Purificazione proteine, tecniche di laboratorio

PURIFICAZIONE PROTEINE

PURIFICAZIONE DI UN ENZIMA

L’interno delle cellule è una specie di gel costituito da tantissime molecole e queste

sono ammassate tra loro. Se noi vogliamo studiare con metodi della biochimica

proteine e enzimi, dobbiamo isolarli da tutti gli altri contaminanti.

Enzima deve essere purificato e deve essere attivo, in modo che noi ne possiamo

misurare le caratteristiche funzionali

Enzima puo’ essere purificato anche perché si devono svolgere delle applicazioni

biotecnologiche: enzima serve a catalizzare reazioni utili e quindi è necessario averlo

in forma pura. LINEE GUIDA PER PURIFICAZIONE

- Bisogna conoscere bene materiale di partenza, cioè la fonte dell’enzima

- Bisogna avere un sistema per seguire il processo man mano che va avanti, cioè

dobbiamo poter misurare l’attività dell’enzima

- Lo schema di purificazione deve essere il più efficace possibile, quindi deve

essere veloce, deve comprendere non troppi passaggi in modo che ci siano

meno possibilità che enzima denaturi.

- Si usano basse temperature per evitare denaturazioni o danni tagli proteolitici a

carico dell’enzima stesso

- I metodi di purificazione si basano su concetti chimico-fisici o su aspetti

funzionali molecolari

- Se siamo in grado di identificare un passaggio di purificazione particolarmente

efficace ci conviene usarlo il più presto possibile in modo da avere un grado di

purezza precoce dell’enzima

TABELLA DI PURIFICAZIONE

Inizialmente il campione è chiamato omogenato grezzo perché il campione biologico

viene distrutto per estrare gli enzimi che lo contengono e poi ci sono i vari passaggi

di purificazione. L’ammonio solfato significa che si usa un sale per la precipitazione,

una cromatografia di scambio ionico, uno di affinità, una per gel di filtrazione e infine

una cristallizzazione.

- Unità totali: tutto l’enzima presente nel preparato. Man mano che svogliamo la

purificazione le unità totali diminuiscono. È difficile che si ottengono le stesse

unità totali con resa del 100%. Questo si deve a diversi motivi: delle unità

totali si possono perdere perché l’enzima si è denaturato o anche perché

durante purificazioni, pur di mantenere l’enzima puro si preferisce di

sacrificare un po’ di unità enzimatiche ancora contaminate con proteine.

Potrebbe succedere che nell’omogeneizzato grezza c’era un enzima e un

inibitore e facendo purificazione abbiamo allontanato inibitore e in questo caso

ci troviamo più unità totali.

- Attività specifica: misura che ci da idea della purezza dell’enzima. All’inizio

attività specifica è bassa. Questo valore non è altro che il rapporto per unità di

ml e i mg per ml di proteina. Ci dà indicazione di quanto enzima c’è nell’intera

preparazione. Se purificazione funziona abbiamo che denominatore diminuisce

perché noi leviamo le proteine che non ci sono più, mentre numeratore

dovrebbe rimanere uguale. Alla fine si ottiene un valore maggiore dell’attività

specifica che indica un corretto processo di purificazione.

- Resa: rapporto tra unità totali del passaggio successivo/unità totali del

passaggio precedente.

- Fattore di purificazione: indice che mi dice quanto è stato efficace un

passaggio di purificazione

Esempio: immaginiamo due contenitori di laboratorio e ogni proteina la indichiamo

con una pallina di vario colore, l’enzima che ci interessa è definito da una pallina

rossa. Il primo contenitore rappresenta la situazione iniziale quando ci sono tutte le

proteine dell’estratto cellulare; il secondo contenitore rappresenta la proteina già a un

certo stato di purificazione. Il numero di palline rosso è costante, quindi le unità totali

sono uguali; il primo contenitore però ha altri enzimi che contaminano preparazione e

contribuiscono alla quantità totale di proteine. In questo caso l’attività specifica (unità

rosse/unità totali) è bassa. Quando noi abbiamo applicato il processo di purificazione,

abbiamo eliminato gran parte delle proteine contaminanti. Quindi attività specifica è

più elevata. PROCESSO DI FRAZIONAMENTO

Quando un enzima deve essere purificato, il primo punto è isolare l’enzima dal resto

del preparato e si fa tramite omogeneizzazione, cioè campione biologico deve essere

rotto perché al suo interno c’è l’enzima. Successivamente si fanno separazioni

mediante variazione della solubilità indotte nel campione o separazione mediante

tecniche cromatografiche.

