Riassunti Bioprocessi

RIASSUNTI BIOPROCESSI

1 CAPITOLO

Le BIOTECNOLOGIE sono tutte quelle tecnologie che prevedono l’utilizzo di

agenti biologici, microrganismi o prodotti del loro metabolismo (metaboliti).

Le BIOTECH migliorano i processi dell’industria alimentare, aumentando le rese

e la qualità.

I mezzi più usati per raggiungere tutto ciò sono le cellule e parti di esse incluse

le proteine e in particolar modo, gli enzimi che rappresentano i veri protagonisti

delle trasformazioni degli alimenti migliorandone le proprietà sensoriali,

l’aspetto e la conservabilità del prodotto.

Esempi:

- BIOTECH NELLA PRODUZIONE DEL PANE sono stai sviluppati ceppi di lievito

che contengono i geni di altri enzimi, quali amilasi che forniscono un impasto

più ricco.

- BIOTECH NELLA PRODUZIONE DEI SUCCHI DI FRUTTA possono essere

migliorati con l’aggiunta dell’enzima pectinasi. Questo enzima è prodotto

Aspergillus.

naturalmente da un ceppo di muffa

I MICRORGANISMI

I prodotti ottenuti dai MO possono essere:

- MO per uso alimentare (ovvero starter per fermentazioni);

- Metaboliti (quelli che derivano dal metabolismo primario o secondario);

- Enzimi (classe di costituenti molto importante);

- Prodotti complessi (coloranti, aromi ecc..)

Curva di crescita microbica

Le fasi sono:

1. LATENZA fase di adeguamento metabolico, il MO sintetizza nuovi

componenti, ATP, ribosomi ecc..

2. CRESCITA ESPONENZIALE aumento esponenziale del numero di cellule;

3. STAZIONARIA velocità di crescita uguale a 0 (la crescita si interrompe

perché le sostanze nutritive sono state consumate)

4. DECADIMENTO o MORTE

Terreni di coltura

I terreni di coltura si dividono in:

- TERRENI SINTEITICI materie prime pure. Impiegati in laboratorio. In



genere forniscoo crescita microbica e produzione di metaboliti limitate.

- TERRENI COMPLESSI materie prime in forma grezza. Sono più



economici.

BIOREATTORE

E’ un sistema isolato, circoscritto, dove il MO può crescere nelle condizioni

desiderate senza il rischio di contaminazioni esterne.

Le principali componenti del bireattore sono:

1. Agitatore costituito da pale che servono per l’agitazione della coltura

microbica.

2. Intercapedine esterna per far fluire l’acqua.

3. Valvole e aperture per il passaggio di sonde di misura di necessari per la

misura di T, pH ecc.

Come funziona:

L’agitazione avviene con le pale, fondamentale per miscelare le cellule e i

nutrienti ma anche per disciogliere al meglio l’ossigeno che viene fornito dal

basso sottoforma di bolle.

Nel caso si tratti di un MO anaerobio viene addizionato azoto al brodo coltura.

I sensori collegati a un computer permettono di raccogliere i dati. Il software

permette anche di definire un valore fisso (di T, Pressione e pH).

Nel momento in cui il sensore capta un calo di pH interviene per correggerlo. La

temperatura, durante la crescita cellulare tende ad aumentare, può essere

abbassata facendo passare acqua fredda.

Tramite una valvola è possibile raccogliere un campione di brodo coltura

mantenendone la sterilità e calcolando la concentrazione di cellule, nutrienti e

prodotti di fermentazione.

FERMENTAZIONE

Un esempio di produzione che utilizza cellule vive è la fermentazione, essa è un

processo ossidativo anaerobico svolto da numerosi organismi coinvolti nella

produzione di numerosi alimenti dove viene creata energia da carboidrati.

Trovano applicazione nell’industria alimentare anche i funghi pluricellulari come

le muffe, responsabili della maturazione di diversi prodotti. Queste favoriscono

lo sviluppo del gusto e dell’aroma dei prodotti stagionati grazie all’azione dei

propri enzimi (lipasi e proteasi).

Batteri, lieviti e funghi esplicano la loro attività per mezzo dei propri enzimi.

Gli enzimi sono utilizzati ampiamente anche isolati, quindi estratti dalle cellule.

Gli enzimi, nel campo alimentare, sono i mezzi attraverso i quali si possono

ottenere i prodotti alimentari trasformati e migliorati.

Esempi: chimosina utilizzata per la produzione di caglio per prodotti caseari; la

pectinasi aggiunta ai succhi di frutta; la bromelaina e altre proteasi utilizzate

per ammorbidire la carne. Tra gli enzimi separabili dal prodotto finito

(immobilizzati), ritroviamo la β-galattosidasi (lattasi) che idrolizza il disaccaride

lattosio nel latte e la invertasi usata per la produzione di glucosio e fruttosio dal

saccarosio.

