Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari, parte 3

Corso di qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano

Mod. qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari

Prof. Roberto Foschino

Parte 3: dai microrganismi indicatori e alteranti alla microbiologia predittiva

© Laila Pansera - 1

Sommario

• Indicatori e alteranti ............................................................................................................................................................ 4
• Microrganismi indicatori di igiene di processo .................................................................................................... 4
• Conta dei mesofili aerobi (carica batterica standard a 30°C, CBS) ........................................................... 5
• Enterobatteriacee (o enterobatteri) ...................................................................................................................... 5
• Stafilococchi coagulasi positivi ............................................................................................................................... 6
• Bacillus cereus ............................................................................................................................................................... 6
• Microrganismi indicatori di contaminazione fecale ............................................................................................ 6
• Escherichia coli ............................................................................................................................................................. 7
• Clostridi solfito-riduttori ........................................................................................................................................... 7
• Enterococchi .................................................................................................................................................................. 8
• Microrganismi alteranti .................................................................................................................................................. 9
• Pseudomonadacee ..................................................................................................................................................... 9
• Batteri acidificanti ...................................................................................................................................................... 10
• Batteri sporigeni aerobi .......................................................................................................................................... 10
• Lieviti .............................................................................................................................................................................. 11
• Muffe .............................................................................................................................................................................. 11
• Microrganismi utili e starters ......................................................................................................................................... 12
• Classificazione funzionale dei microrgansimi ...................................................................................................... 12
• Starters ............................................................................................................................................................................... 13
• Formulazioni di starters nell’industria casearia ..................................................................... 13
• Specie microbiche utilizzate negli starters per prodotti lattiero-caseari ............. 14
• Specie microbiche utilizzate negli starters per salumi ................................................... 16
• Specie microbiche utilizzate negli starters per prodotti da forno ............................. 17
• Caratteristiche tecnologiche degli starters ........................................................................................................... 17
• Microbial challenge test ................................................................................................................................................... 23
• 1. Selezione dei ceppi test ............................................................................................................................... 25
• 2. Scelta del livello di contaminazione ............................................................................................. 26
• 3. Formulazione e preparazione della matrice alimentare ................................................. 26
• 4. Preparazione e la realizzazione dell'inoculo ......................................................................... 27
• 5. Periodo di monitoraggio ........................................................................................................................ 28
• 6. Condizioni di trattamento/conservazione ............................................................................... 29
• 7. Analisi del campione .................................................................................................................................... 29
• Esempio: determinazione delle cinetiche di ceppi batterici su pasta precotta ...................................... 30
• Microbiologia predittiva .................................................................................................................................................. 32
• Modelli matematici ....................................................................................................................................................... 33
• Numerazione dei microrganismi .............................................................................................................................. 33
• Citofluorimetria .......................................................................................................................................................... 34
• Densità ottica: microplate reader ........................................................................................................................ 35
• Bioluminescenza ........................................................................................................................................................ 37
• Modelli deterministici .............................................................................................................................................. 38
• Modelli empirici ......................................................................................................................................................... 40
• Modellazione della curva di crescita .................................................................................................................. 41
• Modelli deterministici .............................................................................................................................................. 42
• Modelli empirici ......................................................................................................................................................... 42
• Software di modellazione ....................................................................................................................................... 45

© Laila Pansera - 3

Indicatori e alteranti

Si classificano i microrganismi in base alla loro funzione (approccio funzionale, non ecologico o tassonomico). Possiamo considerare i microrganismi indicatori o alteranti come microrganismi la cui concentrazione, oppure la concentrazione dei loro prodotti metaboliti, indica uno stato igienico mantenuto in produzione o in distribuzione, oppure lo stato di alterazione di un alimento con essi → posso stabilire se l’HACCP funziona bene, oppure se la shelf life data è opportuna, oppure indicare una contaminazione fecale, ambientale o da manipolazione. Il loro significato è in funzione del processo e del prodotto: la stessa specie o gruppo microbico può assumere un significato diverso in base al prodotto.

Es. devo valutare la sicurezza e la qualità di un panino imbottito; se io facessi la carica batterica standard troverei delle cariche elevatissime, in quanto nel panino non c’è solo la contaminazione da manipolazione, ma c’è anche la presenza dei batteri lattici del formaggio, un po’ di stafilococchi del prosciutto e un po’ di Pseudomonas dell’insalata, e quindi il significato di una conta elevata non ha nulla a che vedere con il significato della conta totale in un altro prodotto, come una conserva, che ha subito un trattamento termico.

