismo. Ad esempio i nostri muscoli necessitano di diversi tipi di troponine

(proteine), in base a che debbano svolgere la loro funzione all'interno dei muscoli lisci o striati. La sintesi delle

troponine è strettamente endogena, infatti vengono prodotte direttamente dal nostro organismo. Vediamo come:

alcuni geni specifici vanno incontro a trascrizione formando m-RNA

– l'm-RNA trascritto va al Capping e alla Poliadenilazione

– successivamente invece di andare incontro al classico splicing, subisce uno splicing alternativo.

– In pratica il filamento di m-RNA non viene solo privato degli introni grazie allo spliceosoma, ma alla fine

del processo di maturazione si formano due o più filamenti di m-RNA maturi

i filamenti di m-RNA maturi vanno incontro a traduzione, formando difatto troponine isoformi, ma non

– identiche. Alcune di queste troponine andranno nel tessuto liscio, altre nel tessuto striato

Alcune modalità per la quale avviene lo splicing alternativo possono essere:

il caso in cui durante lo splicing, lo spliceosoma non riconosce un esone fra due introni e quindi

– considera tutto un grande introne, e lo taglia. Dopo di che gli esoni rimasti vengono legati fra loro ed il

filamento di m-RNA maturo ottenuto sarà privo dell'esone eliminato.

L'esone prende il nome di “Esone saltato”

il caso in cui durante lo splicing lo spliceosoma non riconosce un introne fra due esoni e quindi considera

– tutto un grande esone. Il filamento di -RNA maturo ottenuto sarà quindi caratterizzato da due esoni

intervallati da un lungo introne. Tale frammento prende il nome di “Introne mantenuto”

il caso in cui durante lo splicing, parte di un introne viene considerato esone, e di conseguenza

– quest'ultimo viene integrato nel filamento m-RNA. In tal caso parliamo quindi di “Esone esteso”

Un esempio di mal funzionamento dello splicing lo si ha anche nel caso della “Talassemia”, una malattia

dell'uomo dovuta al fatto che determinate specifiche proteine vengono prodotte in piccole quantità.

Un esempio di Talassemia è la “β-Talassemia”, una malattia che causa una ridotta produzione di emoglobina.

La ridotta produzione di emoglobina comporta successivamente anemia.

La β-Talassemia è dovuta ad una mutazione che impedisce il corretto funzionamento dello splicing.

Nello specifico durante la maturazione dell'm-RNA avviene una mutazione che annulla il confine fra alcuni esoni

e gli introni e di conseguenza gli introni vengono riconosciuti come esoni senza essere rimossi dal filamento di

m-RNA. Successivamente il filamento m-RNA va incontro a traduzione formando delle proteine imperfette che

non possono formare correttamente le catene-β dell'emoglobina. Il risultato finale si traduce in una riduzione

della quantità di emoglobina prodotta dal nostro organismo, che si traduce in anemia.

Editing: esiste un altro processo che alcuni determinati filamenti di m-RNA possono subire, esso è l'EDITING.

Esso è quel processo grazie al quale si ottiene un alterazione genica nel filamento di m-RNA.

Ad esempio alcuni Editing sono la deaminazione di un adenina o di una citosina che compongono il filamento di

m-RNA, le quali vanno a formare rispettivamente l'inosina e l'uracile. Vediamo rispettivamente come avvengono

nel dettaglio i due processi:

l'adenina viene inizialmente riconosciuta da un enzima specifico chiamato “ADAR”.

– Tale enzima si lega a livello della forcina ed elimina un gruppo amminico (NH3) dell'adenina,

trasformandola difatto in inosina!

la citosina viene riconosciuta da determinati enzimi. Tali enzimi si legano al frammento di m-RNA ed

– eliminano un gruppo amminico (NH3) dalla citosina, trasformandola difatto in uracile!

Generalmente la maggior parte dei frammenti di m-RNA alterati che vengono formati a seguito del processo di

Editing, vengono degradati nel nucleo cellulare, grazie ad un complesso proteico che prende il nome di “Esosoma

nucleare”. Tale complesso permette di scindere i frammenti di m-RNA alterati in tanti singoli nucleotidi che

possono anche essere riutilizzati dalla cellula. L'esosoma nucleare distingue i frammenti di m-RNA alterati da

quelli non alterati grazie al fatto che nei frammenti di m-RNA alterati non vi è la presenza di proteine come la

CBC, SR ,EJC, recettori ed altri proteine specifiche. Per tanto ogni qual volte che l'esosoma non riconosce la

presenza di queste proteine sa che che il filamento di m-RNA è alterato e deve per tanto smaltirlo!!

FASE DI ESPORTAZIONE ] il filamento di m-RNA è quindi andato incontro a Capping, Poliadenilazione e

splicing (oppure splicing alternativo o editing). Una volta che il filamento di m-RNA ha subito tutti questi

processi, esso viene quindi maturato, formando un filamento di m-RNA maturo. La cellula riesce a percepire che

il filamento di m-RNA è maturo grazie alla presenza su di esso di alcune proteine specifiche come:

proteine che si legano alle giunzioni “esone-esone”, che fanno capire alla cellula che non c'è la presenza

– di introni e che lo splicing è avvenuto correttamente

proteine che si legano alla coda di poli-A, indicando che la poliadenilazione è avvenuta correttamente

– proteine che si legano al cappuccio (CAP), indicando che il Capping è avvenuto correttamente

Una volta che la cellula ha capito che il filamento di m-RNA è maturo, attraverso alcuni recettori di trasporto

nucleare, vengono aperti i pori nucleari e gli m-RNA maturi decorrono in essi ed arrivano quindi a contatto

diretto coi ribosomi nel citoplasma!!

LA SINTESI PROTEICA (fase di traduzione)

Differenze fra traduzione negli eucarioti e nei procarioti ] Al momento in cui il filamento di m-RNA è andato in

contro a maturazione, può andare incontro successivamente a traduzione:

nel caso dei procarioti non essendoci il nucleo, il filamento di m-RNA trascritto maturo viene

– immediatamente riconosciuto dai ribosomi e avviene la traduzione. Infatti parliamo non a caso di

processo di “Trascrizione-traduzione”. Inoltre nei

nel caso degli eucarioti essendoci il nucleo, il filamento di m-RNA trascritto maturo passa attraverso i

– pori nucleari e raggiunge i ribosomi dove avviene la traduzione. L'arco di tempo che intervalla la

trascrizione dalla traduzione è notevolmente maggiore rispetto a quello dei procarioti proprio per questo

motivo

Un altra differenze sta nel fatto che:

i geni dei procarioti sono “Policistronici”, ossia codificano per la formazione di molte catene

– polipeptidiche contemporaneamente [ Gene → traduzione → molte catene polipeptidiche ]

i geni degli eucarioti sono “Monocitronici”, ossia codificano per la formazione di una singola catena

– polipeptidica soltanto [ Gene → traduzione → una sola catena polipeptidica ]

Analogie fra traduzione negli eucarioti e nei procarioti ] le analogie sono:

la direzione in cui avviene la traduzione del filamento di m-RNA è 5'P → 3'OH

– una volta che è avvenuta la sintesi degli amminoacidi, quest'ultimi di legano a partire dall'estremità N-

– terminale all'estremità C-terminale, formando lunghe catene polipeptidiche che formeranno a loro volta

le proteine tridimensionali

durante la traduzione è possibile anche che più ribosomi contemporaneamente possono legarsi allo

– stesso filamento di m-RNA, formando cosi una struttura chiamata “Polisoma” o “Poliribosoma”.

Il polisoma è sicuramente una struttura più efficace, poiché si ha la sintesi contemporanea di più copie

della stessa proteina a partire dal solito filamento di m-RNA

I più importanti componenti della fase di traduzione ] I maggiori componenti della traduzione sono:

ribosoma

– t-RNA

– fattori traduzionali

– m-RNA

RIBOSOMA ] Una volta che il filamento di m-RNA è giunto nel citoplasma, viene quindi riconosciuto dai

ribosomi, degli organuli fondamentali alla vita, che permettano difatti di tradurre un filamento maturo di

m-RNA in amminoacidi, a loro volta implicati nella sintesi di proteine funzionalmente attive a livello cellulare.

Ogni ribosoma è caratterizzato da due subunità, formate a loro volta da r-RNA e proteine ribosomiali:

una subunità è detta “Maggiore” poiché è caratterizzata da dimensioni e un peso molecolare più grande.

– L'unità di misura del peso delle subunità proteiche del ribosoma è lo “Sweberg” (S) che è proporzionale

al peso molecolare della subunità

una subunità è detta “Minore” poiché è caratterizzata da dimensioni e un peso molecolare più piccolo.

– L'unità di misura del peso delle subunità proteiche del ribosoma è lo “Sweberg” (S) che è proporzionale

al peso molecolare della subunità

Ricordo che le subunità maggiore e minore del ribosoma rimangano separate e libere nel citoplasma, fino a che

non inizia la traduzione. Al momento in cui inizia la traduzione le due subunità si assemblano e formano la

struttura del ribosoma completa. Nella subunità minore è presente un solco, cosiddetto “Solco ribosomiale”,

attraverso cui scorre il filamento di mRNA che viene pian piano tradotto in amminoacidi

Un'altra particolarità dei ribosomi è quella che i ribosomi delle cellule procariote sono più piccoli rispetto a

quelli presenti nelle cellule eucariote. Questo deriva dal fatto che le cellule eucariote hanno ribosomi

caratterizzati da una subunità minore e una subunità maggiore

molto più grandi rispetto a quelle che compongono un ribosoma procariote. Infatti:

i ribosomi della cellula procariote sono caratterizzati da una massa di circa 2700 Kdalton, un diametro

– di 20 nanometri ed un coefficiente di sedimentazione di 70 Sweberg.

La subunità minore è formata da 21 proteine ribosomiali ed una molecola di r-RNA

La subunità maggiore è formata da 34 proteine ribosomiali e due molecole di r-RNA

i ribosomi della cellula eucariote sono caratterizzati da una massa di circa 4000 Kdalton, un diametro di

– 23 nanometri ed un coefficiente di sedimentazione di 80 Sweberg.

La subunità minore è formata da 33 proteine ribosomiali ed una molecola di r-RNA

La subunità maggiore è formata da 47 proteine ribosomiali e tre molecole di r-RNA

Ciascun ribosoma abbiamo visto che è strutturalmente caratterizzato da una subunità maggiore ed una subunità

minore. La subunità minore è la funzione di riconoscere a legarsi al filamento di m-RNA maturo. La subunità

maggiore ha la funzione di tradurre il filamento di m-RNA maturo in amminoacidi.

Ogni subunità maggiore è caratterizzata da:

Sito A, detto anche “Sito amminoacidico” è quella regione della subunità maggiore dove i t-RNA carichi

– dei loro amminoacidi, si attaccano al filamento di m-RNA maturo

Sito P, detto anche “Sito peptidico” è quella regione della subunità maggiore dove i t-RNA rilasciano i

– loro amminoacidi

Sito E, detto anche “Sito Exit” (sito di uscita) è quella regione della subunità maggiore dove i t-RNA

– scarichi (privi dei loro amminoacidi), si staccano dal filamento di m-RNA maturo

t-RNA ] RIVEDERE PAGINA 28!!! RIPROPONGO LA STRUTTURA DEL t-RNA nell'immagine sottostante:

m-RNA ] RIVEDERE PAGINA 28!!! Una caratteristica fondamentale è quella di possedere una sequenza

particolare detta “Sequenza ORF” (Open Reading Frame). Tale sequenza comprende un codone di inizio “AUG”

che codifica per metionina, ed uno dei tre codoni di stop (UAA; UAG; UGA). Queste parti sono fondamentali in

quanto identificano precisamente il punto di inizio della traduzione e il punto terminale di quest'ultima!!

Fattori traduzionali ] sono proteine specifiche che permettano la traduzione. Alcuni di essi si ritrovano sia nei

procarioti che negli eucarioti, mentre altri sono differenti.

TRADUZIONE NEI PROCARIOTI

Il processo di traduzione nei procarioti è caratterizzato dalle stesse identiche fasi della traduzione negli eucarioti.

Esse sono:

Attivazione e caricamento dell'amminoacido sul t-RNA

– fase di inizio

– fase di allungamento

– fase di terminazione

FASE DI ATTIVAZIONE E CARICAMENTO DELL'AMMINOACIDO SUL t-RNA ] Nei procarioti il processo

di traduzione prende il nome di “Traduzione Cotrascrizionale”, ad indicare il fatto che immediatamente dopo il

termine della trascrizione, parte la traduzione. La prima cosa che accade all'inizio di ogni traduzione è che il

t-RNA dev'essere attivato. Il t-RNA è attivo quando è legato ad un amminoacido. Fondamentalmente quindi:

t-RNA da solo → forma inattiva

– t-RNA associato all'amminoacido → amminoacil-tRNA → forma attiva

L'attivazione dell'amminoacido è resa possibile da un enzima specifico chiamato “t-RNA sintetasi”.

Di tale enzima ce ne sono circa 20, tutti diversi fra loro. Il numero 20 non è una casualità, infatti ogni t-RNA

sintetasi è specifica per un determinato amminoacido. Ci sarà quindi un t-RNA sintetasi per la serina, una per la

lisina, una per il triptofano, una per l'arginina e cosi via quant'altro per tutti gli altri amminoacidi..

La funzione di questi enzimi è quella di riconoscere due siti del t-RNA, che sono lo Stelo accettore e l'ansa

dell'anticodone. Una volta riconosciuti legano al t-RNA l'amminoacido corrispondente.

