Purificazione proteine, tecniche di laboratorio

Purificazione di Proteine Ricombinanti

Proteine ricombinanti sono il risultato del clonaggio di un gene, quindi isolamento di un gene e il suo inserimento in un organismo ospite, la sua espressione in modo da produrre quella proteina in maniera preponderante nell'organismo ospite che quindi è geneticamente modificato.

Le proteine ricombinanti si possono esprimere in batteri o in cellule superiori, per esempio cellule stabilizzate quando per esempio enzimi che si devono produrre hanno delle modifiche post traduzionali come glicosilazioni.

Queste proteine vengono prodotte in questo modo per motivi di studio perché è più semplice mettere appunto dei sistemi di lisi per esempio su E.coli piuttosto che andare alla fonte ogni volta.

Inoltre queste proteine possono essere impiegate in varie applicazioni biotecnologiche in campo medico o anche di altro tipo.

Sistemi di Omogeneizzazione

- Scegliere metodo di lisi

- Scelta del tampone in cui

rompere cellule- Scelta della temperatura che deve essere bassa- Scelta di soluzione isotoniche per esempio saccarosio, glicerolo che evitano movimenti di liquido che possano diluire soluzione- Bisogna usare inibitori di proteasi che bloccano proteasi endogene- Usare agenti riducenti come mercaptoetanolo che mantiene in stato ridotto le cisteine delle proteine per evitare che si formino ponti di solfuro che possono determinare unfolding delle proteine- Si usano composti antibatterici come sodio azide- Si usano detergenti che favoriscono lisi membrana plasmatica

1. Un metodo semplice di omogeneizzazione è il metodo frizionale solido. In un mortaio, il composto viene sottoposto a macinazione con sabbia, polvere di quarzo. Metodo energetico che si usa per cellule vegetali
2. Metodi frizionali liquidi:
   • si rompono cellule con shock osmotico e di pH. In questo caso la cellula scoppiaperchè si trova in un mezzo che porta grande quantità di liquido al suo interno
   • lisi per

congelamento/scongelamento- digestione della parete con enzimi (lisozima che lisa parete cellulare batterica,liticase, zimolase, chitinase- solubilizzazione chimica (acetone, detergenti, agenti caotropici)- sonicazione: uso di ultrasuoni- French press: fare passare cellule sotto pressione all'interno d capillari- Waring Blenders- Omogeneizzazione (potter, frullatore) usano lameSi prende un tessuto, lo si mette in sospensione per separare alcune cellule dal resto,poi si può operare per sonicazione e quindi sottoporre cellule a onde sonore che le rompono; oppure si forzano le cellule tramite forellino sotto pressione che le rompe;oppure detergenti a bassa concentrazione per creare buchi nelle membrane perché detergenti hanno componente lipidica che entra nella membrana che creano fori.Sonicatore: omogeneizzazione con ultrasuoni a elevata potenza. La macchina ha una sonda che è immersa in un backer e che emette ultrasuoni.SEPARAZIONE MEDIANTE VARIAZIONE DELLA

SOLUBILITÀ

Dopo omogeneizzazione abbiamo quello che viene chiamato estratto crudo o grezzo, contiene tutti i componenti cellulari. Le proteine fra loro possono avere diversa solubilità perché solubilità dipende dalle forze che ci sono tra molecole di soluto e tra molecole di soluto e solvente. Si tratta di cambiare questo equilibrio e portare un soluto dall’interazione con un certo solvente o con un altro soluto a un altro solvente. Si tratta di aggiungere un solvente che portai soluti ad aggregare e quindi a precipitare.

L’aggregazione delle proteine varia a seconda della componente idrofobica superficiale della proteina: maggiore è la componente idrofobica, maggiore queste proteine tenderanno a interagire con altre strutture non polari.

I vantaggi di questo metodo sono:

• Riduzione di volume perché noi vogliamo tenerci la nostra proteina e non vogliamo le altre. Se aggiungiamo un solvente questo determina che solo certe proteine si aggregano

e precipitano e noi prendiamo proteine rimaste che non sono precipitate. Se a quest'altra soluzione aggiungiamo un altro solvente abbiamo che a precipitare è la nostra proteina. In questo modo troviamo pellett, cioè grumetto che si forma sul fondo del recipiente. Quando la proteina si trova nel pellett la possiamo risospendere in una soluzione del volume che vogliamo, quindi possiamo ridurre il volume rispetto a quello di partenza. - Parziale purificazione del campione - Adatta a passaggi preliminari Questo metodo spesso si realizza usando Sali, cioè ioni carichi. La forza ionica dipende dalla concentrazione molare delle specie ioniche e dalla carica dello ione. μ = 1/2 S ci Zi^2 Sull'asse delle x c'è la forza ionica, sull'asse y c'è il log della solubilità della carbossiemoglobina. Questa proteina ha solubilità diversa in presenza di diversi Sali perché alla stessa forza ionica, la solubilità dell'emoglobina.molto importanti per comprendere il comportamento delle proteine in soluzione. La solubilità delle proteine può essere influenzata dalla presenza di sali, come l'insolfato di potassio, l'ammoniosolfato e il solfato di magnesio. L'andamento della solubilità non è lineare, ma dipende dalla concentrazione dei sali. A basse concentrazioni di sali si osserva un fenomeno chiamato "salting in", in cui la proteina diventa più solubile. Questo avviene perché le cariche dei sali permettono la dispersione delle cariche della proteina, impedendo la sua associazione con altre molecole di proteina e quindi la precipitazione. Tuttavia, quando si supera una certa forza ionica, si verifica il fenomeno del "salting out", in cui la proteina esce dalla soluzione e precipita. Si ritiene che questo avvenga perché i sali riducono la quantità di acqua che ricopre la proteina, favorendo la sua associazione e quindi la precipitazione. Questi due processi, il "salting in" e il "salting out", sono fondamentali per comprendere il comportamento delle proteine in soluzione.

