Purificazione proteine

L’affinità di ciascuna

proteina per i gruppi

carichi della colonna dipende dal PH che determina lo

stato di ionizzazione della molecola e dalla

concentrazione dei Sali presenti nella soluzione

tampone. La separazione può essere ottimizzata

variando gradualmente il PH o la concentrazione

salina della fase mobile, in modo da creare un

gradiente di PH o un gradiente salino.

Quando il pH della cromatografia è sotto il pI, la

molecola sarà carica positivamente e interagisce

con una resina a scambio cationico. Quando il pH

della cromatografia è sopra il pI, la molecola sarà

carica negativamente e interagisce con una resina

a scambio anionico.

I processi di scambio ionico che avvengono quando proteine cariche

negativamente sono separate su di una colonna a scambio ionico

L’eluizione ad una concentrazione fissa di controione si chiama eluizione

 isocratica.

Se si ha una variazione continua della concentrazione dei controioni

 durante il processo di eluizione si parla di eluizione a gradiente.

Se la concentrazione dei controioni durante il processo di eluizione viene

 alterata a gradini si parla di eluizione a gradini.

La filtrazione su gel, anche detta cromatografia ad esclusione molecolare,

è una forma di cromatografia su colonna in cui le molecole sono separate in

base alla loro massa molecolare o più esattamente, in base al loro raggio di

Stokes (il raggio effettivo che una molecola ha se gira rapidamente su se

stessa in soluzione).

Le proteine più grandi eluiscono prima di quelle più piccole, un dato che

sembra contrario al senso comune. La fase solida è costituita da granuli di

polimeri intrecciati fra loro che creano al loro interno pori o cavità di

particolari dimensioni.

- Le proteine più grandi non possono entrare nelle cavità e quindi

attraversano la colonna più rapidamente, percorrendo un cammino più

breve, perché escluse dal volume della cavità.

- Le proteine più piccole penetrano nelle cavità e vengono trattenute

quindi impiegano più tempo ad attraversare la colonna.

Questa tecnica può essere

anche utilizzata per

determinare

approssimativamente la

dimensione di una proteina

durante il suo processo di

purificazione.

Lo spazio tra i granuli viene

definito spazio vuoto o vuoti

esterni = V 0

Lo spazio all’interno dei

granuli viene definito V i

La fase mobile riempie tutto

lo spazio fra i granuli (V0) e all’interno dei granuli (Vi).

V + V = V

0 i t

Il volume di eluizione è detto V

e

Ogni molecola ha un determinato

coefficiente di ripartizione che dipende dal suo peso molecolare. Molecole più

grandi hanno coefficienti di ripartizione più piccoli.

La filtrazione su gel può essere utilizzata per:

- scambiare rapidamente il solvente in cui sono sciolte grosse molecole

Bisogna scegliere una fase stazionaria che esclude completamente le

molecole grosse (cioè le molecole grosse vengono tutte eluite in Vo), e

equilibrare la colonna nel nuovo solvente desiderato. Le grosse molecole nel

solvente non voluto vengono quindi caricate sulla colonna e eluite con il nuovo

solvente; le molecole grosse sono eluite prima del solvente originale e escono

dalla colonna nel volume vuoto (V0) nel nuovo solvente desiderato. Questo

metodo può essere utile per rimuovere i sali da un campione di proteina.

- determinare la massa molecolare approssimativa di un composto

Per questo uso è necessario calibrare la colonna per determinare i volumi di

eluizione di proteine con massa molecolare nota.

Questo tipo di cromatografia si basa sulla formazione di legami specifici.

Come matrice nella comatografia per affinità si utilizza spesso l’Agarosio

perchè è chimicamente inerte, ha una alta porosità e ha un grande numero

di gruppi funzionali capaci di formare legami covalenti con i ligandi.

I granuli con cui viene riempita la colonna sono legati covalentemente a un

gruppo chimico chiamato ligando. Quando si aggiunge alla colonna una miscela

di proteine, ogni specie proteica che ha affinità per il ligando si lega ai granuli,

quindi la sua migrazione attraverso la matrice viene rallentata. Dopo aver

lavato via dalla colonna le proteine che non leggano l’ ATP, la proteina rimasta

sui granuli potrà essere eluita con una soluzione contenente un’elevata

concentrazione salina o con il ligando liberò che competerà con quello

attaccato ai granuli, staccando la proteina dalla matrice.

Abbiamo vari esempi di cromatografia per affinita’:

1. Approcci di fusione genica

2. Cromatografia con chelanti di metalli

L’approccio più usato trae vantaggio dal

fatto che tratti di istidine si legano con

forza a metalli come il nickel. Il gene di

interesse viene manipolato geneticamente

in modo che codifichi un’etichetta di

poliistidina (6-8 residui) all’estremità N- o C-

terminale della proteina. La proteina viene

passata attraverso una colonna che

contiene nickel immobilizzato a cui aderisce

e viene eluita con imidazolo, che compete

con l’istidina per il nickel immobilizzato.