Attivazione e caricamento dell'amminoacido sul t-RNA : la t-RNA sintetasi inizialmente sfrutta l'idrolisi di una

molecola di ATP, per attivare un determinato amminoacido. In pratica quello che succede è che:

l'ATP va incontro alla reazione [ ATP → AMP + 2 Pi ]

– arriva l'amminoacido e la t-RNA sintetasi lega un AMP al gruppo carbossilico dell'amminoacido

– (estremità C-terminale), attraverso un legame fosfoanidrinico ad alta energia. Si forma quindi un

amminoacido adenilato

a questo punto il gruppo carbossilico dell'amminoacido adenilato, interagisce con l'estremità 3' dello

– stelo accettore del t-RNA, attraverso un legame acilico, altamente energetico. In questa maniera viene

indotto il rilascio della molecola di AMP e si forma l'amminoacil-tRNA (forma attiva del t-RNA)

alla fine la t-RNA sintetasi attraverso la propria attività di Proof reading (rilettura) riesce a percepire se

– la traduzione è andata a buon fine o meno. In caso di errori o mal funzionamenti verranno poi stimolate

altre molecole proteiche per riadattare il processo affinché tutto vada come deva andare

FASE DI INIZIO ] Inizialmente vengono prodotte delle proteine particolari detti “Fattori traduzionali della fase

di inizio”, o generalmente chiamate anche “IF” (Initiating Factor). Tali proteine sono 3, ed hanno delle funzioni

precise: IF1 occupa il sito A della subunità maggiore del ribosoma, in modo che il primo t-RNA che porta la

– formil-metionina sia costretto a legarsi al sito P

IF3 serve ad impedire in un primo momento l'arrivo della subunità maggiore

– IF2 è una GTPasi che attraverso l'energia prodotta dalle GTP, si occupa di posizionare il primo t-RNA

– legato alla formil-metionina, all'interno del sito P. In questo modo la subunità maggiore può legarsi al

complesso “mRNA-subunità minore-tRNA”

Successivamente inizia la vera e propria fase iniziale della traduzione:

per prima cosa nell'estremità 5' del filamento di m-RNA trascritto, abbiamo una sequenza consenso

– chiamata “ORF” o in questo caso “Sequenza Shine-Delgarno”. Tale sequenza si trova a 25 nucleotidi

dalla sequenza di inizio della traduzione, ed è una sequenza ricca di purine perfettamente

complementare ad una sequenza di pirimidine presente sul filamento di r-RNA 16s della subunità

minore del ribosoma. Attraverso una serie di legami covalenti la sequenza shine-delgarno del filamento

di m-RNA si lega quindi alla subunità minore del ribosoma. Ciò è reso possibile anche grazie alla

proteina IF3 che, come abbiamo visto precedentemente, impedisce alla subunità maggiore di legarsi

prima della subunità minore del ribosoma

una volta che è avvenuto il legame fra m-RNA e ribosoma, il filamento di m-RNA scorre fra le due

– subunità fino a che non viene letto il primo codone AUG (codone di avvio)

A questo punto interviene uno specifico t-RNA detto “t-RNA iniziatore” che si lega al codone di avvio

– “AUG”, tramite il suo anticodone complementare “CAU”, attraverso legami covalenti

una volta che è avvenuto il legame fra l'anticodone del t-RNA e il codone di avvio dell'm-RNA, inizia la

– traduzione. Il codone AUG che generalmente codifica per una metionina, nei procarioti viene tradotto in

una metionina formilata (formil-metionina). Infatti il gruppo formile viene aggiunto al gruppo

amminico della metionina, per evitare che la metionina stessa possa reagire con altri gruppi radicalici.

Abbiamo quindi il t-RNA legato alla formil-metionina (formil-metionin-tRNA)

a questo punto vengono attivate altre due proteine, le IF1 e le IF2. La IF1 permette alla formil-metionin-

– tRNA di legarsi al sito P della subunità maggiore del ribosoma. La IF2 permette di posizionare

correttamente la formil-metionin-tRNA sul sito P della subunità maggiore del ribosoma.

A questo punto si ha che la subunità maggiore del ribosoma è legata alla formil-metionin-tRNA che è

legata a sua volta alla subunità minore del ribosoma. Il risultato finale è che le due subunità del

ribosoma si uniscono e nel mezzo, vi è un solco in cui scorre il filamento di m-RNA

FASE DI ALLUNGAMENTO ] dopo che è stato tradotto il primo amminoacido (la formil-metionina), a questo

punto interviene una proteina specifica denominata “Fattore di allungamento TU”. Questa proteina presenta

una molecola energetica di GTP o GDP:

quando il fattore TU è legato ad una molecola di GTP è in forma attiva

– quando il fattore TU è legato ad una molecola di GDP è in forma inattiva

Quello che succede è che nella prima parte della fase di allungamento:

il filamento di m-RNA scorre nel solco ribosomiale. Ogni tre nucleotidi del filamento di m-RNA (detti

– anche tripletta o codone) che scorrono nel solco, vanno ad essere legati al corrispettivo anticodone di una

molecola di t-RNA.

Ricordo che due codoni che codificano per lo stesso amminoacido, possono essere riconosciuti dallo

stesso t-RNA, come ci suggerisce l'ipotesi del “Vacillamento della terza base”. Infatti generalmente i

requisiti sterici tra l'anticodone e il codone sono molto forti nelle prime due posizioni e molto più

flessibili nella terza posizione. [ Per capire meglio guardiamo le due immagini nella pagina successiva ]

a questo punto il codone codifica per un determinato amminoacido specifico che viene legato da un

– t-RNA, e si viene a formare un amminoacil-tRNA. Il fattore TU attivo, riconosce e si lega

all'amminoacil-tRNA e lo posiziona nel sito A del ribosoma

una volta posizionato, a questo punto la molecola di GTP del fattore TU viene idrolizzata in GDP e perde

– un gruppo fosfato. Questa reazione induce la inattivazione del fattore TU che si stacca dal sito A.

[ fattore TU + GTP → fattore TU +GDP + Pi ].

per far si che questo meccanismo si possa ripetere per ogni t-RNA, il fattore TU deve continuamente

– riattivarsi, ovvero rilasciare GDP ed acquisire GTP. Per far ciò interviene un altro fattore proteico

chiamato “Fattore TS”. Il fattore TS si lega a fattore TU inattivo inducendo il distacco della GDP.

A questo punto una molecola di GTP si lega al fattore TU, attivandolo e contemporaneamente induce

anche il distacco del fattore TS dal fattore TU attivo. Il fattore TS tornerà a rifare la solita cosa con altri

fattori TU inattivi, mentre il fattore TU attivo sarà pronto a riposizionare altri amminoacil-tRNA nel

sito A del ribosoma!!

Nella seconda parte della fase di allungamento:

dopo che il fattore TU ha posizionato l'amminoacil-tRNA nel sito A del ribosoma, viene idrolizzato il

– legame che lega l'amminoacido al t-RNA. Questo porta al fatto che l'amminoacido viene rilasciato nel

sito P

contemporaneamente arriva un altro amminoacil-tRNA e succederà la stessa cosa. Nel sito P del

– ribosoma quindi i vari amminoacidi inizieranno a legarsi assieme fra loro attraverso dei veri e propri

legami peptidici formando delle corte catene polipeptidiche

a questo punto intervengono in sinergia due proteine: una traslocasi e il fattore EFG (una GTPasi).

– Esse permettono di far scorrere il ribosoma sul filamento di m-RNA, in modo tale che:

- il t-RNA che è stato idrolizzato dal rispettivo amminoacido (t-RNA scarico) possa passare dal sito P al

sito E ed essere espulso dal ribosoma

- l'amminoacil-tRNA che arriva con un nuovo amminoacido (t-RNA carico) possa passare dal sito A al

sito P e scaricare il proprio amminoacido!!

alla fine vediamo che quindi la catena polipeptidica si allunga sempre di più fino ad arrivare ad un

– punto di terminazione!!

FASE DI TERMINAZIONE ] abbiamo visto che nella fase di allungamento il filamento di m-RNA scorre nel

solco ribosomiale ed ogni tre nucleotidi del filamento di m-RNA (detti anche tripletta o codone) si legano al

corrispettivo anticodone di una molecola di t-RNA. A questo punto il codone codifica per un determinato

amminoacido specifico e si viene a formare un amminoacil-tRNA. Il fattore TU attivo, riconosce e si lega

all'amminoacil-tRNA e lo posiziona nel sito A del ribosoma. Questa cosa si ripete sempre fino a che i tre

nucleotidi (codone) del filamento di m-RNA non possono legarsi al corrispettivo anticodone, perché quest'ultimo

non esiste. Siamo arrivati al cosiddetto “Codone di stop” o “Codone di terminazione”.

A questo punto il codone di stop viene riconosciuto dai cosiddetti “Fattori RF” (Releasing Factor), che sono due,

RF1 e RF2. I fattori RF sono molto simili strutturalmente al t-RNA, infatti queste proteine si legano al sito A e lo

occupano. Una volta occupato il sito A, questi fattori inducono il rilascio della catena polipeptidica fuori dal

ribosoma. A questo punto intervengono altri due fattori detti “EF-G” e “RRF” che si occupano di smantellare il

complesso traduzionale mettendo fine al processo di traduzione!!

TRADUZIONE NEGLI EUCARIOTI

Il processo di traduzione negli eucarioti è caratterizzato dalle stesse identiche fasi della traduzione nei procarioti.

Queste fasi sono:

Attivazione e caricamento dell'amminoacido sul t-RNA

– fase di inizio

– fase di allungamento

– fase di terminazione

FASE DI ATTIVAZIONE E CARICAMENTO DELL'AMMINOACIDO SUL t-RNA ] Nei procarioti il processo

di traduzione prende il nome di “Traduzione Cotrascrizionale”, ad indicare il fatto che immediatamente dopo il

termine della trascrizione, parte la traduzione. La prima cosa che accade all'inizio di ogni traduzione è che il

t-RNA dev'essere attivato. Il t-RNA è attivo quando è legato ad un amminoacido. Fondamentalmente quindi:

t-RNA da solo → forma inattiva

– t-RNA associato all'amminoacido → amminoacil-tRNA → forma attiva

L'attivazione dell'amminoacido è resa possibile da un enzima specifico chiamato “t-RNA sintetasi”.

Di tale enzima ce ne sono circa 20, tutti diversi fra loro. Il numero 20 non è una casualità, infatti ogni t-RNA

sintetasi è specifica per un determinato amminoacido. Ci sarà quindi un t-RNA sintetasi per la serina, una per la

lisina, una per il triptofano, una per l'arginina e cosi via quant'altro per tutti gli altri amminoacidi..

La funzione di questi enzimi è quella di riconoscere due siti del t-RNA, che sono lo Stelo accettore e l'ansa

dell'anticodone. Una volta riconosciuti legano al t-RNA l'amminoacido corrispondente.

Attivazione e caricamento dell'amminoacido sul t-RNA : la t-RNA sintetasi inizialmente sfrutta l'idrolisi di una

molecola di ATP, per attivare un determinato amminoacido. In pratica quello che succede è che:

l'ATP va incontro alla reazione [ ATP → AMP + 2 Pi ]

– arriva l'amminoacido e la t-RNA sintetasi lega un AMP al gruppo carbossilico dell'amminoacido

– (estremità C-terminale), attraverso un legame fosfoanidrinico ad alta energia. Si forma quindi un

amminoacido adenilato

a questo punto il gruppo carbossilico dell'amminoacido adenilato, interagisce con l'estremità 3' dello

– stelo accettore del t-RNA, attraverso un legame acilico, altamente energetico. In questa maniera viene

indotto il rilascio della molecola di AMP e si forma l'amminoacil-tRNA (forma attiva del t-RNA)

alla fine la t-RNA sintetasi attraverso la propria attività di Proof reading (rilettura) riesce a percepire se

– la traduzione è andata a buon fine o meno. In caso di errori o mal funzionamenti verranno poi stimolate

altre molecole proteiche per riadattare il processo affinché tutto vada come deva andare

FASE DI INIZIO ] inizialmente vengono prodotte delle proteine dette “Fattori traduzionali della fase di inizio”,

chiamate anche “eIF” (Eucariotic Initiating Factor). Tali proteine sono 8, ed hanno delle funzioni precise:

eIF1, eIF3 e eIF5 si legano al sito E del ribosoma preparandola strutturalmente a legarsi con l'm-RNA

– eIF1A si lega al sito A obbligando il t-RNA a legarsi al sito P

– eIF2 è una GTPasi che attraverso l'energia prodotta dalle GTP, si occupa di posizionare il primo t-RNA

– legato alla metionina, all'interno del sito P. In questo modo la subunità maggiore può legarsi al

complesso “mRNA-subunità minore-tRNA”

eIF4E riconosce e si lega al cappuccio dell'm-RNA maturo

– eIF4G si lega ad eIF4E

– eIF4A si lega ad eIF4G e funge da ligasi, sciogliendo la struttura a forcina formatosi nella fase di

– terminazione della trascrizione

Successivamente inizia la vera e propria fase iniziale della traduzione:

per prima cosa i fattori eIF1, eIF3 e eIF5 si legano al ribosoma preparandolo strutturalmente

– a legarsi con l'm-RNA

successivamente dev'essere riconosciuto il tratto iniziale dell'm-RNA (cappuccio) e il tratto terminale

– dell'm-RNA (coda di poli-A). Questo è reso possibile dal fattore eIF4E (riconosce il cappuccio) e i fattori

eIF4G e eIF4A (riconoscono la parte terminale)

Una volta riconosciute le parti iniziali e terminali del filamento di m-RNA maturo, si procede all'inizio

– della sua traduzione. Per prima cosa in una regione non molto lontana dal cappuccio, nell'estremità 5'

del filamento di m-RNA trascritto, abbiamo una sequenza consenso chiamata “ORF” o in questo caso

“Sequenza Kozac”. Tale sequenza è caratterizzata dall'essere complementare ad una sequenza presente

sul filamento di r-RNA 16s della subunità minore del ribosoma. Attraverso una serie di legami covalenti

e i vari fattori proteici prim'anzi citati, la sequenza Kozac del filamento di m-RNA si lega quindi alla

subunità minore del ribosoma

una volta che è avvenuto avvenuto il legame fra m-RNA e ribosoma, il filamento di m-RNA scorre fra le

– due subunità fino a che non viene letto il primo codone AUG che codifica per una metionina.