Gli enzimi utilizzati per la trasformazione alimentare sono estratti dalla loro

fonte primaria: MO, tessuto animale o vegetale.

I MO rappresentano una delle più utilizzate fonti di enzimi: si moltiplicano

velocemente e si possono ottenere le quantità desiderate in tempi brevi.

La quantità di enzima contenuta nei MO è più elevata rispetto a quella presente

negli animali e nelle piante.

In base alle procedure di recupero, i prodotti della microbiologia industriale

possono essere suddivisi in 3 classi:

1. BIOMASSE MICROBICHE la procedura di recupero prevede la separazione

del filtrato colturale dalla biomassa.

2. METABOLITA ESOCELLULARE a questa classe appartengono gli acidi

organici, gli antibiotici, alcuni enzimi, metaboliti che sono estratti dal filtrato

colturale e successivamente purificati;

3. METABOLITA ENDOCELLULARE: a questa classe appartengono alcuni

enzimi, gli acidi nucleici, metaboliti per i quali si procede al recupero previa

rottura delle cellule, dopo aver separato il filtrato colturale.

Procedure per la separazione della biomassa

1. SEDIMENTAZIONE SPONTANEA: è una procedura impiegata solo in limitati

casi. Separazione dei lieviti, nei processi tradizionali relativi alla produzione di

bevande alcoliche.

FLOCCULAZIONE

2. : è una procedura basata sulla formazione di aggregati

cellulari. La tendenza a flocculare è una caratteristica naturalmente presente in

modifica del pH, addizione di

alcuni ceppi microbici, ma può essere favorita da:

un elettrolita (nitrati, cloruri di sodio, calcio, potassio, ferro, alluminio),

addizione di un polimero (adsorbimento delle cellule da parte del polimero, che

può essere sintetico o naturale). Il recupero degli agenti flocculanti non risulta

economico.

FLOTTAZIONE

3. : impiegata prevalentemente con i batteri ed è favorita

dall’immissione di gas nella brodocoltura. Le cellule microbiche rimangono

adsorbite sulle bolle di gas e risalgono nel fermentatore rimanendo

intrappolate nella schiuma, che viene rimossa procedendo al recupero delle

cellule.

CENTRIFUGAZIONE

4. : per la separazione di MO unicellulari basata sulla

sedimentazione gravitazionale forzata. Vengono utilizzati decanter e

centrifughe.

FILTRAZIONE

5. : impiegata soprattutto per MO miceliari. La filtrazione

convenzionale è effettuata con filtri di superficie (cellulosa) e di profondità

(lana di vetro), con ritenzione della fase solida sul filtro e permeazione della

fase liquida.

Recupero metaboliti extracellulari

Dopo la separazione del filtrato colturale, contenente il prodotto, si procede

con:

ESTRAZIONE : prevede il trasferimento del metabolita dalla fase acquosa

(filtrato colturale) ad altra fase (solvente);

CONCENTRAZIONE : per ridurre il volume;

FRAZIONAMENTO : consente di separare la frazione contenente il prodotto ed

eliminare una parte consistente di sostanze estranee.

Recupero metaboliti intracellulari (rottura delle cellule)

Le cellule o i tessuti impiegati sono dispersi in un mezzo liquido appropriato, in

genere una soluzione tampone contenente sali o altri componenti ottimali per

la stabilità del prodotto. Spesso le rotture cellulari sono eseguite con T

relativamente basse (410 °C).

I Metodi più diffusi:

CONGELAMENTO/SCONGELAMENTO

- : durante la fase di congelamento si

formano cristalli di ghiaccio che danneggiano e rompono le membrane cellulari.

SHOCK OSMOTICO

- : dopo il recupero le cellule sono risospese in un mezzo

ipertonico, ottenuto mediante l’aggiunta o di sali o di zuccheri che aumentano

la forza osmotica della soluzione. La soluzione è poi aggiunta a una seconda

soluzione ipotonica. Questo sbalzo di concentrazione, per effetto osmotico,

provoca un assorbimento veloce di acqua da parte delle cellule che si rompono.

LISI CON DETERGENTI

- : il trattamento con soluzioni contenenti detergenti

diluiti può provocare il danneggiamento delle membrane, interagendo con le

porzioni lipidiche e permettendo il rilascio del metabolita.

LISI CON ENZIMI

- : gli enzimi sono in grado di danneggiare la parete cellulare

e di permettere il rilascio del contenuto.

METODI PIU’ DRASTICI:

- SONICAZIONE : gli ultrasuoni possono lisare le cellule.

MORTAI e PESTELLI

- : metodo da laboratorio eseguito con materiale

congelato.