3. Cromatografia di immunoaffinità

4. Cromatografia di affinità su DNA

5. Cromatografia con RNA polimerasi

6. Cromatografia mediante poli-(U) (per purificare mRNA!)

L’HPLC utilizza pompe ad alta pressione per

aumentare la velocità delle molecole proteiche

attraverso la colonna, e matrici cromatografiche di

elevata qualità virgola in grado di sopportare forti

pressioni. Non è una procedura molto usata in quanto

è denaturante per le proteine e spesso la

reinaturazione non è tanto efficace. Ovviamente è

un processo che porta un miglioramento nei campioni

che saranno più puliti.

Un gran numero di biomolecole assorbono la luce a

una caratteristica lunghezza d’onda. La misura

dell’assorbimento della luce con uno

spettrofotometro è utilizzata per identificare le

molecole e per valutare la loro concentrazione in soluzione. La frazione della

luce incidente che

viene assorbita da una

soluzione a una data

lunghezza d’onda è

proporzionale allo

spessore della

soluzione (cammino

ottico) e alla

concentrazione della

specie chimica che

assorbe la luce.

Per calcolare la

concentrazione di una

proteina utilizziamo la legge di Lambert Beer.

Lo strumento utilizzato

per la misura

dell’assorbimento della

luce e lo

spettrofotometro:

Il triptofano e la tirosina, e in misura minore la fenilalanina, assorbono la luce

ultravioletta. Questo spiega perché la maggior parte delle proteine

possiedono un caratteristico assorbimento della luce a una lunghezza d’onda

di 280 nm. Questa proprietà delle proteine è utilizzata dai ricercatori per

individuarle e quantificarle.

Il legame del colorante Coomassie Brillinat Blue

G-250 alle proteine provoca uno spostamento

del massimo di assorbimento del colorante da

465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide

(Bradford, 1976).

Il colorante Coomassie Brillinat Blue G-250

forma forti complessi non covalenti con le

proteine tramite interazioni elettrostatiche

con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals. Poiché

l’intensità della colorazione è non lineare in una vasta gamma di

concentrazioni di proteine, è necessario preparare una curva standard per

ogni test. Il colorante viene

preparato come soluzione stock in

acido fosforico. Il metodo è un

semplice procedimento costituito da

un unico passaggio in cui il colorante

viene aggiunto ai campioni e si

determina l’assorbanza a 595 nm. Il

metodo è molto sensibile ed

accurato ed è compatibile con la

maggior parte dei tamponi comuni

(incluso guanidina HCl 6 M e urea 8 M). Alte concentrazioni di detergenti

possono interferire con questo test.

L’elettroforesi delle proteine viene di solito

effettuata su gel costituiti da polimeri con

numerosi legami crociati, come il poliacrilammide.

Questo gel agisce come un setaccio molecolare che

rallenta la migrazione delle proteine

proporzionalmente al loro rapporto carica-massa

molecolare. I gel di poliacrilamide si formano per la

copolimerizzazione di acrilamide e di un agente che

forma legami trasversali (generalmente N,N’-

metilene bisacrilamide) a formare un reticolo

tridimensionale.

Una proteina provvista di carica si muove in un campo elettrico e fenomeno,

detto elettroforesi, offre uno strumento molto adatto per poter

separare le proteine, così come le altre macromolecole, come il DNA e l’RNA.

La velocità di migrazione (v) di una proteina (o di qualunque molecola) in un

campo elettrico dipende dalla forza del campo elettrico (E), dalla Ez

carica netta della proteina (z) e dal coefficiente frizionale (f). =

v

Il coefficiente frizionale f dipende dalla massa e dalla forma f

della molecola che migra e dalla viscosità del mezzo.

Questa procedura non viene utilizzata per purificare grandi quantità di

proteina (esistono metodi più efficaci e spesso le proteine vengono

inattivate dall’elettroforesi). L’elettroforesi viene utilizzata soprattutto

come metodo analitico (permette di separare le proteine e allo stesso

tempo di visualizzarle). Poiché non è spesso pratico caricare volumi

molto piccoli del campione su di un gel da

elettroforesi, si versa un tipo speciale di gel,

detto stacking gel direttamente sopra il gel di

risoluzione. Tale gel ha proprietà che fanno

concentrare le proteine del campione in una

zona sottile sopra il gel di risoluzione,

permettendo una separazione delle proteine

più efficiente.

Lo stacking gel viene polimerizzato con una piccola percentuale di acrilamide

e di bisacrilamide per assicurare un’alta porosità ed è tamponato con

tampone Tris-HCl a pH 6,8, mentre il gel di risoluzione contiene una

percentuale più alta di acrilamide e contiene Tris-HCl a pH più alto (8,8). I

recipienti per il tampone (tampone di corsa) superiori e inferiori usati nel

processo di elettroforesi contengono Tris a pH 8,3 con glicina come

controione.

Un gel è formato da due parti:

- Stacking gel: è la parte più alta a PH basso

- Running gel: è la parte inferiore

Un metodo elettroforetico usato comunemente

per valutare la purezza e la massa molecolare delle

proteine comprende l’uso del detergente sodio dodecil solfato (SDS). Questo

detergente conferisce una carica netta negativa alla proteina, rendendo

insignificante la sua carica intri