A questo punto interviene uno specifico t-RNA detto “t-RNA iniziatore” che si lega al codone di avvio

“AUG”, tramite il suo anticodone complementare “CAU”, attraverso legami covalenti

una volta che è avvenuto il legame fra l'anticodone del t-RNA e il codone di avvio dell'm-RNA, inizia la

– traduzione. Abbiamo quindi il t-RNA legato alla metionina (metionin-tRNA)

a questo punto vengono attivate altre due proteine, le eIF1A e le eIF2. La eIF1A permette alla

– metionin-tRNA di legarsi al sito P della subunità maggiore del ribosoma. La eIF2 permette di

posizionare correttamente la metionin-tRNA sul sito P della subunità maggiore del ribosoma.

A questo punto si ha che la subunità maggiore del ribosoma è legata alla metionin-tRNA che è legata a

sua volta alla subunità minore del ribosoma. Il risultato finale è che le due subunità del ribosoma si

uniscono e nel mezzo, vi è un solco in cui scorre il filamento di m-RNA

FASE DI ALLUNGAMENTO ] dopo che è stato tradotto il primo amminoacido (la metionina), a questo punto

interviene una proteina specifica denominata “Fattore di allungamento eEF1A”. Questa proteina presenta una

molecola energetica di GTP o GDP:

quando il fattore eEF1A è legato ad una molecola di GTP è in forma attiva

– quando il fattore eEF1A è legato ad una molecola di GDP è in forma inattiva

Quello che succede è che nella prima parte della fase di allungamento:

il filamento di m-RNA scorre nel solco ribosomiale. Ogni tre nucleotidi del filamento di m-RNA (detti

– anche tripletta o codone) che scorrono nel solco, vanno ad essere legati al corrispettivo anticodone di una

molecola di t-RNA.

Ricordo che due codoni che codificano per lo stesso amminoacido, possono essere riconosciuti dallo

stesso t-RNA, come ci suggerisce l'ipotesi del “Vacillamento della terza base”. Infatti generalmente i

requisiti sterici tra l'anticodone e il codone sono molto forti nelle prime due posizioni e molto più

flessibili nella terza posizione. [ Per capire meglio guardiamo le due immagini nella pagina successiva ]

a questo punto il codone codifica per un determinato amminoacido specifico che si lega al t-RNA, e si

– viene a formare un amminoacil-tRNA. Il fattore eEF1A attivo, riconosce e si lega all'amminoacil-tRNA e

lo posiziona nel sito A del ribosoma

una volta posizionato, la molecola di GTP del fattore eEF1A viene idrolizzata in GDP e perde un gruppo

– fosfato. Questa reazione induce la inattivazione del fattore eEF1A che si stacca dal sito A.

[ fattore eEF1A + GTP → fattore eEF1A +GDP + Pi ].

per far si che questo meccanismo si possa ripetere per ogni t-RNA, il fattore eEF1A deve continuamente

– riattivarsi, ovvero rilasciare GDP ed acquisire GTP. Per far ciò interviene un altro fattore proteico

chiamato “Fattore EF-TS”. Il fattore EF-TS si lega a fattore eEF1A inattivo inducendo il distacco della

GDP. A questo punto una molecola di GTP si lega al fattore eEF1A, attivandolo e contemporaneamente

induce anche il distacco del fattore EF-TS dal fattore eEF1A attivo. Il fattore EF-TS tornerà a rifare la

solita cosa con altri fattori eEF1A inattivi, mentre il fattore eEF1A attivo sarà pronto a riposizionare

altri amminoacil-tRNA nel sito A del ribosoma!!

Nella seconda parte della fase di allungamento:

dopo che il fattore eEF1A ha posizionato l'amminoacil-tRNA nel sito A del ribosoma, viene idrolizzato il

– legame che lega l'amminoacido al t-RNA. Questo porta al fatto che l'amminoacido viene rilasciato nel

sito P

contemporaneamente arriva un altro amminoacil-tRNA e succederà la stessa cosa. Nel sito P del

– ribosoma quindi i vari amminoacidi inizieranno a legarsi assieme fra loro attraverso dei veri e propri

legami peptidici formando delle corte catene polipeptidiche

a questo punto intervengono in sinergia due proteine: una traslocasi e il fattore EFG (una GTPasi).

– Esse permettono di far scorrere il ribosoma sul filamento di m-RNA, in modo tale che possono avvenire

contemporaneamente due cose:

- il t-RNA che è stato idrolizzato dal rispettivo amminoacido (t-RNA scarico) possa passare dal sito P al

sito E ed essere espulso dal ribosoma

- l'amminoacil-tRNA che arriva con un nuovo amminoacido (t-RNA carico) possa passare dal sito A al

sito P e scaricare il proprio amminoacido!!

alla fine vediamo che quindi la catena polipeptidica si allunga sempre di più fino ad arrivare ad un

– punto di terminazione!!

FASE DI TERMINAZIONE ] abbiamo visto che nella fase di allungamento il filamento di m-RNA scorre nel

solco ribosomiale ed ogni tre nucleotidi del filamento di m-RNA (detti anche tripletta o codone) si legano al

corrispettivo anticodone di una molecola di t-RNA. A questo punto il codone codifica per un determinato

amminoacido specifico e si viene a formare un amminoacil-tRNA. Il fattore eEF1A attivo, riconosce e si lega

all'amminoacil-tRNA e lo posiziona nel sito A del ribosoma. Questa cosa si ripete sempre fino a che i tre

nucleotidi (codone) del filamento di m-RNA non possono legarsi al corrispettivo anticodone, perché quest'ultimo

non esiste. Siamo arrivati al cosiddetto “Codone di stop” o “Codone di terminazione”.

A questo punto il codone di stop viene riconosciuto dal cosiddetto “Fattori eRF” (Eucariotic Releasing Factor),

che è “eRF1”. Il fattore eRF1 è molto simile strutturalmente al t-RNA, infatti questa proteina si lega al sito A e lo

occupa. Una volta occupato il sito A, questo fattore induce il rilascio della catena polipeptidica fuori dal

ribosoma. A questo punto intervengono altri fattori proteici che si occupano di smantellare il complesso

traduzionale mettendo fine al processo di traduzione!!

CURIOSITA' (1): Ci sono dei farmaci in grado di bloccare la trascrizione o la traduzione. Alcuni esempi sono:

la “Puromicina”, che blocca la traduzione legandosi al ribosoma attraverso una sorta di “Mimetismo

– molecolare”

la “Cicloesimidesi”, che blocca la traduzione, fungendo da veleno per le cellule

CURIOSITA' (2): sia nei procarioti che negli eucarioti ci sono alcuni amminoacidi particolari come la

“Selenocisteina” (presenti in entrambi) e la “Pirrolisina” (presente solo nei procarioti) che vengono codificati a

partire da codoni di stop. Ad esempio la selenocisteina è un amminoacido codificato a partire dal codone UGA di

terminazione, mentre la pirrolisina è un amminoacido codificato a partire dal codone UAG di terminazione. Una

Una domanda che sorge spontanea è: com'è possibile tutto questo??.. Facciamo l'esempio della selenocisteina:

In poche parole questi codone di terminazione non sono letti come tale poiché sono inseriti in prossimità o dentro

alcune strutture a forcina dell'm-RNA. Per tanto questo codone codifica per un determinato amminoacido che

andrà ad allungare la catena polipeptidica.

In poche parole la selenocisteina presenta un vero e proprio t-RNA specifico che la può riconoscere e

– trasportare nel sito P del ribosoma, ma manca l'enzima t-RNA sintetasi specifico che possa legare la

selenocisteina al t-RNA. Per tale motivo non è possibile difatto che si formi una selenocisteina-tRNA.

Perciò la cellula eucariote utilizza un trucchetto. Appena arriva il t-RNA specifico per la selenocisteina,

ci lega assieme la serina, formando la serina-tRNA. A questo punto modifica la serina in selenocisteina e

si forma la selenocisteina-tRNA!!

Quest'ultima una volta raggiunto il sito P, come tutti gli altri amminoacil-tRNA saranno soggetti ad

– idrolisi e l'amminoacido verrà separato dal t-RNA. L'amminoacido andrà ad allungare la catena

polipeptidica, mentre il t-RNA scarico verrà fatto fuoriuscire dal sito E del ribosoma

CONTROLLO DELLA TRADUZIONE

E' possibile anche regolare la traduzione attraverso delle proteine specifiche che si legano ai propri siti specifici e

vanno ad attiva o inibire la traduzione del filamento di m-RNA. Un esempio studiato da noi è il controllo sui geni

sensibili alla concentrazione ematica di ferro (Sideremia). Guardiamo come funziona:

ci sono due geni implicati nella regolazione della concentrazione ematica di ferro, e sono: il gene che

– codifica per sintesi della ferritina e il gene che codifica per la sintesi della transferrina.

- La ferritina è una molecola che lega a se fino a 4500 ioni ferrosi contemporaneamente ed è il più

grande deposito di ferro del nostro organismo (si trova nel fegato)

- La transferrina è una proteina che lega il ferro e lo trasporta dal sangue ai vari tessuti del nostro corpo

entrambi i geni vengono inizialmente trascritti in filamenti di m-RNA che a loro volta sono caratterizzati

– da una regione chiamata “Sequenza IRE” (Iron Responsive Element)

quando c'è poco ferro nel sangue (condizioni di Iposideremia), viene attivata una proteina chiamata

– “Aconitasi Citosolica” che si lega alla sequenza IRE. Tale legame comporta due cose:

- il blocco della traduzione della sequenza IRE per la sintesi della ferritina

- l'avvio della traduzione della sequenza IRE per la sintesi della transferrina

quando c'è tanto ferro nel sangue (condizioni di Ipersideremia), la proteina aconitasi citosolica viene

– distaccata dalla sequenza IRE. Tale distacco comporta due cose:

- l'avvio della traduzione della sequenza IRE per la sintesi della ferritina

- il blocco della traduzione della sequenza IRE per sintesi della transferrina

Tutto questo fa notare come quando c'è tanto ferro nel sangue, il nostro organismo tenda a stoccarlo come fonte

di riserva in ferritina, ed inibisca il suo trasporto ed utilizzo tramite la transferrina. Mentre quando c'è poco

ferro nel sangue è inutile stimolare la sua riserva e quindi viene inibita la formazione della ferritina e stimolata l

formazione della transferrina che trasporterà con più facilità quel poco ferro all'interno dei tessuti del nostro

organismo. IL CODICE GENETICO

Il codice genetico è l'insieme di regole attraverso cui la cellula riesce a passare da un alfabeto nucleotidico di

quattro lettere (A;T;C;G) ad un alfabeto amminoacido di venti lettere (i venti amminoacidi). Il codice genetico

presenta determinate caratteristiche in tutti gli esseri viventi. Infatti esso è definito come:

UNIVERSALE, in quanto tutti gli esseri viventi presentano lo stesso codice genetico, fatta eccezione per

– i mitocondri

NON AMBIGUO, in quanto data una certa tripletta (codone), essa corrisponde sempre ad un

– amminoacido specifico o ad un codone di terminazione

SENZA PUNTEGGIATURE, in quando una sequenza codificante presenta sempre una “cornice di

– lettura” delimitata dalla prima e dall'ultima tripletta. Infatti se ho una sequenza che codifica per la

formazione di 100 amminoacidi, quest'ultima sarà lunga 303 nucleotidi, in quanto:

- 3 nucleotidi formano il codone di avvio che codifica generalmente per il primo amminoacido

(Metionina negli eucarioti e formil-metionina nei procarioti)

- 297 nucleotidi formano i 99 codoni [ 297 / 3 = 99 ] che codificano per i 99 amminoacidi rimanenti

- 3 nucleotidi formano il codone di terminazione, che non codifica per nessun amminoacido

RIDONDANTE, in quanto più codoni possono codificare per lo stesso amminoacido.

– - ci sono tuttavia alcuni amminoacidi come la metionina e il triptofano che possono essere codificati a

partire da un solo codone; la metionina dal codone AUG ed il triptofano dal codone UGG.

Tranne loro tutti gli altri codoni codificano per la formazione di due o più amminoacidi!!

Durante la sintesi proteica, come abbiamo visto in questo riassunto durante la fase di traduzione il filamento di

m-RNA viene tradotto in amminoacidi che successivamente vanno a formare le proteine. Il filamento di m-RNA

viene letto in codoni (triplette), che codificano a loro volta per la formazione di un determinato amminoacido.

Una domanda spontanea che potrebbe nascere è “ma perché i nucleotidi dell'RNA vengono proprio letti a

triplette dal ribosoma?”.

La risposta è semplice ed altrettanto spontanea. Il fatto è che:

se il codice genetico venisse letto a coppie di basi organiche azotate, avremo un numero di combinazioni

– possibili massimo di 16 (dato da 4^2). Tale numero non sarebbe sufficiente per dar vita ai 20

amminoacidi che formano le strutture organiche degli esseri viventi

se il codice genetico fosse letto a quartetti di basi organiche azotate, avremo un numero di combinazioni

– possibili massimo di 256 (dato da 4^4). Tale numero sarebbe esagerato e porterebbe inoltre ad un

dispendio energetico non compatibile con la vita

il codice genetico in triplette per tanto è colui che presenta un numero di combinazioni di adeguato a

– codificare tutti e venti gli amminoacidi e permettere quindi la sintesi proteica e la vita (4^3 = 64)

Un altra domanda sorge spontanea: “se gli amminoacidi sono venti, di queste 64 triplette solo 20 dovrebbero

codificare per la formazione di un amminoacido. E le altre 44 triplette?”

La risposta è semplice. Il fatto è che:

quasi tutti gli amminoacidi, tranne il triptofano e la metionina, possono essere codificati a partire da più

– tipi di triplette (Infatti si parla di codice genetico ridondante).

Quando due o più triplette codificano per il solito amminoacido si dicano “Triplette Sinonime”

di queste 64 triplette, ci sono 3 triplette che non codificano per nessun amminoacido.

– Esse sono UAA, UAG e UGA, e sono detti pre questo motivo triplette di terminazione

ESPERIMENTO DI NIREMBERG E MATTHEY ] tale esperimento, fatto nel 1961, ha dimostrato due cose:

che il filamento di m-RNA dev'essere letto in triplette (codoni)

– che quasi tutti gli amminoacidi possono essere codificati a partire da due o più triplette differenti

Per fare questo esperimento i due scienziati hanno utilizzato un estratto batterico di Escherichia Coli, in quanto i

batteri sono facilmente manipolabili e hanno tempo di proliferazione molto brevi (circa 20 minuti).