1. Omogeneizzazione

Consiste nel rompere membrane o parete cellulari che contengono enzimi e rilasciare

componenti intracellulari.

La sua ottimizzazione avviene a seguito di prove empiriche, cioè si fanno prove e si

vede quelle che danno risultati migliori.

Omogeneizzazione cambia a seconda del campione biologico di partenza. In base a

questo si stabilisce metodo di rottura delle cellule, ma anche in base ad altri aspetti:

per esempio se enzima è citosolico o se si trova in un organello. Bisogna infine tenere

conto delle proprietà chimico-fisiche delle soluzioni che si usano in modo che enzima

non venga denaturato durante il processo.

Materiale da esperimento

- Campioni animali (cavie ratti, invertebrati, piante)

- Organi o tessuti isolati

- Cellule batteriche

- Cellule eucariotiche (animali, vegetali)

- Sistemi acellulari

- Organelli isolati

- Molecole isolate

P U R I F I C A Z I O N E D I PR O T E I N E R I C O M B I N A N T I

Proteine ricombinanti sono il risultato del clonaggio di un gene, quindi isolamento di

un gene e il suo inserimento in un organismo ospite, la sua espressione in modo da

produrre quella proteina in maniera preponderante nell’organismo ospite che quindi è

geneticamente modificato.

Le proteine ricombinanti si possono esprimere in batteri o in cellule superiori, per

esempio cellule stabilizzate quando per esempio enzimi che si devono produrre hanno

delle modifiche post traduzionali come glicosilazioni.

Queste proteine vengono prodotte in questo modo per motivi di studio perché è più

semplice mettere appunto dei sistemi di lisi per esempio su E.coli piuttosto che

andare alla fonte ogni volta.

Inoltre queste proteine possono essere impiegate in varie applicazioni

biotecnologiche in campo medico o anche di altro tipo

SISTEMI DI OMOGENEIZZAZIONE

- Scegliere metodo di lisi

- Scelta del tampone in cui rompere cellule

- Scelta della temperatura che deve essere bassa

- Scelta di soluzione isotoniche per esempio saccarosio, glicerolo che evitano

movimenti di liquido che possano diluire soluzione

- Bisogna usare inibitori di proteasi che bloccano proteasi endogene

- Usare agenti riducenti come mercaptoetanolo che mantiene in stato ridotto le

cisteine delle proteine per evitare che si formino ponti disolfuro che possono

determinare unfolding delle proteine

- Si usano composti antibatterici come sodio azide

- Si usano detergenti che favoriscono lisi membrana plasmatica

1. Un metodo semplice di omogeneizzazione è il metodo frizionale solido. In un

mortaio, il composto viene sottoposto a macinazione con sabbia, polvere di

quarzo. Metodo energetico che si usa x cellule vegetali

2. Metodi frizionali liquidi:

- si rompono cellule con shock osmotico e di pH. In questo caso cellula scoppia

perchè si trova in un mezzo che porta grande quantità di liquido al suo interno

- lisi per congelamento/scongelamento

- digestione della parete con enzimi (lisozima che lisa parete cellulare batterica,

liticase, zimolase, chitinase

- solubilizzazione chimica (acetone, detergenti, agenti caotropici)

- sonicazione: uso di ultrasuoni

- French press: fare passare cellule sotto pressione all’interno d capillari

- Waring Blenders

- Omogeneizzazione (potter, frullatore) usano lame

Si prende un tessuto, lo si mette in sospensione per separare alcune cellule dal resto,

poi si puo’ operare per sonicazione e quindi sottoporre cellule a onde sonore che le

rompono; oppure si forzano le cellule tramite forellino sotto pressione che le rompe;

oppure detergenti a bassa concentrazione per creare buchi nelle membrane perché

detergenti hanno componente lipidica che entra nella membrana che creano fori.