Microrganismi indicatori di igiene di processo

I batteri indicatori di igiene di processo (hygiene markers) previsti da Regolamenti UE 2073/2005, 1441/2007, 1495/2017 sono:

• Conta dei mesofili aerobi
• Enterobacteriaceae
• Stafilococchi coagulasi positivi
• Escherichia coli
• B. cereus
• Salmonella (preparati in polvere per la prima infanzia)
• Campylobacter (carcasse animali dopo la macellazione, ma prima del raffreddamento)
• Campylobacter (carcasse di pollo dopo il raffreddamento)

Negli ultimi 3 l’indicazione di igiene e di processo è limitata a ciò che viene espresso tra parentesi.

Conta dei mesofili aerobi (carica batterica standard a 30°C, CBS)

È necessario precisare che si parla di aerobi mesofili, quindi non vengono tenuti in considerazione né gli anaerobi né i termofili e gli psicrofili. Evitare di chiamarla conta totale (perché anche se il terreno non è selettivo, la presenza di ossigeno e la temperatura fanno sì che non si sviluppino tutti i microrganismi, ma solo quelli che possono farlo in quelle condizioni).

La conta dei mesofili aerobi ci dà un’indicazione molto generica della presenza dei microrganismi, può dare indicazione sull’igiene ambientale, a seconda del prodotto. Si fa in:

• Superfici di lavorazione (pulito/non pulito)
• Acqua si fa una valutazione delle popolazioni batteriche di origine ambientale, della falda (incubazione a 20°C, per psicrotrofi) e una valutazione delle popolazioni batteriche di derivazione umana/animale (incubazione a 37°C) se trovo una carica molto elevata a 20°C e poco elevata a 37°C, significa che la contaminazione è dalla fonte, quindi devo intervenire sulla fonte; se invece è il contrario (carica alta a 37°C) significa che la fonte è buona, ma poi ho qualche step successivo che la contamina
• Latte crudo (è pagato anche a qualità microbiologica)
• Carcasse animali (il muscolo dopo la macellazione è pressoché sterile, tutto quello che arriva sulla carne deriva dalla contaminazione ambientale)
• Carni separate meccanicamente, carni macinate
• Alimenti pronti al consumo (ready to eat), questo ha diversi significati in funzione del prodotto finale.

Enterobatteriacee (o enterobatteri)

Enterobacteriaceae: Le Enterobacteriaceae sono una grande famiglia che comprende oltre 50 generi (non solo di origine intestinale, ma anche ambientale), quindi danno un’indicazione molto generica di mantenimento dell’igiene, che ci permette di capire se la detergenza è stata effettuata in modo idoneo o meno, ad esempio.

• Superfici di lavorazione
• Acqua
• Latte pastorizzato
• Latte in polvere, alimenti in polvere
• Gelato
• Carcasse animali
• Uova e prodotti a base uova

Dentro alle Enterobacteriaceae c’è un sottogruppo di coliformi totali (lattosio positive, presentano la β-galattosidasi): Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Rahnella, Serratia. A sua volta, all’interno dei coliformi totali era possibile individuare un altro sottogruppo definito coliformi fecali, anch’essi lattosio positivi ma anche termotolleranti, crescono a 44,5°C cioè possono derivare dall’intestino di un animale a sangue caldo (mammiferi ed uccelli): Enterobacter (alcune specie), E. coli, E. hermanii, Klebsiella (alcune specie). Ad oggi non si fa più questa distinzione ma si parla solo di Enterobacteriaceae come indicatori di igiene e di processo.

Stafilococchi coagulasi positivi

Nel 99% dei casi si tratta di Staphylococcus aureus, presente a livello della pelle di animali a sangue caldo, compreso l’uomo. È considerato indicatore di manipolazione igienicamente non corretta.

• Superfici
• Tamponi
• Latte crudo
• Latte in polvere
• Formaggi da latte crudo o termizzato
• Formaggi freschi
• Gelato
• Prodotti sgusciati di crostacei e molluschi cotti
• Prodotti artigianali (paste fresche, pasticceria, gastronomia, norcineria, caseificazione) in questi casi c’è manipolazione umana
• Alimenti pronti al consumo (Ready To Eat)

La presenza di questo microrganismo è un buon marker grazie alla presenza dell’enzima extracellulare coagulasi (infatti è coagulasi positivo). Le colonie si presentano nere, con un alone di agglutinazione. In provetta la coagulazione del fibrinogeno in fibrina fa sì che il materiale diventi solido, mentre se non c’è la coagulazione (quindi non è presente il microrganismo) rimane liquido.