Guardiamo le fasi dell'esperimento nel dettaglio:

inizialmente costruirono artificialmente dei filamenti di m-RNA costituiti da un solo nucleotide

– inserirono questi filamenti di m-RNA in un estratto batterico contenente tutte le fonti necessarie per

– permettere una corretta sintesi proteica

una volta formata la proteina iniziarono a osservarne forma e struttura e tramite sistemi di

– sequenziamento che permettono di capire la componente amminoacidica della proteina si accorsero che:

- se all'estratto batterico veniva aggiunto un m-RNA formato dai soli nucleotidi “Uracile”, si otteneva

una proteina formata solamente da amminoacidi del tipo “Fenilalanina”

- Se all'estratto batterico veniva aggiunto un m-RNA formato dai soli nucleotidi “Adenina”, si otteneva

una proteina formata solamente da amminoacidi del tipo “Lisina”

- Se all'estratto batterico veniva aggiunto un m-RNA formato dai soli nucleotidi “Citosina”, si otteneva

una proteina formata solamente da amminoacidi del tipo “Prolina”

In poche parole capirono che se all'estratto batterico veniva aggiunto un m-RNA formato da determinate

sequenze di nucleotidi, venivano fuori sempre determinate proteine. Iniziarono quindi a modificare il filamento

di m-RNA e videro che al massimo si poteva formare una proteina avente 20 amminoacidi differenti, codificati a

partire da 64 triplette di nucleotidi differenti. Inoltre notarono che alcuni amminoacidi venivano codificati a

partire dalla solita tripletta CUCAGCGUUACCAU – Leu, Ser, Val, Thr

CUCAGCGUUACCAU – Ser, Ala, Leu, Pro

DALLA TRADUZIONE ALLA FORMAZIONE DELLE PROTEINE

Una volta che queste catene polipeptidiche sono state prodotte dalla sintesi proteica, iniziano ad associarsi

assieme formando una serie di proteine con certe tridimensionalità. Sulla base della tridimensionalità assunta,

queste determinate proteine saranno successivamente in grado di avere una certa determinata funzione.

Guardiamo come funziona questo processo nelle varie fasi:

inizialmente dalla traduzione della sintesi proteica vengono formate una serie di catene polipeptidiche di

– varia lunghezza. Tali catene polipeptidiche rappresentano la struttura primaria di una proteina, ovvero

una struttura lineare. Ogni catena polipeptidica è caratterizzata da tanti amminoacidi legati fra loro

attraverso legami peptidici. Ogni catena polipeptidica per convenzione è descritta da un estremità

C-terminale (per convenzione rappresenta l'estremità di sinistra), e da un estremità N-terminale

(per convenzione rappresenta l'estremità di destra)

tali catene polipeptidiche iniziano ad organizzarsi nello spazio e interagiscono fra loro attraverso forze

– elettrostatiche e legami a idrogeno, acquisendo pian piano una struttura secondaria. Alcune sono ad

esempio l'α-elica o i β-foglietti paralleli o antiparalleli

le strutture secondarie interagiscono e si legano fra di loro formando le strutture terziarie. Questi legami

– sono resi possibili attraverso i cosiddetti “Motivi strutturali”, che sono dei tratti ben precisi di una

struttura secondaria che tendono spontaneamente a legarsi fra loro, dando vita al legame fra le strutture

secondarie

una volta formate le strutture terziarie, quest'ultime interagiscono fra loro formando una struttura

– ancora più complessa definita come struttura quaternaria. Ogni struttura quaternaria è caratterizzata

in poche parole da più strutture terziare che fungono da “Subunità”. Ogni subunità svolge una

determinata funzione che può uguale alle altre o meno, ma con la finalità di cooperare per lo stesso

obbiettivo che sarà la funzione svolta dalla proteina quaternaria stessa

Shaperoni: Una volta formate, le proteine non è detto che sono del tutto funzionali, magari alle volte necessitano

di un aiuto esterno per raggiungere la piena funzionalità. Infatti ci sono due tipi di proteine:

1 ] ci sono proteine che presentano le proprie sequenze idrofobiche all'interno della propria struttura. Questo ci

fa notare che non possono più reagire con l'esterno, e la proteina per tanto è già stabile. Se una proteina è stabile,

significa che ha già raggiunto da sola il corretto grado di complessità per svolgere la propria funzione al meglio

2 ] ci sono delle proteine che invece presentano le proprie sequenze idrofobiche all'esterno della propria

struttura. Questo ci fa notare come esse siano predisposte a reagire con l'ambiente esterno, e la proteina per

tanto non è stabile. Se una proteina non è stabile significa che non ha raggiunto il giusto grado di complessità da

sola e deve in qualche maniera essere aiutata dal nostro organismo. Il nostro organismo allora inizia a produrre

delle piccole proteine chiamate “Shaperoni”. Gli shaperoni riconoscono queste proteine instabili e crea, con

l'ausilio di ATP, determinati legami necessari a stabilizzare la proteina, facendoli assumere la corretta struttura

tridimensionale. Gli shaperoni possono appartenere a due famiglie differenti:

la famiglia delle HSP70. Questi shaperoni sono proteine tridimensionali che utilizzano ATP per formare

– legami covalenti fra le varie catene polipeptidiche, in modo tale da stabilizzare la proteina. Se la proteina

presenta più parti instabili contemporaneamente, gli shaperoni agiscano su una parte e la stabilizzano,

poi si staccano e di riattaccano in altri punti instabili e stabilizzano via via la proteina. Al momento in

cui in cui tutta la proteina si è stabilizzata gli shaperoni si staccano e vanno a stabilizzare altre proteine

la famiglia delle HSP60. Questi shaperoni sono più complessi, infatti sono proteine quaternarie

– caratterizzate da più subunità proteiche. Tali shaperoni sono molti grandi e al centro presentano una

struttura cava dentro cui viene fatta entrare la proteina instabile. A questo punto con l'ausilio di ATP

vengono formati legami covalenti fra le varie catene polipeptidiche, in modo tale da stabilizzare la

proteina e indurre il corretto ripiegamento. Una volta che la proteine è diventata stabile, viene liberata

dalla struttura cava dello shaperone HSP60. A questo lo shaperone HSP60 può ospitare altre proteine

instabili, mentre la proteina stabilizzata potrà attuare la propria funzione liberamente

Complesso del Proteosoma: ci sono alcune proteine che non riescono ad assumere la correte struttura

tridimensionale, anche se sono intervenuti gli shaperoni. Queste proteine sono potenzialmente dannose per la

cellula e devono il prima possibile essere eliminate. L'eliminazione delle proteine presenti all'interno di una

cellula è a carico di un complesso proteico chiamato “Proteosoma”.

Il proteosoma è costituito da tre regioni distinte:

una porzione anellare, in cui vengono inserite le proteine da degradare

– una porzione centrale in cui vi sono un sacco di enzimi che catalizzano la rottura dei legami peptidici. La

– rottura dei legami peptidici continua fino a che da una proteina non si è ottenuto tutti singoli

amminoacidi

una porzione terminale dove vengono rilasciati i singoli amminoacidi riottenuti

In poche parole, arriva la proteina instabile e dev'essere innanzitutto riconosciuta dal proteosoma.

La cellula produce una serie di corte catene polipeptidiche chiamate “Ubiquitine” che attraverso delle ligasi (E1,

E2 e E3) vengono legate ai residui di cisteine e lisina delle proteina instabili. In questo modo le proteine instabili

sono state marcate e possono essere riconosciute dal proteosoma. Tale processo prende il nome di

ubiquitinazione. Successivamente il proteosoma una volta che ha riconosciuto la proteina instabile, interagisce

con essa e la degrada in tanti amminoacidi. Gli amminoacidi verranno successivamente rilasciati dal proteosoma.

IL DESTINO POST-TRADUZIONALE DELLE PROTEINE FORMATE

Generalità ] Una volta sintetizzate, le proteine possono essere trasportate attraverso due modalità:

1 ] La “VIA CITOPLASMATICA”

La via citoplasmatica viene definita anche come “Via transmembrana”. Tale via viene intrapresa da determinate

proteine che devono:

restare all'interno del citoplasma

– essere trasportate nel nucleo

– essere trasportate nei mitocondri

Il meccanismo di trasporto di queste proteine è post-traduzionale, per cui prima si ha la traduzione delle catene

polipeptidiche, che si associano a formare le proteine, che vengono successivamente trasportate

2 ] La “VIA SECRETORIA”

La via secretoria viene definita anche come “Trasporto Vescicolare”. Tale via consiste nella formazione di

vescicole di trasporto che incorporano le proteine e le trasportano nei vari compartimenti cellulari.

Ogni vescicola nasce nel compartimento cellulare donatore, va incontro a gemmazione, ingloba la proteina da

trasportare e infine si fonde con la membrana del compartimento cellulare accettore riversando la proteina

trasportata. Generalmente vi è sempre un ordine in cui le proteine vengono trasportate. Inizialmente le proteine

vengono trasportate al RE (reticolo endoplasmatico). Successivamente le proteine passano dal RE all'apparato

del Golgi. Dall'apparato del Golgi le proteine possono:

essere veicolate a livello della membrana cellulare

– essere veicolate a livello dei lisosomi

– essere veicolate a livello dei perossisomi

– essere incorporate all'interno di vescicole di secrezione per essere poi riversate nell'ambiente

– extracellulare (questo succede soprattutto nel caso di proteine che compongono ormoni peptidici)

Il meccanismo di trasporto di queste proteine è cotraduzionale, per cui il trasporto di queste proteine avviene

contemporaneamente alla loro traduzione.

La cellula per capire se indirizzare le proteine nella via citoplasmatica o nella via secretoria, riconosce una

piccola porzione della proteina chiamata “Peptide-segnale”, una corta catena di 7-8 amminoacidi. Infatti:

se il peptide-segnale si trova nella regione N-terminale della proteina, significa che quest'ultima

– dev'essere trasportata nel RE o nei mitocondri. Una volta avvenuto il trasporto il peptide-segnale viene

infine tagliato attraverso delle proteasi

se il peptide-segnale si trova nella regione C-terminale della proteina, significa che quest'ultima

– dev'essere trasportata nei perossisomi. Una volta avvenuto il trasporto il peptide-segnale non viene

tagliato

se il peptide-segnale si trova nella porzione mediana della proteina, significa che quest'ultima dev'essere

– trasportata nel nucleo. Una volta avvenuto il trasporto il peptide-segnale non viene tagliato

se non vi è nessun peptide-segnale all'interno della proteina, significa che quest'ultima non dovrà essere

– trasportata, bensì dovrà rimanere nel citoplasma della cellula

VIA CITOPLSMATICA

La via citoplasmatica è definita anche come “Via transmembrana”. Tale via viene intrapresa da determinate

proteine che devono:

restare all'interno del citoplasma (perché non viene riconosciuto nessun peptide-segnale)

– essere trasportate nel nucleo (perché il peptide-segnale si trova nella porzione mediana della proteina)

– essere trasportate nei mitocondri (perché il peptide-segnale si trova nella regione N-terminale della

– proteina)

Trasporto delle proteine nel nucleo ] Il trasporto nucleare è mediato da un complesso proteico localizzato sulla

superficie della membrana nucleare. Tale complesso prende il nome di “Complesso del poro nucleare” (NPC).

L'NPC è formato fondamentalmente dal poro nucleare, che a sua volta è costituito da vari tipi di proteine:

Abbiamo le “Proteine di struttura”, che si trovano nella struttura interna del poro nucleare e si

– associano fra loro a formare una fitta rete proteica in grado di far passare liberamente solo determinate

sostanze di ridotte dimensioni. Tale rete prende il nome di “Barriera di diffusione”. Generalmente infatti

le proteine che presentano un peso molecolare molto ridotto (inferiore ai 60 Kdalton), per le loro ridotte

dimensioni possono liberamente transitare attraverso la membrana nucleare verso il nucleo o viceversa,

attraverso trasporto passivo (senza dispendio di ATP). Invece le proteine che presentano un peso

molecolare molto elevato (maggiore ai 60 Kdalton), per le loro notevoli dimensioni non possono

liberamente transitare attraverso la membrana nucleare per via della barriera di diffusione, e quindi

vengono trasportate attraverso un trasporto attivo mediato da NPC

Abbiamo le “Proteine recettrici” dette anche comunemente “Recettori”, che si legano alla superficie del

– poro nucleare attraverso legami diretti o mediante proteine adattatrici. Tali recettori hanno la funzione

di regolare l'apertura e la chiusura del poro mediante il riconoscimento di particolari regioni delle

proteine da trasportare. Tali regioni sono ricche di lisine e arginine e prendono il nome di

“Peptidi-segnale” definiti anche come NLS (Segnali di Localizzazione Nucleari).

Gli NLS rappresentano difatto il sito di legame tra le proteine da trasportare e il complesso NPC.

Riassumendo: un estremità della proteina recettrice si lega al poro nucleare attraverso un legame diretto

o mediante una proteina adattatrice. Contemporaneamente l'altra estremità della stessa proteina

recettrice si lega alla proteina da trasportare attraverso il riconoscimento della regione NLS.

Alla fine quindi ogni proteina recettrice permette il legame fisico tra il poro nucleare e la proteina da

trasportare. Ovviamente la proteina recettrice se non riconosce gli NLS (per mal funzionamenti o perché

non c'è), non potrà riconoscere e legare la proteina di trasporto, che non verrà trasportata

Abbiamo le “Proteine regolatrici”, che permettano di regolare il trasporto nucleare. Alcune di queste

– proteine sono le RAN, le GEF e le GAP. Nello specifico:

- RAN è una proteina monomerica che si può trovare in forma attiva (RAN-GTP) o inattiva (RAN-GDP)

- GEF è una proteina che induce l'attivazione della proteina RAN [ RAN-GDP + GEF → RAN-GTP ]

- GAP è una proteina che induce l'inattivazione della proteina RAN [ RAN-GTP +GAP → RAN-GDP ]

Generalmente la proteina GEF è più concentrata all'interno del nucleo, mentre la proteina GAP è più

concentrata nel citoplasma della cellula, quindi nel nucleo avremo una concentrazione di RAN-GTP

maggiore rispetto a RAN-GDP.