Sonicatore: omogeneizzazione con ultrasuoni a elevata potenza. La macchina ha una

sonda che è immersa in un backer e che emette ultrasuoni.

SEPARAZIONE MEDIANTE VARIAZIONE DELLA SOLUBILITÀ

Dopo omogeneizzazione abbiamo quello che viene chiamato estratto crudo o grezzo,

contiene tutti i componenti cellulari.

Le proteine fra loro possono avere diversa solubilità perché solubilità dipende dalle

forze che ci sono tra molecole di soluto e tra molecole di soluto e solvente. Si tratta di

cambiare questo equilibrio e portare un soluto dall’interazione con un certo solvente

o con un altro soluto a un altro solvente. Si tratta di aggiungere un solvente che porta

i soluti ad aggregare e quindi a precipitare.

L’aggregazione delle proteine varia a seconda della componente idrofobica

superficiale della proteina: maggiore è la componente idrofobica, maggiore queste

proteine tenderanno a interagire con altre strutture non polari.

I vantaggi di questo metodo sono:

- Riduzione di volume perché noi vogliamo tenerci la nostra proteina e non

vogliamo le altre. Se aggiungiamo un solvente questo determina che solo certe

proteine si aggregano e precipitano e noi prendiamo proteine rimaste che non

sono precipitate. Se a quest’altra soluzione aggiungiamo un altro solvente

abbiamo che a precipitare è la nostra proteina. In questo modo troviamo pellett,

cioè grumetto che si forma sul fondo del recipiente. Quando proteina si trova

nel pellett la possiamo risospendere in una soluzione del volume che vogliamo

quindi possiamo ridurre volume rispetto a quello di partenza

- Parziale purificazione del campione

- Adatta a passaggi preliminari

Questo metodo spesso si realizza usando Sali, cioè ioni carichi. La forza ionica

dipende dalla concentrazione molare delle specie ioniche e dalla carica dello ione.

μ = 1/2 S ci Zi2

Sull’asse delle x c’è la forza ionica, su asse y c’è log della solubilità della

carbossiemoglobina. Questa proteina ha solubilità diversa in presenza di diversi Sali

perché alla stessa forza ionica, la solubilità dell’emoglobina è molto più bassa in

solfato di potassio, un po’ più solubile in ammonio

solfato e sempre più solubile in solfato di magnesio e

così via.

Andamento non è lineare perché è stato osservato che

proteine seguono due fenomeni opposti che

dipendono dalla concentrazione dei sai.

- Basse (Sali) si osserva fenomeno salting in:

proteina entra nella soluzione e tende ad essere

più solubile. Motivo è che cariche del sale

permettono dispersione delle cariche della

proteina e quindi non è in grado di associarsi con altre molecole di proteina e

quindi non precipita

Quando si supera certa forza ionica si vede che solubilità della proteina diminuisce.

Aumentando una certa (sale) si verifica salting out, cioè proteina esce da soluzione e

precipita. Si pensa che sale riduce quantità di acqua che ricopre proteina. Questo

provoca una tendenza della proteina ad associarsi e quindi a precipitare.

Questi due processi sono molto comuni nella purificazione delle proteine perché sono

economici, facili da svolgere, ma hanno anche caratteristiche empiriche.

CENTRIFUGAZIONE

Si basa sull’uso della forza centrifuga per separare delle componenti.

La provetta se viene messa a roteare

vorticosamente assume una forma orizzontale.

R(t) è la distanza della particella dal centro di

rotazione e questa distanza cambia nel tempo: più

roteo la provetta più il campione si sposterà verso

fondo della provetta

Forza centrifuga è forza che agisce sulla particella

e porta a spostarla verso fondo della provetta.

G: campo centrifugo o accelerazioni di gravità.

Centrifuga: al centro ci sono i rotori che ospitano le provette, c’è un motore

regolabile come velocità.

1. Centrifugazione differenziale: separazione in frazioni x centrifugate

successive, aumentando gradualmente campo centrifugato applicato. Se

centrifugazione dura a lungo, si ha diversa disposizione sul fondo della

provetta delle particelle: particelle più grandi cadono sul fondo.

Centrifugazione non determ