Bacillus cereus

È un ubiquitario ambientale, è considerato indicatore di scarsa igiene nelle materie prime o nell’ambiente di produzione. Si trova in alimenti in polvere per lattanti e alimenti dietetici in polvere a fini medici speciali destinati ai bambini di età inferiore ai sei mesi. Viene anche utilizzato come criterio qualitativo secondario in altre filiere (indicatore di processo), ad esempio nelle spezie, nei ready to eat, o nei prodotti che subiscono trattamento termico.

Microrganismi indicatori di contaminazione fecale

Ci danno un’idea di una contaminazione di materiale fecale, diretta o indiretta. Questo può sottintendere la presenza di altri microrganismi, come virus o altri batteri patogeni.

• Escherichia coli
• Clostridi solfito riduttori
• Enterococchi (acqua potabile)

Escherichia coli

Esso è considerato l’indicatore di contaminazione fecale per eccellenza perché:

• È costantemente presente nel tratto intestinale degli animali a sangue caldo (anche se non dominante)
• Non è resistente nell’ambiente come altri batteri, quindi non posso considerarlo ambientale
• È facile/rapido da coltivare (24h a 37°C)

Si coltiva in TBX, terreno selettivo legato a un acido galatturonico, che produce una colorazione azzurra. Si trova in (tutti gli alimenti praticamente):

• Acqua
• Bevande
• Molluschi bivalvi
• Carne e prodotti a base di carne
• Formaggi da latte pastorizzato
• Burro e panna
• Prodotti sgusciati di crostacei e molluschi cotti
• Frutta e ortaggi pretagliati
• Alimenti pronti al consumo (Ready To Eat)

È anche considerato criterio di igiene di processo, e potrebbe anche essere considerato patogeno, per via di alcuni ceppi.

Clostridi solfito-riduttori

Riescono a ridurre i solfiti a solfuri, nel caso della coltivazione producono solfuri di ferro, neri, che rendono le colonie ben distinguibili dalle altre. Non tutti i ceppi di Clostridium sono solfito riduttori, ma lo sono:

• Cl. perfringens
• Cl. sporogenes
• Cl. botulinum (alcuni ceppi)

La loro presenza dà indicazione dell’origine della contaminazione fecale, perché:

• Sono costantemente presenti nel tratto intestinale degli animali a sangue caldo (anche se non dominante)
• Sono resistenti nell’ambiente poiché sporigeni, quindi possono indicare una contaminazione fecale passata o precedente al trattamento termico a causa della loro resistenza nell’ambiente, è difficile interpretare il risultato perché possono essere sia contaminati fecali che ambientali; ad esempio nelle acque sono considerati come indicatori di contaminazione fecale lontana.

Si utilizza in:

• Acqua
• Preparazioni a base di carne e di pesce
• Paste fresche
• Prodotti congelati o surgelati
• Prodotti sottoposti a cottura

Negli ultimi 4 casi la determinazione di questo parametro è utile, anche se non viene citato in nessun Regolamento.

Enterococchi

Sono batteri lattici, e si trovano un po’ dappertutto: nell’intestino degli animali, ma anche nell’ambiente, sui vegetali ad esempio. La sua presenza è un po’ ambigua perché possono essere indice di contaminazione fecale o ambientale, infatti c’è un dibattito aperto. Gli enterococchi sono anche causa di infezioni umane, non alimentari. Sono anaerobi facoltativi e psicrotrofi, Gram +, origine intestinale ma tendono a persistere nell’ambiente. Li ritroviamo:

• Acqua
• Carni e prodotti a base carne
• Pesce e prodotti ittici
• Prodotti artigianali (paste fresche, pasticceria, gastronomia, norcineria, salumeria)
• Prodotti refrigerati pronti al consumo (RTE), mantenuti in condizioni anaerobiche

Per tutti i prodotti tranne l’acqua (per la quale è considerato indicatore di contaminazione fecale), la loro indicazione è ancora dibattuta. Sono tipici nei formaggi stagionati da latte crudo (Fontina, Bitto, Montasio), costituiscono il microbiota dominante di tali formaggi. In Val d’Aosta hanno fatto una selezione di ceppi non patogeni da utilizzare eventualmente come starters, qualora nel latte non ci siano.
La ricerca sta andando verso la differenziazione delle specie potenzialmente patogene da quelle non patogene. La specie più patogena è l’Enterococcus fecalis, E. fecium (ma anche altre specie); altre specie invece non costituiscono un pericolo per la salute. La distinzione tra potenziali patogeni e non, dipende dalla presenza di fattori di virulenza: geni che consentono alla specie di aggredire tessuti animali.