Quando parliamo del trasporto nucleare dobbiamo far riferimento a due tipi di trasporto: l'importazione

nucleare (che trasporta la proteina dal citoplasma al nucleo) e l'esportazione nucleare (che trasporta la proteina

dal nucleo al citoplasma). Guardiamoli nel dettaglio:

1 ] Guardiamo nel dettaglio il processo di “Importazione nucleare”:

inizialmente interviene uno specifico recettore per l'importazione nucleare. Tale recettore riconosce la

– regione NLS della proteina da trasportare e ci si lega formando difatto il complesso ligando-recettore.

una volta formato il complesso ligando-recettore, la proteina GEF attiva la RAN-GDP in RAN-GTP

– la RAN-GTP a questo punto interagisce con il complesso ligando-recettore ed induce il rilascio della

– proteina dal citoplasma al nucleo (attraverso il poro nucleare)

una volta arrivati nel citoplasma la proteina RAN-GTP si distacca dal complesso ligando-recettore e

– viene inattivata grazie alla presenza delle proteine GAP [ RAN-GTP + GAP → RAN-GDP + Pi ]

il recettore per l'importazione nucleare è quindi libero di iniziare un nuovo ciclo di importazione

– alla fine di tutto la proteine GEF torna a riattivare RAN-GDP permettendo la formazione di RAN-GTP.

– In tal modo così la RAN-GTP potrà attivamente interagire con un nuovo complesso ligando-recettore

per permettere il suo trasporto all'interno del nucleo

2 ] Guardiamo nel dettaglio il processo di “Esportazione nucleare”:

inizialmente interviene uno specifico recettore per l'esportazione nucleare. Tale recettore decorre nel

– nucleo dove riconosce la regione NLS della proteina da trasportare e ci si lega formando difatto il

complesso ligando-recettore.

una volta formato il complesso ligando-recettore, la proteina GEF attiva la RAN-GDP in RAN-GTP

– la RAN-GTP a questo punto interagisce con il complesso ligando-recettore ed induce il trasporto della

– proteina dal nucleo al citoplasma (attraverso il poro nucleare)

una volta arrivati nel citoplasma la proteina RAN-GTP si distacca dal complesso ligando-recettore e

– viene inattivata grazie alla presenza delle proteine GAP [ RAN-GTP + GAP → RAN-GDP + Pi ]

il recettore per l'esportazione nucleare a questo punto è libero di iniziare un nuovo ciclo di esportazione

– alla fine di tutto la proteine GEF torna a riattivare RAN-GDP permettendo la formazione di RAN-GTP.

– In tal modo così la RAN-GTP potrà attivamente interagire con un nuovo complesso ligando-recettore

per permettere il suo trasporto all'esterno del nucleo

Trasporto delle proteine nei mitocondri ] le proteine che devono essere trasportare nei mitocondri possono

presentare la regione NLS (peptide-segnale) in diverse parti strutturali. Infatti possiamo averne di quattro tipi:

ci sono quelle proteine che devano essere trasportate nella matrice mitocondriale.

– Esse presentano la regione NLS sull'estremità N-terminale della proteina. Come abbiamo visto

precedentemente, se la sequenza NLS si trova sull'estremità N-terminale di una proteina, durante il

processo di trasporto viene eliminata

ci sono quelle proteine che devono essere trasportate all'interno della membrana esterna mitocondriale.

– Esse presentano la regione NLS nella porzione mediana della proteina. Come abbiamo visto

precedentemente, se la sequenza NLS si trova nella porzione mediana di una proteina, durante il

processo di trasporto non viene eliminata

ci sono proteine che devono essere trasportate all'interno della membrana mitocondriale interna.

– Esse presentano la regione NLS sull'estremità N-terminale della proteina. Come abbiamo visto

precedentemente, se la sequenza NLS si trova sull'estremità N-terminale di una proteina, durante il

processo di trasporto viene eliminata

quelle proteine che devono essere trasportate nello spazio intermembrana del mitocondrio.

– Esse presentano la regione NLS nella porzione mediana della proteina. Come abbiamo visto

precedentemente, se la sequenza NLS si trova nella porzione mediana di una proteina, durante il

processo di trasporto non viene eliminata

Tutte queste proteine sono trasportate grazie ad alcuni complessi proteici quaternari caratterizzati da tante

subunità proteiche che funzionano come traslocatori di proteine. Ogni subunità presenta un recettore per legare

la proteina di trasporto specifica e i componenti del canale di traslocazione. Questi complessi quaternari sono:

la proteina TOM, che trasporta le proteine attraverso la membrana esterna

– la proteina SAM, che aiuta le proteine presenti nella membrana esterna ad assumere la corretta

– struttura tridimensionale

le proteine TIM-22 e TIM-23, che trasportano le proteine attraverso la membrana interna

– la proteina OXA, che trasporta le proteine dal citoplasma o la matrice mitocondriale, verso la

– membrana interna del mitocondrio [citoplasma → membrana interna ] [matrice → membrana interna ]

1 ] Il trasporto delle proteine nella matrice mitocondriale è mediato dalle proteine TOM e TIM-23.

Queste proteine da trasportare subiscono qualche problema nella loro sintesi. Infatti quello che succede è che

alcuni geni specifici vengono trascritti in m-RNA. L'm-RNA va incontro a maturazione e viene tradotto in catene

polipeptidiche (e fin qui tutto apposto..). Successivamente le catene polipeptidiche interagiscono fra loro al fine di

formare una proteina tridimensionale, ma durante il processo di folding, vi sono delle imperfezioni che portano

alla formazione di una proteina instabile. Tale proteina instabile dev'essere quindi trasportata:

Inizialmente il complesso TOM riconosce la regione NLS posto nella sequenza N-terminale della

– proteina e si lega ad essa

una volta riconosciuto avviene il trasporto della proteina (detto anche traslocazione) dalla membrana

– esterna allo spazio intermembrana

una volta arrivata nello spazio intermembrana la proteina interagisce con la TIM-23 e viene trasportata

– nella matrice mitocondriale

una volta trasportata nella matrice mitocondriale la proteina viene rilasciata dalla TIM-23

– all'interno della matrice mitocondriale vi sono molte peptidasi, che degradano la regione NLS posta

– nella sequenza N-terminale della proteina

a questo punto la proteina verrà riconosciuta dagli shaperoni HSP-70 che creano, con l'ausilio di ATP,

– determinati legami necessari a stabilizzare la proteina, facendole assumere una struttura

tridimensionale tale da poter svolgere la propria funzione all'interno della matrice mitocondriale!!

2 ] Il trasporto delle proteine attraverso la membrana mitocondriale esterna è mediato dalle proteine TOM e

SAM. Queste proteine da trasportare subiscono qualche problema nella loro sintesi. Infatti quello che succede è

che alcuni geni specifici vengono trascritti in m-RNA. L'm-RNA va incontro a maturazione e viene tradotto in

catene polipeptidiche (e fin qui tutto apposto..). Successivamente le catene polipeptidiche interagiscono fra loro al

fine di formare una proteina tridimensionale, ma durante il processo di folding, vi sono delle imperfezioni che

portano alla formazione di una proteina instabile. Tale proteina instabile dev'essere quindi trasportata:

inizialmente il complesso TOM riconosce la regione NLS posta nella parte mediana della proteina da

– trasportare e si lega ad essa

una volta riconosciuta avviene il trasporto della proteina (detto anche traslocazione) dalla membrana

– esterna allo spazio intermembrana

una volta arrivata nello spazio intermembrana la proteina interagisce con la SAM e viene trasportata

– nuovamente nella membrana esterna. Il complesso SAM oltre a trasportare la proteina la aiuta ad

acquisire la corretta tridimensionalità. La proteina sarà quindi pronta a svolgere la propria funzione

all'interno della membrana esterna

3 ] Il trasporto delle proteine attraverso la membrana mitocondriale interna è mediato da diversi complessi

proteici e può avvenire attraverso due diversi meccanismi molecolari:

Il primo meccanismo molecolare con la quale le proteine vengono trasportate attraverso la membrana interna è

mediato dai complessi TOM e TIM-23:

inizialmente il complesso TOM riconosce la regione NLS posta nella parte mediana della proteina da

– trasportare e si lega ad essa

successivamente avviene il trasporto della proteina (detto anche traslocazione) dalla membrana esterna

– allo spazio intermembrana

una volta fatto ciò arriva il complesso TIM-23 che inizia a trasportare la proteina verso la matrice

– mitocondriale. Il processo prosegue fino a che TIM-23 non riconosce la regione NLS della proteina, che

in tal caso rappresenta un segnale di stop del trasporto

all'interno della matrice mitocondriale abbiamo la presenza di numerose peptidasi che degradano la

– regione NLS posta nella sequenza N-terminale della proteina. La degradazione della regione NLS induce

il rilascio della proteina che attraverso la propria porzione idrofobica aderisce a livello della membrana

mitocondriale interna

Il secondo meccanismo molecolare con la quale le proteine vengono trasportate attraverso la membrana interna

è mediato dai complessi TOM, TIM-23 e OXA:

– inizialmente il complesso TOM riconosce la regione NLS posta nella parte mediana della proteina da

trasportare e si lega ad essa

successivamente avviene il trasporto della proteina (detto anche traslocazione) dalla membrana esterna

– allo spazio intermembrana

una volta fatto ciò arriva il complesso TIM-23 che inizia a trasportare la proteina verso la matrice

– mitocondriale. Il processo prosegue fino a che TIM-23 non riconosce la regione NLS della proteina, che

in tal caso rappresenta un segnale di stop del trasporto

all'interno della matrice mitocondriale abbiamo la presenza di numerose peptidasi che degradano la

– regione NLS posta nella sequenza N-terminale della proteina. La degradazione della regione NLS induce

il complesso OXA ad intervenire

OXA si lega alla proteina e la trasporta nello spazio intermembrana. Una volta trasportata OXA si

– dissocia dalla proteina e lascia la porzione idrofobica della proteina ancorata alla membrana interna

mitocondriale

ricordo che OXA riesce a fare la stessa cosa anche direttamente sulle proteine prodotte direttamente

– dalla sintesi proteica mitocondriale (quindi con le proteine mitocondriali), ancorandole alla membrana

interna del mitocondrio

4 ] Il trasporto delle proteine attraverso lo spazio intermembrana è mediato dalle proteine TOM e TIM-23 ed è

pressoché identico al trasporto mediato nella membrana mitocondriale interna nel caso del primo meccanismo

molecolare visto in precedenza. Infatti:

inizialmente il complesso TOM riconosce la regione NLS posta nella parte mediana della proteina da

– trasportare e si lega ad essa

successivamente avviene il trasporto della proteina (detto anche traslocazione) dalla membrana esterna

– allo spazio intermembrana

una volta fatto ciò arriva il complesso TIM-23 che inizia a trasportare la proteina verso la matrice

– mitocondriale. Il processo prosegue fino a che TIM-23 non riconosce la regione NLS della proteina, che

in tal caso rappresenta un segnale di stop del trasporto

all'interno della matrice mitocondriale abbiamo la presenza di numerose peptidasi che degradano la

– regione NLS posta nella sequenza N-terminale della proteina. La degradazione della regione NLS induce

il rilascio della proteina

a questo punto la porzione idrofobica della proteina viene tagliata e per tanto la proteina stessa non può

– aderire alla membrana interna. Non potendo aderire alla membrana interna tale proteina rimane

immersa nello spazio intermembrana

VIA SECRETORIA

La via secretoria viene definita anche come “Trasporto Vescicolare”. Non a caso tale via consiste nella

formazione di vescicole di trasporto che incorporano le proteine e le trasportano nei vari compartimenti

cellulari. Ogni vescicola nasce nel compartimento cellulare donatore, va incontro a gemmazione, ingloba la

proteina da trasportare ed infine si fonde con la membrana del compartimento cellulare accettore riversando la

proteina trasportata. Tale trasporto è definito come “Cotraduzionale”, per cui il trasporto di queste proteine

avviene contemporaneamente alla loro traduzione. Vi è sempre un ordine in cui le proteine vengono trasportate.

Inizialmente le proteine vengono tradotte nei ribosomi immersi nel citoplasma, ma ad un certo punto la

traduzione viene bloccata e viene ripresa dai ribosomi ancorati al reticolo endoplasmatico ruvido (RER).

Al momento in cui è finita la traduzione della proteina, quest'ultima potrà essere di due tipi:

“Proteina transmembrana”, rimane ancorata alla membrana del RER

– “Proteina solubile”, viene rilasciata dal RER nel lume e a seguito di una serie di modificazioni verrà

– trasportata all'apparato del Golgi. Dall'apparato del Golgi le proteine solubili possono:

- essere veicolate a livello della membrana cellulare

- essere veicolate a livello dei lisosomi

- essere veicolate a livello dei perossisomi

- essere incorporate all'interno di vescicole di secrezione per essere poi riversate nell'ambiente

extracellulare (questo succede soprattutto nel caso di proteine che compongono ormoni peptidici)

Ad ogni modo attraverso la via secretoria ci sono proteine che una volta prodotte dai ribosomi vengono:

trasportate nel reticolo endoplasmatico e successivamente ancorate alla membrana del RE

– trasportate nel reticolo endoplasmatico e successivamente veicolate negli altri compartimenti cellulari.

Tutte queste proteine all'univoco possono attraversare due tipi di vie secretorie:

la via secretoria costitutiva viene intrapresa da proteine che devono essere continuamente sintetizzate

– poiché sono indispensabili alla vita della cellula

la via secretoria regolata viene intrapresa da proteine che devono essere rilasciate solo in determinate

– condizioni di vita della cellula. La regolazione della sintesi e del trasporto di tali proteine è a carico di

determinati segnali biochimici. Ad esempio l'attivazione di GLUT-4 è dipendente dalla presenza di

insulina. Senza insulina non viene attivata il GLUT-4, viceversa viene attivata

PROCESSO GENERALE DI TRASPORTO DELLE PROTEINE NEL RER ] guardando nel dettaglio il

processo di trasporto delle proteine dal citoplasma al RER, possiamo notare tre fasi: riconoscimento,

indirizzamento-rilascio e riciclo.