Successivamente dopo queste tecniche si procede con la separazione fisica

attraverso la: CENTRIFUGAZIONE, FILTRAZIONE, CROMATOGRAFIA.

CENTRIFUGAZIONE : metodo di separazione dei componenti di una

sospensione mediante l’effetto di una forza centrifuga. Permette il recupero

della biomassa dai fermentatori e la separazione dei corpuscoli solidi dopo le

operazioni di lisi o altre operazioni di separazione di una sospensione, in cui si

ha una fase solida e una liquida, oppure di una soluzione in cui le due fasi sono

liquide ma caratterizzate da una differente densità.

FILTRAZIONE : separazione di particelle mediante un setto con una

permeabilità selettiva (alcune particelle saranno in grado di attraversarlo, altre

no.

CROMATOGRAFIA : tecnica di separazione in cui ogni componente di una

miscela si ripartisce in modo differente tra due fasi contemporaneamente

presenti e fra loro immiscibili. Le due fasi in base alla loro natura sono definite

come: fase stazionaria, che rimane statica, e fase mobile che si muove

attraverso la fase stazionaria. I componenti, trascinati dalla fase mobile, si

ripartiscono tra questa e la fase stazionaria, permettendo così la loro

separazione.

2 CAPITOLO

M.O COME FONTE PROTEICA

Il MO da utilizzare deve essere: non patogeno, stabile, elevata velocità di

crescita, contenuto in proteina e acidi nucleici, trattamento finale delle

biomasse

BIOMASSE MICROBICHE

Le biomasse microbiche sono un insieme di organismi vegetali o animali

presenti in una determinata quantità, insieme formano una comunità

riproduttiva. Costituiti da carboidrati, proteine e grassi.

Le biomasse microbiche trovano applicazione:

- per il loro contenuto: come fonte proteica non convenzionale (in

alimentazione umana e animale) e per l’estrazione di metaboliti particolari

(lipidi, enzimi, acidi nucleici, vitamine, ecc.);

- per la loro attività: su substrati complessi (lievito per panificazione, colture

starter nel settore alimentare, colture insetticidi, ecc.). I MO entrano nella

catena alimentare (formaggi, funghi, lievito, alghe).

L’utilizzo delle biomasse microbiche presenta, in alcuni casi, limitazioni

d’impiego:

- Contenuto in acidi nucleici, che presenta ampia variabilità, nell’ambito dei

diversi gruppi microbici. Gli acidi nucleici potrebbero creare problemi a livello

metabolico nell’uomo e negli animali;

- Presenza di sostanze tossiche o cancerogene, che residuano dal

substrato;

- Digeribilità, che in alcuni casi è limitata (ad es. presenza di chitina);

- Presentano odori e sapori sgradevoli;

- Possibilità di reazioni allergiche

BIOMASSE DA BATTERI Hanno una crescita rapida. La scelta dei ceppi è

illimitata. pH di sviluppo 5-7. Buon profilo aminoacidico.

Esempi:

Processo BIOPROTEIN-PRONIN

Metilococcus capsulatus

MO:

Substrato: metano

Condizioni: 45°C 24h

Prodotto: biomassa ad alto contenuto proteico. Biomassa recuperata tramite

centrifugazione

Impiegh i: attualmente solo alimentazione animale (salmoni)

BIOMASSE DA LIEVITI raramente patogeni. velocità di crescita elevata

Esempi:

Processo SYMBA

Saccaromicopsis e Candida utilis

M.O:

Recupero: centrifugazione ed essiccamento

Substrato: residui delle lavorazioni delle patate

Impieghi:alimentazione animale

BIOMASSE DA MUFFE raramente tossici e crescita lenta

Esempi:

Processo QUORN

Fusarium

M.O:

Substrato: sciroppo di glucosio

Condizioni: pH 7

Impiego: uso umano. Sostituto delle proteine della carne. Molto diffuso

Le proteine del fungo vengono mescolate con aromi e con albume, e al

prodotto viene data una prima forma. In seguito il prodotto viene vaporizzato e

poi raffredato. Poi si da la forma finale e si procede al surgelamento.

SINGLE CELL PROTEIN (SCP)

Biomasse microbiche ad elevato contenuto proteico. Possono contribuire alla

risoluzione di problemi legati alla carenza delle proteine.

Uno degli esempi di SCP da alghe studiate come fonte alimentare è la:

SPIRULINA.

SPIRULINA

La spirulina è la miglior fonte di proteine vegetali, con un contenuto

proteico pari al 65%, più elevato di qualsiasi altro alimento naturale.

La Spirulina: (Arthrospira platensis Arthrospira maxima)

- è un cianobatterio fotosintetico e

- può essere coltivata in fotobioreattori e vasche

- può raddoppiare la propria biomassa ogni 2-5 gg

- è caratterizzata dalla struttura a spirale, che non dirama mai.