Molto comuni nella purificazione delle proteine perché sono economici, facili da svolgere, ma hanno anche caratteristiche empiriche.

CENTRIFUGAZIONE

Si basa sull'uso della forza centrifuga per separare delle componenti. La provetta se viene messa a roteare vorticosamente assume una forma orizzontale. R(t) è la distanza della particella dal centro di rotazione e questa distanza cambia nel tempo: più roteo la provetta più il campione si sposterà verso il fondo della provetta. La forza centrifuga è la forza che agisce sulla particella e la porta a spostarla verso il fondo della provetta. G è il campo centrifugo o accelerazione di gravità. La centrifuga ha al centro i rotori che ospitano le provette, c'è un motore regolabile come velocità.

1. Centrifugazione differenziale: separazione in frazioni x centrifugate successive, aumentando gradualmente il campo centrifugato applicato. Se la centrifugazione dura a lungo, si ha una diversa disposizione sul fondo.

dellaprovetta delle particelle: particelle più grandi cadono sul fondo. Centrifugazione non determina una separazione a elevato grado di selettività tra particelle.

METODI CROMATOGRAFICI

Quando si svolgono processi di purificazione per cromatografia si usano delle colonne cromatografiche. La colonna viene preparata con una resina, il campione viene preparato a parte per il caricamento in una siringa e verrà caricato del tampone sulla colonna che verrà quindi sottoposta a un certo flusso. Questo avviene grazie a macchinari che pompano liquido nella colonna. Le proteine verranno iniettate con campione, si legheranno o meno alla colonna e verranno poi diluite e analizzate con diversi metodi. I campioni verranno poi raccolti alla fine della colonna per recuperare le proteine di interesse.

Con la cromatografia si vogliono separare proteine o l'enzima di interesse da tutte le proteine contaminanti presenti.

- Colonne: tubi di vetro chiusi alle due estremità,

permettono al loro interno la presenza di una matrice che ha una consistenza tipo gel, all'interno della quale viaggeranno campioni proteici che noi carichiamo.

- Pompa peristaltica: pompe che creano un movimento continuo di liquido in un tubo flessibile collegato alla colonna. Possono variare la velocità del flusso. Si trovano a monte della colonna, hanno due tubicini: uno che preleva il tampone dai flaconi e l'altro che porta il liquido verso la colonna. C'è una struttura triangolare rotante che preme sul tubicino di gomma e determina lo spostamento di porzioni di liquido al suo interno. Con la pompa si può determinare la velocità del flusso e quindi quanto tampone viene caricato sulla colonna e la velocità della cromatografia.

- Collettori di frazioni: a valle del sistema, dopo il detector. Hanno una struttura a revolver che deve ospitare provette dove cadono gocce che escono dalla colonna stessa. Permettono di raccogliere separatamente il flusso che esce dalla colonna.

è la fase che ci permette di separare le proteine quando vengono raccolte e quindi andare incontro alla loro purificazione. Questi strumenti hanno un cilindro appiattito dove ci sono i siti di alloggiamento delle provette, si può programmare velocità di rotazione perché il tubicino che fuoriesce dalla colonna passa nel detector, va nel collettore di frazioni, passa attraverso un braccio nero che si appoggia su provette e permette di raccogliere i campioni. - Detector: è la fase che ci permette di vedere fisicamente il progredire di questo processo. Ci permette di identificare il campione che viene diluito dalla colonna. Il principio si basa sul fatto che le molecole biologiche sono così piccole da essere invisibili ad occhio nudo quindi noi sfruttiamo alcuni principi fisici per osservarle: la capacità che hanno di assorbire radiazioni nell'UV o nel visibile. I rilevatori più comuni sono piccoli spettrofotometri che emettono luce a una singola lambda (per

esempio 280 nm). In questo modo quando la proteina attraversa il detector si ha un aumento di assorbanza e quindi avremo un segnale che indica l'uscita di una proteina. I detector possono basarsi anche su altri principi come la fluorimetria o la spettrometria di massa, quindi non osservano la radiazione elettromagnetica, ma l'emissione di fluorescenza o la massa dei campioni che vengono diluiti.

La rivelazione avviene quando il detector raccoglie la fuoriuscita dei campioni goccia a goccia sul fondo della colonna e crea una figura chiamata cromatogramma. Sull'asse x è rappresentato il volume diluito dalla colonna o il numero di frazioni, mentre sull'asse y è presente l'assorbimento a 280 nm. I picchi sul grafico indicano che l'assorbanza a 280 nm aumenta man mano che le frazioni vengono riempite o che il volume passa attraverso la colonna stessa. Ciascun picco rappresenta una proteina: se la proteina è pura, il campione ha