Fase di riconoscimento:

inizialmente il gene che codifica per la formazione della proteina, va incontro a trascrizione e si forma il

– filamento di m-RNA

il filamento di m-RNA va incontro a maturazione. Il filamento di m-RNA maturo verrà riconosciuto dai

– ribosomi immersi nel citoplasma ed inizierà la traduzione

via via che la traduzione continua, inizia a formarsi una catena polipeptidica.

– Questa catena polipeptidica nascente potrà andare incontro a due destini:

- se la catena polipeptidica nascente non presenta nessuna regione NLS, non avviene il blocco della

traduzione e quindi verrà completata senza problemi

- se la catena polipeptidica nascente presenza la regione NLS nella sequenza N-terminale o interna della

proteina, viene richiamata una proteina SRP che riconosce e si lega ad essa formando il complesso

“NLS-SRP”, determinando il blocco della traduzione da parte del ribosoma citoplasmatico

Fase di indirizzamento e rilascio:

il complesso NLS-SRP a questo punto va a contatto con una proteina definita come “Traslocatore”, che

– si trova sulla superficie della membrana del reticolo endoplasmatico. Il traslocatore ha la funzione di

agganciare la proteina e ancorarla al reticolo endoplasmatico. Tale processo all'unisono prende il nome

di “Traslocazione”. Il traslocatore può assumere due stati conformazionali:

- Nello stato “Chiuso”, il traslocatore va a formare una sorta di struttura elicoidale che forma un tappo.

Tale tappo non permette al traslocatore di interagire con la proteina, che a sua volta difatto non viene

ancorata al reticolo endoplasmatico

- Nello stato“Aperto”, il tappo si sposta ed il traslocatore può quindi interagire senza problemi con la

proteina. Il legame fra il traslocatore e la proteina stimola un cambio conformazionale di quest'ultima.

Il cambio di conformazione fa si che venga esposto esternamente un sito di legame specifico posto nella

parte interna della proteina. A questo punto il sito di legame specifico posto nella sequenza interna viene

riconosciuto dai ribosomi ancorati alla membrana del RER, che continuano cosi la traduzione

precedentemente bloccata

Una volta ripresa la traduzione, la catena polipeptidica scorre nella membrana del RER fino a che non

– viene riconosciuta un altra sequenza specifica chiamata “sequenza di stop del trasferimento”.

A seguito del riconoscimento della sequenza di stop, succedono due cose:

- la sequenza di stop si lega al traslocatore inducendone l'apertura ed il rilascio della proteina

- la regione NLS posta nella sequenza interna della proteina non viene degradata, mentre se la regione

NLS si trova nella sequenza N-terminale della proteina, viene degradata dalle peptidasi

la proteina una volta rilasciata dal traslocatore si ritrova ancorata alla membrana del RER

Fase di riciclo:

Una volta rilasciata la proteina ed ancorata alla membrana del RER, SRP si stacca da essa e torna nel

– citoplasma dove andrà ad interagire con altre proteine da trasportare

FORMAZIONE DELLE PROTEINE TRANSMEMBRANA ] vi sono vari tipi di proteine transmembrana:

proteine transmembrana a singolo passo

– proteine transmembrana a doppio passo

– proteine transmembrana multipasso

1 ] Proteine transmembrana a singolo passo (primo meccanismo di formazione):

Il primo meccanismo è articolato nelle classiche tre fasi: riconoscimento, indirizzamento-rilascio e riciclo.

Fase di riconoscimento:

inizialmente il gene che codifica per la formazione della proteina, va incontro a trascrizione e si forma il

– filamento di m-RNA

il filamento di m-RNA va incontro a maturazione. Il filamento di m-RNA maturo verrà riconosciuto dai

– ribosomi immersi nel citoplasma ed inizierà la traduzione

via via che la traduzione continua, inizia a formarsi una catena polipeptidica che presenta la regione

– NLS nella sequenza N-terminale della proteina. Tale regione NLS richiama la proteina SRP che la

riconosce e si lega ad essa formando il complesso “NLS-SRP”. Una volta formato il complesso NLS-SRP

si ha il blocco della traduzione da parte del ribosoma citoplasmatico

Fase di indirizzamento e rilascio:

il complesso NLS-SRP a questo punto va a contatto con una proteina definita come “Traslocatore”, che

– si trova sulla superficie della membrana del reticolo endoplasmatico. Il traslocatore ha la funzione di

agganciare la proteina e ancorarla al reticolo endoplasmatico. Tale processo all'unisono prende il nome

di “Traslocazione”

Il traslocatore una volta legato al complesso NLS-SRP passa dallo stato chiuso allo stato aperto.

– Lo stato aperto del traslocatore induce un cambio conformazionale della proteina.

Il cambio di conformazione fa si che venga esposto esternamente un sito di legame specifico posto nella

parte N-terminale della proteina

A questo punto il sito di legame specifico posto nella sequenza N-terminale funge da “sequenza di

– inizio”. Infatti viene riconosciuto dai ribosomi ancorati alla membrana del RER, che continuano cosi la

traduzione precedentemente bloccata

Una volta ripresa la traduzione, la catena polipeptidica scorre sempre di più nella membrana del RER

– fino a che non viene riconosciuta un altra sequenza idrofobica specifica chiamata “sequenza di stop del

trasferimento”. A seguito del riconoscimento della sequenza di stop, succedono due cose:

- la sequenza di stop si lega al traslocatore inducendone l'apertura ed il rilascio della proteina

- arrivano le peptidasi e degradano la regione NLS posta nella sequenza N-terminale della proteina

la proteina una volta rilasciata dal traslocatore si ritrova ancorata alla membrana del RER

– si è quindi formata una proteina transmembrana a singolo passo, avente un estremità C-terminale

– (rivolta verso il citoplasma) ed un estremità N-terminale (rivolta verso il lume del RER)

Fase di riciclo:

Una volta formata la proteina transmembrana a singolo passo, SRP si stacca da essa e torna nel

– citoplasma dove andrà ad interagire con altre proteine da trasportare

1 ] Proteine transmembrana a singolo passo (secondo meccanismo di formazione):

Il secondo meccanismo è articolato nelle classiche tre fasi: riconoscimento, indirizzamento-rilascio e riciclo.

Fase di riconoscimento:

inizialmente il gene che codifica per la formazione della proteina, va incontro a trascrizione e si forma il

– filamento di m-RNA

il filamento di m-RNA va incontro a maturazione. Il filamento di m-RNA maturo verrà riconosciuto dai

– ribosomi immersi nel citoplasma ed inizierà la traduzione

via via che la traduzione continua, inizia a formarsi una catena polipeptidica che presenta la regione

– NLS nella sequenza interna della proteina. Tale regione NLS richiama la proteina SRP che la riconosce e

si lega ad essa formando il complesso “NLS-SRP”. Una volta formato il complesso NLS-SRP si ha il

blocco della traduzione da parte del ribosoma citoplasmatico

Fase di indirizzamento e rilascio:

il complesso NLS-SRP a questo punto va a contatto con una proteina definita come “Traslocatore”, che

– si trova sulla superficie della membrana del reticolo endoplasmatico.

Il traslocatore ha la funzione di agganciare la proteina e ancorarla al reticolo endoplasmatico.

Tale processo all'unisono prende il nome di “Traslocazione”

Il traslocatore una volta legato al complesso NLS-SRP passa dallo stato chiuso allo stato aperto.

– Lo stato aperto del traslocatore induce un cambio conformazionale della proteina.

Il cambio di conformazione fa si che venga esposto esternamente un sito di legame specifico posto nella

parte interna della proteina

A questo punto il sito di legame specifico posto nella sequenza interna funge da “sequenza di inizio”.

– Infatti viene riconosciuto dai ribosomi ancorati alla membrana del RER, che continuano cosi la

traduzione precedentemente bloccata

Una volta ripresa la traduzione, la catena polipeptidica scorre sempre di più nella membrana del RER

– fino a che non viene riconosciuta un altra sequenza specifica chiamata “sequenza di stop del

trasferimento”. A seguito del riconoscimento della sequenza di stop, succedono due cose:

- la sequenza di stop si lega al traslocatore inducendone l'apertura ed il rilascio della proteina

- la regione NLS della sequenza interna della proteina si ancora al RER (la regione NLS ricordo che non

viene degradata dalle peptidasi perché è interna alla proteina!!!)

L'ancoraggio della proteina può avvenire secondo due modalità:

– - nella prima modalità si forma una proteina transmembrana a singolo passo che si ancora con

l'estremità N-terminale rivolta verso il citoplasma e l'estremità C-terminale rivolta verso il lume del

reticolo endoplasmatico

- nella seconda si forma una proteina transmembrana a singolo passo che si ancora con l'estremità

N-terminale rivolta verso il lume del reticolo endoplasmatico e l'estremità C-terminale rivolta verso il

citoplasma

Fase di riciclo:

Una volta formata la proteina transmembrana a singolo passo, SRP si stacca da essa e torna nel

– citoplasma dove andrà ad interagire con altre proteine da trasportare

2 ] Proteine transmembrana a doppio passo:

Fase di riconoscimento:

inizialmente il gene che codifica per la formazione della proteina, va incontro a trascrizione e si forma il

– filamento di m-RNA

il filamento di m-RNA va incontro a maturazione. Il filamento di m-RNA maturo verrà riconosciuto dai

– ribosomi immersi nel citoplasma ed inizierà la traduzione

via via che la traduzione continua, inizia a formarsi una catena polipeptidica che presenta la regione

– NLS nella sequenza interna della proteina. Tale regione NLS richiama la proteina SRP che la riconosce e

si lega ad essa formando il complesso “NLS-SRP”. Una volta formato il complesso NLS-SRP si ha il

blocco della traduzione da parte del ribosoma citoplasmatico

Fase di indirizzamento e rilascio:

il complesso NLS-SRP a questo punto va a contatto con una proteina definita come “Traslocatore”, che

– si trova sulla superficie della membrana del reticolo endoplasmatico.

Il traslocatore ha la funzione di agganciare la proteina e ancorarla al reticolo endoplasmatico.

Tale processo all'unisono prende il nome di “Traslocazione”

Il traslocatore una volta legato al complesso NLS-SRP passa dallo stato chiuso allo stato aperto.

– Lo stato aperto del traslocatore induce un cambio conformazionale della proteina.

Il cambio di conformazione fa si che venga esposto esternamente un sito di legame specifico posto nella

parte interna della proteina

a questo punto il sito di legame specifico posto nella sequenza interna funge da “sequenza di inizio”.

– Infatti viene riconosciuto dai ribosomi ancorati alla membrana del RER, che continuano cosi la

traduzione precedentemente bloccata

Una volta ripresa la traduzione, la catena polipeptidica scorre nella membrana del RER fino a che non

– viene riconosciuta un altra sequenza specifica chiamata “sequenza di stop del trasferimento”.

A seguito del riconoscimento della sequenza di stop, succedono due cose:

- la sequenza di stop si lega al traslocatore inducendone l'apertura ed il rilascio della proteina

- la regione NLS della sequenza interna della proteina si ancora al RER (la regione NLS ricordo che non

viene degradata dalle peptidasi perché è interna alla proteina!!!)

Tale proteina una volta ancorata al RER presenta due caratteristiche:

– - ha due domini interni che rimangano contemporaneamente ancorati al RER (doppio passo)

- presenta caratteristiche di unidirezionalità, in quanto sia l'estremità C-terminale che l'estremità

N-terminale volgono entrambe sul versante citoplasmatico

Fase di riciclo:

Una volta formata la proteina transmembrana a doppio passo, SRP si stacca da essa e torna nel

– citoplasma dove andrà ad interagire con altre proteine da trasportare

3 ] Proteine transmembrana multipasso:

Fase di riconoscimento:

inizialmente il gene che codifica per la formazione della proteina, va incontro a trascrizione e si forma il

– filamento di m-RNA

il filamento di m-RNA va incontro a maturazione. Il filamento di m-RNA maturo verrà riconosciuto dai

– ribosomi immersi nel citoplasma ed inizierà la traduzione

via via che la traduzione continua, inizia a formarsi una catena polipeptidica che presenta più regioni di

– segnalazione NLS posti nella sequenza interna della proteina. Tali regioni NLS richiamano delle proteine

SRP che le riconoscono e si legano ad esse formando molti complessi “NLS-SRP”.

Una volta formato i complessi NLS-SRP si ha il blocco della traduzione da parte del ribosoma

citoplasmatico

Fase di indirizzamento e rilascio:

ciascuno dei complessi NLS-SRP a questo punto va a contatto con una proteina definita come

– “Traslocatore”, che si trova sulla superficie della membrana del reticolo endoplasmatico

Il traslocatore ha la funzione di agganciare la proteina e ancorarla al reticolo endoplasmatico.

Tale processo all'unisono prende il nome di “Traslocazione”

I traslocatori una volta legati ai complessi NLS-SRP passano dallo stato chiuso allo stato aperto.

– Lo stato aperto del traslocatore induce un cambio conformazionale della proteina.

Il cambio di conformazione fa si che vengano esposti esternamente molteplici siti di legame specifici

posti nella parte interna della proteina

A questo punto i siti di legame specifici fungano da “sequenze di avvio”. Infatti vengono riconosciuti e

– legati dai ribosomi ancorati alla membrana del RER, che continuano cosi la traduzione precedentemente

bloccata

Una volta ripresa la traduzione, la catena polipeptidica scorre nella membrana del RER fino a che non

– vengono riconosciute altre sequenze idrofobiche specifiche chiamate “sequenze di stop del

trasferimento”

la proteina stavolta però presenta:

– - molte sequenze NLS e sequenze di stop poste nella sequenza interna della proteina.