La spirulina in particolare ha:

una quantità di calcio presente superiore a quella contenuta nel latte di circa

-

8 volte;

- 34 volte più ferro degli spinaci. Principalmente è ricca di ferro organico

caratterizzato da alta biodisponibilità. Secondo numerosi studi, per tipologia e

quantità, il ferro della spirulina è in grado di competere con il ferro contenuto

nella carne;

- più di tre volte le proteine presenti nella stessa quantità di fagioli;

- contiene circa più di 20 volte il betacarotene presente nelle carote;

- vitamine quali tocoferolo, Β-carotene, inositolo ed alcune vitamine del gruppo

B;

- discreto contenuto di minerali, tra i quali non rientra però lo iodio, elemento

che abbonda soprattutto nelle alghe marine.

FOTOBIOREATTORI

Sono impianti i coltivazione e produzione di m.o foto sintetici che impiegano il

sistema BIOPLANTEC molto efficace per la coltivazione delle microalghe foto

sintetiche quali pirulina.

L’impianto realizzato in modo da permettere la coltivazione e il raggiungimento

di alte concentrazioni di m.o attraverso l’uso di tecnologie per il controllo

dell’illuminazione, T e pH.

Si possono fare cicli di luce, buio per l’effetto dei fotoperiodi. Luce e Carbonio

inorganico rappresentano i principali fattori di crescita di m.o fotosintetici.

BIOMASSE PARTICOLARI: colture insetticide da Bacillus thuringiensis

L’uso dei pesticidi per controllare gli insetti indesiderati/nocivi si è largamente

diffuso negli ultimi quarant’anni. Si riteneva che con il tempo, in relazione alla

quasi infinita varietà di mo, tutti i composti organici, compresi quelli di sintesi

non presenti in natura, potessero essere biodegradati. Con lo sviluppo dei

pesticidi sintetici è apparso evidente che non tutti i composti organici sono

biodegradabili, con conseguente accumulo nell’ambiente.

L’impiego indiscriminato di pesticidi, nel settore agrario, oltre a presentare

rischi non più sottovalutabili per la salute umana, può modificare in misura

significativa i già precari equilibri a livello ambientale.

Il controllo degli insetti dannosi tramite procedure che prevedono l’impiego di

batteri, funghi, protozoi e virus, in sostituzione degli insetticidi chimici,

presenta numerosi vantaggi:

- sono spesso specie-specifiche;

- hanno costi di produzione contenuti;

- non presentano problemi relativamente a eventuali residui a livello

ambientale.

In alcuni casi, una limitazione all’impiego delle colture insetticide è

rappresentato dalla difficoltà di sviluppare i processi per la loro produzione su

larga scala.

GLI ACIDI ORGANICI

Gli acidi organici sono ottenuti sia dal metabolismo aerobio sia da quello

anaerobio. In teoria, tutti gli acidi organici intermedi del ciclo di krebs possono

essere ottenuti per via microbiologica.

Acidi organici ottenibili dal metabolismo aerobio sono:

- Prodotti intermedi del metabolismo primario aerobio. Ottenibili dal ciclo di

krebs: ACIDO CITRICO, itaconico e fumarico. Non vengono

spontaneamente accumulati.

- Prodotti ottenibili per biotrasformazione sono ad esempio: ACIDO

GLUCONICO prodotto per ossidazione diretta del glucosio.

Acidi organici ottenibili dal metabolismo anaerobio sono:

- Prodotti finali del metabolismo anaerobico, di vera fermentazione. A

questa classe appartengono l’ACIDO LATTICO, PROPIONICO, BUTTIRRICO

e ACETICO. Per questi acidi grassi si ha sviluppo del microrganismo con

una fermentazione del metabolita.

ACIDO CITRICO

- Il 99% della produzione mondiale è ottenuta per via microbiologica.

- In genere per la sua produzione si sfrutta l’attività di alcune muffe, quali

l’Aspergillus niger l’Aspergillus wentii.

o

- Si ottengono buone produzioni usando come materie prime sciroppi di

melasse (da barbabietole o da canna), o altre fonti zuccherine quali glucosio,

fruttosio o idrolizzati d’amido.

- Fino all’80-90 % dello zucchero è trasformato in acido citrico.

- L’acido citrico è prodotto metabolicamente in condizioni aerobie nel ciclo di

Krebs e rappresenta uno degli intermedi delle 8 reazioni del ciclo.

- L’acido citrico è trasformato in isocitrico dall’enzima aconitasi. Questa

trasformazione è influenzata dalla concentrazione di alcuni ioni metallici,

specialmente di Fe2+, che è coinvolto nel meccanismo dell’aconitasi. In

assenza di ferro si verifica il blocco del ciclo di Krebs a livello della formazione

dell’acido citrico, generandone così un accumulo.