Tali sequenze si ancorano alla membrana del reticolo endoplasmatico. Quindi la solita proteina passa la

membrana del reticolo endoplasmatico tante volte (multipasso)

- la proteina presenta un estremità N-terminale rivolta verso il lume del reticolo endoplasmatico ed una

estremità C-terminale rivolta verso il versante citoplasmatico

Fase di riciclo:

Una volta formata la proteina transmembrana multipasso, le proteine SRP si staccano da essa e tornano

– nel citoplasma dove andrà ad interagire con altre proteine da trasportare

PROCESSO DI N-GLICOSILAZIONE ] Una volta che le proteine tradotte sono state ancorate al reticolo

endoplasmatico (RE) possono incorrere in una prima modificazione definita come “N-glicosilazione”.

La proteina glicosilata è caratterizzata da:

sull'estremità N-terminale della proteina abbiamo la presenza dell'amminoacido asparagina

– caratterizzato a sua volta da un carbonio alfa legato ai quattro classici sostituenti:

- idrogeno

- il gruppo amminico (NH2)

- il gruppo carbossilico (COOH)

- la catena laterale (CH2-CO-NH)

alla catena laterale dell'asparagina viene aggiunta una catena oligosaccaridica formata da 14 zuccheri:

– - 2 molecole di acetil-glucosammina

- 9 molecole di mannosio

- 3 molecole di glucosio

al gruppo carbossilico dell'asparagina si va a legare invece una serina o una treonina attraverso un

– legame di condensazione

Come avviene il processo di N-glicosilazione in dettaglio:

Il processo di N-glicosilazione è cotraduzionale, quindi avviene di pari passo con la traduzione.

Inizialmente via via che la proteina si forma, viene contemporaneamente tradotto un enzima specifico

– chiamato “Oligosaccaril-transferasi”

questo enzima sta nel citoplasma della cellula, dove stanno anche un sacco di zuccheri di varia natura

– legati generalmente ai nucleotidi

l'enzima si lega a questi zuccheri e gli aggiunge in maniera specifica ad una molecola di natura lipidica

– che prende il nome di “Dolicolo”. Prima aggiunge due molecole di acetil-glucosammina, poi aggiunge

nove molecole di mannosio ed infine aggiunge tre molecole di glucosio, per un totale di 14 zuccheri

una volta che ha aggiunto tutti gli zuccheri la molecola di dolicolo tende a capovolgersi di 180 gradi,

– ponendo questi zuccheri verso il versante del reticolo endoplasmatico (meccanismo di flipping)

a questo punto si rompe il ponte difosfato tra il dolicolo e il primo zucchero legato. La rottura del legame

– difosfato genera l'energia necessaria a formare il legame N-glicosidico (legame di condensazione) fra la

catena oligosaccaridica e il residuo di asparagina della sequenza N-terminale della proteina

a questo punto la proteina e la catena oligosaccaridica sono stati legati assieme a formare una

– glico-proteina

Come correggere le glico-proteine mal funzionanti:

Le proteine inserite nel reticolo endoplasmatico, comprese quelle glicosilate, devono assumere una struttura

funzionante, e questo è reso possibile dagli shaperoni molecolari. Tali molecole come abbiamo visto

precedentemente si trovano all'interno del reticolo endoplasmatico ed hanno la funzione di interagire con

determinate proteine instabili e stabilizzarle. Un esempio di questi shaperoni è rappresentato dalla “Calnessina”.

La calnessina è uno shaperone che interagisce con la catena oligosaccaridica della glico-proteina.

Nella fattispecie non interagisce con tutta la catena oligosaccaridica ma si lega solamente ad una delle tre

molecole di glucosio. Le altre due molecole di glucosio invece vengono eliminate per favorire il legame.

A questo punto la calnessina una volta legata induce la proteina ad acquisire la struttura tridimensionale

corretta, stabilizzandola. Una volta stabilizzata la proteina, viene attivato l'enzima “glucosidasi” che elimina

anche l'ultima molecola di glucosio che faceva da ponte fra la calnessina e la glico-proteina, determinando il

distacco della calnessina.

Come smaltire le glico-proteine mal funzionanti:

Ci sono comunque delle glico-proteine che, nonostante siano intervenute le calnessine, non riescano ad essere

stabilizzate. Queste glico-proteine generalmente interagiscono con i traslocatori della membrana del reticolo

endoplasmatico, grazie ai quali vengono trasportate nel citoplasma. Nel citoplasma incontrano una serie di

enzimi del tipo “N-glucosidasi” che rompono il legame N-glicosidico, separando difatto la catena oligosaccaridica

dalla componente proteica. La componente proteica a questo punto viene ubiquitinata e successivamente

indirazzata al proteosoma dove verrà finalmente degradata

TRAFFICO VESCICOLARE ] le proteine che intraprendendo la via secretoria e non vengono ancorate alla

membrana del RER, vengono generalmente trasportati all'apparato del Golgi e successivamente smistate nei

vari compartimenti cellulari come:

lisosomi

– membrane cellulari

– spazio extracellulare

Il trasporto di queste proteine non avviene attraverso la membrana cellulare, ma avviene grazie alle “Vescicole di

trasporto”. Tali vescicole permettono il trasporto delle proteine e di altre biomolecole organiche (lipidi, zuccheri).

Il traffico vescicolare all'interno della cellula si divide in due tipi: la via biosintetica-secretoria e la via endocitica.

1 ] La via biosintetica-secretoria è definita anche come “via esocitica” ed è quella via addetta al trasporto di

proteine e altre sostanze organiche che, una volta sintetizzate, vengono trasportate verso la membrana cellulare

oppure esocitate nell'ambiente extracellulare (esocitosi). Tale via è abbastanza semplice ed avviene in varie fasi:

inizialmente la proteina, lo zucchero o il lipide appena sintetizzato, viene traslocato sulla membrana del

– reticolo endoplasmatico

successivamente tale sostanza viene trasportata dal reticolo endoplasmatico al versante cis del Golgi

– infine dal versante cis la sostanza decorre verso il versante trans. Sul versante trans dell'apparato del

– Golgi si viene a formare una serie di invaginazioni che formano pian piano delle vescicole di trasporto

specifiche dette “Vescicole esocitotiche”. A loro volta tali vescicole permetteranno il trasporto delle

sostanze verso la membrana cellulare o lo spazio extracellulare (Esocitosi)

Quando una sostanza viene esocitata continuamente, allora si parla di “Secrezione costitutiva”.

– Quanto una sostanza viene esocitata con criterio, in base a determinati segnali e stimoli biochimici,

allora si parla di “Secrezione regolata” (esempio del GLUT-4 che è un trasportatore insulino-dipendente,

ossia in presenza di insulina permette il trasporto di glucosio, viceversa no. In tal caso è l'insulina stessa

che funziona da stimolo biochimico per il trasporto del glucosio all'interno delle cellule muscolari)

2 ] La via endocitica è quella via addetta alla rimozione di materiale proteico, lipidico o glucidico dalla

membrana cellulare e alla inglobazione di materiale proveniente dall'ambiente extracellulare (endocitosi).

Tale trasporto è reso possibile da alcune specifiche vescicole di trasporto che prendono il nome di “Endosomi”

(fra i più famosi endosomi abbiamo i “Fagosomi” e le “vescicole pinocitotiche”).

Nello specifico gli endosomi si formano cosi:

inizialmente la membrana cellulare tende a creare una invaginazione verso l'interno

– in questa invaginazione vengono accumulate varie sostanze specifiche provenienti dall'ambiente

– extracellulare

una volta che sono state invaginate tali sostanze, l'invaginazione di chiude verso l'interno e si forma

– l'endosoma (gemmazione) con all'interno le sostanze endocitate.

- Se le sostanze sono liquide l'endosoma prende il nome di “vescicola pinocitotica” ed il processo prende

il nome di “Pinocitosi” (ossia l'endocitosi di piccole quantità di liquidi)

- Se le sostanze non sono liquide, l'endosoma prende il nome di “fagosoma” ed il processo prende il nome

di “Fagocitosi” (ossia l'endocitosi di discrete quantità di molecole di vario tipo)

l'endosoma (fagosoma o vescicola pinocitotica) va generalmente a fondersi con la membrana lisosomale

– e rilascia il proprio contenuto all'interno del lisosoma. Tale contenuto verrà quindi infine degradato dal

pH acido del lisosoma

Come fanno le vescicole a capire dove trasportare il proprio contenuto o che tipo di sostanze devono trasportare?

Ogni vescicola è contraddistinta da un rivestimento di natura proteica che permette di:

favorire la curvatura della membrana cellulare per la formazione di queste vescicole

– promuovere la gemmazione delle vescicole di trasporto

– indirizzare le vescicole dicendo loro cosa trasportare e dove trasportarlo

Tale rivestimento può essere di tre tipi differenti:

1 ] COP-I, riveste tutte quelle vescicole addette al trasporto di sostanze di natura proteica, glucidica o lipidica

che vanno dall'apparato del Golgi al reticolo endoplasmatico

2 ] COP-II, riveste tutte quelle vescicole addette al trasporto di sostanze di natura proteico, glucidica o lipidica

che vanno dal reticolo endoplasmatico all'apparato del Golgi

3 ] Clatrina, è una proteina formata da tre catene amminoacidiche leggere e tre catene amminoacidiche pesanti

che formano all'univoco una struttura chiamata “Trischelio”. I vari trischeli a loro volta si legano fra loro

formando delle strutture proteiche pentagonali ed esagonali che all'univo formano la cosiddetta “gabbia di

clatrina”

La gabbia di clatrina si lega a delle proteine adattatrici dette “Adattine”, presenti sulla membrana

– cellulare. Il legame fra la clatrina e le adattine permette il corretto ripiegamento della membrana

cellulare che forma cosi una invaginazione a forma di canestro da basket, specifica per la molecola da

trasportare

a questo punto all'interno della struttura da basket dei recettori specifici riconoscono e legano le

– molecole da trasportare. Una volta legate, questa struttura a canestro da basket inizia a chiudersi su se

stessa a formare una vescicola di trasporto. Tale meccanismo prende il nome di “gemmazione”.

La gemmazione è resa possibile grazie a specifiche proteine che prendono il nome di “Dinamine”.

– Tali proteine formano una struttura anellare che circonda il colletto della gemma iniziale, e grazie alla

propria attività GTP-asica forniscono l'energia necessaria per avvicinare e fondere fra loro le varie

componenti della gemma al fine di separare la vescicola dalla membrana cellulare

Ricordo che il processo di gemmazione è regolato da alcuni segnali specifici e dalla presenza di

determinate sostanze derivanti dalla PI (Fosfatidil-Inositolo), come la PIP (Fosfoinositide).

La PIP non è uguale nei vari organuli cellulari, e questa differenza è dovuta soprattutto alla posizione

che assume l'inositolo (che è uno zucchero) all'interno della molecola. La posizione dell'inositolo viene

modificata da determinati enzimi del tipo “Fosfatasi” e “Chinasi”. Sostanzialmente in base al tipo di PIP

che si forma, vengono attivate specifiche proteine che regolano il processo di gemmazione. Infatti:

- in presenza di PIP-3 la vescicola rivestita da clatrina andrà incontro a endocitosi (via endocitica)

- in presenza di PIP-4 la vescicola rivestita da clatrina andrà incontro a esocitosi (via secretoria)

una volta formata la vescicola matura, quest'ultima sarà pronta per trasportare il proprio contenuto

– verso i vari compartimenti cellulari. Questo è reso possibile grazie a specifiche proteine chiamate

“RAB”, “Effettori RAB” e “SNARE”

- le RAB, sono delle proteine monomeriche che si trovano sulle vescicole e permettano il suo

avvicinamento con la membrana del compartimento cellulare bersaglio (lisosoma o membrana cellulare)

- le RAB effettori, sono delle proteine che si trovano sulla membrana del compartimento cellulare

bersaglio e permettano il legame fra la vescicola e quest'ultimo

- li SNARE, sono delle proteine che si trovano sia sulla vescicola (V-SNARE) che sulla membrana del

compartimento cellulare bersaglio (T-SNARE) e permettano la loro fusione

Quello che succede è che:

- RAB permette alla vescicola di avvicinarsi alla membrana del compartimento bersaglio

- l'effettore RAB permette quindi il legame fra la vescicola e la membrana del compartimento bersaglio

- a questo punto il complesso V-SNARE presente sulla vescicola ed il complesso T-SNARE presente sulla

membrana del compartimento bersaglio vanno a contatto

- il contatto fra V-SNARE e T-SNARE determina la fusione fra la vescicola e la membrana del

compartimento bersaglio

- a questo punto viene riversato il contenuto dalla vescicola all'interno del compartimento bersaglio

Come avviene il trasporto delle proteine dal reticolo endoplasmatico all'apparato del Golgi?? (COP-I e COP-II)

inizialmente le proteine sintetizzate dai ribosomi del reticolo endoplasmatico (RE) vanno incontro a

– glicosilazione, meccanismo in cui viene aggiunta una catena oligosaccaridica che funge “etichetta di

riconoscimento” per poter essere trasportata all'interno dell'apparato del Golgi.

Le le proteine glicosilate nel reticolo endoplasmatico vengono quindi trasportate all'apparato del Golgi

attraverso delle vescicole specifiche rivestite dalla proteina COP-II

tali vescicole provenienti dal reticolo endoplasmatico, sostanzialmente si fondono fra loro a formare i

– cosiddetti “corpi vescicolari” che si spostano lungo i microtubuli del versante cis dell'apparato del Golgi

a formare dei reticoli definiti come “CGN” (Cis-Golgi-Network). Si è quindi formato il complesso

“CIGRE” (Compartimento Intermedio Golgi-Reticolo Endoplasmatico)

All'interno di questi reticoli le proteine vanno incontro ad una serie di meccanismi volti alla formazione

– di glico-proteine complesse, tramite processi di N-glicosilazione ed O-glicosilazione:

Dalla N-glicosilazione si formano generalmente glico-proteine aventi una catena oligosaccaridica molto

complessa. Il processo di formazione è abbastanza elaborato. Vediamo nel dettaglio:

- inizialmente la catena oligosaccaridica di 14 zuccheri della glico-proteine va incontro all'azione della

glucosidasi I e glucosidasi II che eliminano le tre molecole di glucosio

- successivamente interviene la mannosidasi I che elimina quattro molecole di mannosio

- a questo punto interviene la N-acetilglucosamina transferasi che con l'ausilio di molecole energetiche

aggiungono una N-acetilglucosamina

- successivamente interviene la mannosidasi II che elimina altre due molecole di mannosio

- a questo punto le glicosil-transferasi con l'ausilio di molecole energetiche (CMP e UDP) permettano di

aggiungere alcuni zuccheri come 2 molecole di N-acetilglucosamina, 3 molecole di galattosio e 3 molecole

di acido sialico (detto generalmente anche NANA)

- si è quindi formata una glico-proteine avente una catena oligosaccaridica complessa

Dalla O-glicosilazione si formano delle glico-proteine aventi una catena oligosaccaridica caratterizzata

dall'aggiunta di alcuni residui glucidici (da 3 a 10-15 residui glucidici)

Tali modifiche vengono sostanzialmente fatte per promuovere il ripiegamento delle proteine,

– permettendo una maggiore stabilità di quest'ultime. Generalmente inoltre, la catena oligosaccaridica

complessa tende a formare il cosiddetto “Glicocalice” che forma dei rivestimenti di protezione a livello

degli epiteli, proteggendoli da eventuali microorganismi patogeni

le proteine modificate a questo punto decorrono lungo il versante trans dell'apparato del Golgi

– formando i reticoli TGN” (Trans-Golgi-Network)

una volta arrivata al versante trans dell'apparato del golgi i corpi vescicolari escono dall'apparato del

– Golgi per andare verso i lisosomi o altri compartimenti cellulari

Ricordo che esiste anche una via inversa definita come “Via di recupero”, grazie alla quale alcune proteine

vengono ritrasportate dall'apparato del Golgi al RE, attraverso delle vescicole specifiche rivestite dalla proteina

COP-I. Sostanzialmente quello che succede è che:

ci sono delle proteine caratterizzate da sequenze specifiche dette “Segnali di recupero” che vengono

– riconosciute dalle proteine COP-I

tali sequenze variano a seconda di che si parli di proteine transmembrana o solubili:

– - le proteine transmembrana sono costituite dalla sequenza si recupero “KKXX” costituita da 2 lisine e

altri 2 amminoacidi generici. Tale sequenza si trova nell'estremità C-terminale della proteina.

Tale sequenza si lega direttamente a COP-I e permette il trasporto della proteina dal Golgi al RE

- le proteine solubili sono costituite dalla sequenza di recupero “KDEL” costituita da 1 lisina, 1 acido

aspartico, 1 acido glutammico e 1 leucina. Tale sequenza si trova nell'estremità C-terminale.

Tale sequenza si lega ai recettori-KDEL che a loro volta si legano a COP-I, ed avviene cosi il trasporto

della proteina dal Golgi al RE

ricordo che è fondamentale considerare anche che il RE ed il Golgi hanno differenti affinità per queste

– sequenze (KDEL e KKXX) e questo è fondamentale. Infatti:

- il Golgi ha un alta affinità per le sequenze di recupero, in modo tale da catturare immediatamente

queste proteine e trasportarle nel RE

- il RE ha una bassa affinità per le sequenze di recupero, in modo tale che le proteine vengono

immediatamente rilasciate

la diversa affinità è dovuta fondamentalmente ai diversi valori di pH che sono nel RE e nel Golgi.

Come avviene il trasporto delle proteine dal versante trans-Golgi ai lisosomi??

I lisosomi come abbiamo visto nella prima parte del riassunto sono degli organuli cellulari caratterizzati al

proprio interno da enzimi del tipo “Idrolasi acide” come ad esempio le proteasi, le lipasi, le glucosidasi e le

nucleasi. Grazie a questi enzimi il lisosoma è in grado di degradare qualsiasi molecola internalizzata.

Si definiscono idrolasi acide, proprio perché vengono attivate ad un pH acido che è costantemente mantenuto

grazie alla presenza di pompe protoniche che riversano in maniera costitutiva ioni H+ all'interno di tale

organulo cellulare. È fondamentale infine che il lisosoma sia ben rivestito da una serie di membrane, poiché il

contenuto acido se riversate nel citoplasma ucciderebbe la cellula!!!

L'attivazione degli enzimi idrolitici e il loro trasporto all'interno del lisosoma:

inizialmente questi enzimi sono prodotti a partire dal RE, passano poi per l'apparato del Golgi e da qui

– sono trasportate al lisosoma

Colui che indirizza il trasporto di questi enzimi al lisosoma è definito come “M6F”

– (Mannosio-6-Fosfato). L'M6F è un marcatore che si lega alla catena oligosaccaridica dell'enzima inattivo

tramite una N-glicosilazione. Tale marcatore infatti viene riconosciuto da un recettore specifico che

favorisce l'assemblaggio di vescicole rivestite da clatrina che, una volta gemmate, sono in grado di

trasportare l'enzima inattivo verso la superficie della membrana del lisosoma

una volta arrivate sulla superficie del lisosoma, le vescicole rivestite da clatrine si fondono con alcuni

– endosomi che a loro volta riversano gli enzimi inattivi all'interno del lisosoma

il recettore specifico successivamente viene rimandato all'apparato del Golgi dove verrà riutilizzato

– nuovamente

a questo punto l'enzima inattivo per via del pH acido dell'ambiente lisosomale viene attivato ed è quindi

– in grado di attuare la propria funzione.

Ai lisosomi possono arrivare molecole da degradare da tre vie differenti:

per endocitosi, tramite gli endosomi

– per fagocitosi, tramite fagosomi (vengono degradati batteri o altri corpi estranei)

– per autofagia, tramite gli autofagosomi (vengono degradate alcune molecole in-self che non servono più).

– Generalmente l'autofagia avviene anche quando la cellula sta attraversando un periodo ostile, infatti la

cellula in mancanza di nutrienti tende a degradare alcune macromolecole in-self (come proteine o

carboidrati) al fine di ricavare nutrienti energetici come gli amminoacidi ed il glucosio

1 ] Degradazione delle molecole per endocitosi:

inizialmente la membrana cellulare tende a creare una invaginazione verso l'interno

– in questa invaginazione vengono accumulati le molecole provenienti dal citoplasma

– una volta che sono state invaginate tali molecole, l'invaginazione di chiude verso l'interno e si forma

– l'endosoma precoce che va incontro a gemmazione formando l'endosoma tardivo con all'interno le

molecole da degradare

l'endosoma va generalmente a fondersi con la membrana lisosomale e rilascia il proprio contenuto

– all'interno del lisosoma. Tale contenuto verrà quindi infine degradato dal pH acido del lisosoma

2 ] Degradazione delle molecole per fagocitosi:

inizialmente la membrana cellulare tende a creare una invaginazione verso l'interno

– in questa invaginazione viene inglobato il batterio o il microrganismo

– una volta che il batterio è stato inglobato, l'invaginazione di chiude verso l'interno e si forma il fagosoma

– che va generalmente a fondersi con la membrana lisosomale e rilascia il proprio contenuto all'interno

del lisosoma. Tale contenuto verrà quindi infine degradato dal pH acido del lisosoma

3 ] Degradazione delle molecole per Autofagia:

inizialmente determinate molecole presenti nel citoplasma devono essere degradate dalla cellula

– tali molecole vengono inglobate all'interno di determinate vescicole chiamate “autofagosomi”

– l'autofagosoma va generalmente a fondersi con la membrana lisosomale e rilascia il proprio contenuto

– all'interno del lisosoma. Tale contenuto verrà quindi infine degradato dal pH acido del lisosoma

Esempio di trasporto vescicolare: “Endocitosi del Colesterolo”

Il colesterolo è una molecola idrofoba e quindi per transitare nel sangue (che è un mezzo acquoso), necessita di

lipoproteine di trasporto chiamate LDL. Guardiamo il processo nel dettaglio:

inizialmente la gabbia di clatrina si lega a delle proteine adattatrici dette “Adattine”, presenti sulla

– membrana cellulare. Il legame fra la clatrina e le adattine permette il corretto ripiegamento della

membrana cellulare che forma cosi una invaginazione a forma di canestro da basket, specifica per la

molecola di LDL

a questo punto all'interno della struttura da basket dei recettori specifici riconoscono e legano l'LDL.

– Una volta legata, questa struttura a canestro da basket inizia a chiudersi su se stessa a formare una

vescicola di trasporto rivestita da clatrina. Tale meccanismo prende il nome di “gemmazione”

successivamente la clatrina viene rimossa e riciclata per altri processi. Si forma quindi una vescicola di

– trasporto non rivestita

tale vescicola di trasporto non rivestita, si fonde con un endosoma riversando il proprio contenuto al suo

– interno

a questo punto l'endosoma contenente le LDL si fonde con la membrana di un lisosoma primario, e si

– forma un lisosoma secondario, caratterizzato al suo interno dagli enzimi idrolitici e le LDL

grazie all'azione enzimatica degli enzimi idrolitici vengono degradate le LDL, che rilasciano a loro volta

– il colesterolo all'interno del lisosoma. Quest'ultimo verrà infine metabolizzato ed utilizzato a livello

cellulare PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION )

La PCR è definita anche come “Polimerizzazione a Catena della DNA polimerasi, ed è una tecnica di laboratorio

che permette di amplificare del DNA, ottenendo da quantità minime, grandi quantità di DNA.

Generalmente questa tecnica si basa su due concetti:

sul meccanismo di replicazione del DNA

– sul fatto che il DNA può essere denaturato e rinaturato senza subire alcuna alterazione e senza perdere

– determinate proprietà funzionali. Generalmente quello che succede è che una volta aumentata la

temperatura vengono rotti i legami a idrogeno instauratasi fra le base organiche azotate dei due

filamenti del DNA. Una volta rotti questi legami a idrogeno, la doppia elica del DNA viene despiralizzata

e quindi otteniamo i due filamenti singoli (FASE DI DENATURAZIONE).

Al momento in cui il DNA è stato denaturato, viene riaumentata la temperatura in modo graduale, e

dopo circa un minuto (al massimo), la molecola di DNA riprende la sua normale conformazione a doppia

elica (FASE DI RINATURAZIONE).

[ La temperatura alla quale almeno il 50% delle molecole di DNA sono denaturate prende il nome di

“Temperatura di Melting” ]

Inoltre è possibile avere una idea della conformazione del DNA (se è denaturato o no) grazie alla

spettrofotometria, analizzando il picco di assorbimento. Infatti sia il DNA denaturato che il DNA a

doppia elica presentano un picco di assorbimento a 260nm, solo che il DNA quando va incontro a

denaturazione viene riscontrato un aumento dell'intensità (assorbanza) del picco di assorbimento.

Questo deriva dal cosiddetto “Effetto Ipercromico”. Per capire meglio guardare il grafico sottostante:

PCR STANDARD

Generalità della PCR: La PCR standard sfrutta fondamentalmente la temperatura come fattore per denaturare

e rinaturare il DNA. Generalmente il DNA viene sottoposto a tre differenti temperature:

inizialmente viene sottoposto a 90 gradi centigradi (temperatura di Denaturazione)

– successivamente viene sottoposto a 50-62 gradi centigradi (temperatura di Annealing)

– infine viene sottoposto a 72-75 gradi centigradi (temperatura di elongazione)

Per poter dar vita ad una PCR e amplificare quindi una molecola di DNA, sono necessari tre elementi:

Una molecola di DNA da amplificare, di cui sappiamo esattamente l'entità della sequenza nucleotidica

– Dei Primer complementari all'estremità della sequenza della molecola di DNA da amplificare.

– Solitamente i primer sono costituiti da 18-21 nucleotidi

DNA-polimerasi particolari definite come “Taq-polimerasi”, le quali vengono estratte da un organismo

– termofilo chiamato “Thermus Acquaticus”. Le taq-polimerasi sono delle DNA-polimerasi che riescano a

catalizzare la reazione di polimerizzazione anche a temperature discretamente alte attorno ai 72 gradi

centigradi. A tale temperatura la taq-polimerasi presenta la massima efficienza, e pur effettuando molti

errori, dona comunque risultati ottimali per delle analisi qualitative come la PCR

Guardiamo adesso nel dettaglio il processo di PCR:

Il processo è caratterizzato da ben tre fasi distinte: la fase di denaturazione, annealing e elongazione.

Inizialmente la sequenza di DNA che vogliamo amplificare è sottoposta ad una temperatura di circa 90

– gradi centigradi per un minuto. L'elevata temperatura rompe i legami a idrogeno che tengono uniti i due

filamenti, e questo porta alla despiralizzazione del DNA e alla formazione dei due filamenti singoli

( FASE DI DENATURAZIONE )

dopo la denaturazione, viene fatta calare la temperatura fino a raggiungere un range di 50-62 gradi

– centigradi. La temperatura precisa viene calcolata sulla base della sequenza di DNA da amplificare.

A questa temperatura i Primer si legano in modo complementare alla sequenza di DNA da amplificare

( FASE DI ANNEALING, detta anche FASE DI ACCOPPIAMENTO )

dopo la fase di annealing, viene riaumentata la temperatura fino a 72 gradi centigradi. Tale temperatura

– rappresenta la temperatura ottimale alla quale la taq-polimerasi catalizza la reazione di sintesi del

nuovo filamento a partire dai primer, in direzione 5' → 3'

( FASE DI ELONGAZIONE )

dopo le tre fasi abbiamo quindi completato un ciclo di PCR, e da una molecola di DNA se ne ottengono

– due. Tale cicli vengono ripetuti moltissime volte formando quindi tantissime molecole di DNA.

[ Molecole di DNA finali = 2^n ] con “n”, il numero di cicli di PCR effettuati.

Generalmente all'inizio la resa della PCR è esponenziale, ma la crescita non è infinita. Infatti vi è un numero

massimo di cicli di PCR delimitato da alcuni fattori come la quantità di DNA iniziale, la quantità di Primer

(poiché i primer si esauriscono) e la quantità di taq-polimerasi (poiché i continui sbalzi termici alla quale è

sottoposta limitano pian piano la sua funzionalità).

Al momento in cui non vi è più un aumento della quantità di DNA amplificata, saremo arrivati alla fase di

“Plateau”, che rappresenta difatto la resa massima in termini di resa quantitativa. Graficamente parlando

possiamo rappresentare tre fasi:


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher LOLLO930401 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare con laboratorio e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Magnelli Lucia.

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