Purificazione delle proteine e la loro caratterizzaizone

La dipendenza della differenza del coefficiente di assorbimento destra e sinistra

L R L Rε − ε = α =(1) (2)L R λ λSi dimostra (con la formula 1) che la curva del DC non racconta altro che la dipendenza della differenza delcoefficiente di assorbimento destra e sinistra (kL-kR) in funzione della lunghezza d’onda. Se invece diconsiderare questa equazione in funzione della differenza dei coefficienti di assorbimento, consideriamo ladifferenza degli indici di rifrazione delle due componenti, nL-nR (formula 2), cio che otteniamo è la grandezzaalfa dispersione ottica rotatoriadetta e che altro non è che l’angolo di rotazione (rispetto all’asse della luce59linearmente polarizzata) creato dall’ellisse generata dall’assorbimento differenzialedelle due componenti da parte della molecola otticamente attiva. Quindi le duecomponenti hanno due velocità differenti dentro al nostro campione.Alla base pero questo funziona se ce una sostanza otticamente attiva, se non èlimitazionepresente,Il risultato è che non daranno luogo al DC, per cui la è che è applicabile solo per molecole asimmetriche, molecole chirali. E le proteine sono molecole chirali, perché lo sono gli amminoacidi e sono stereoisomeri di tipo L. Quindi per una sostanza otticamente attiva possiamo definire come differenza di assorbanza per la luce levogira e destrogira. Ma ∆A è anche la differenza dei coefficienti di assorbimento (di estinzione) per coefficienti molari per differenza di cammino ottico. Esprimendo i coefficienti di estinzione in coefficiente di estinzione molare, in relazione alla concentrazione molare potremmo dire di quindi alla fine di cicroismo cellulare possiamo così, usando questo coefficiente, normalizzato su una mole di campione, di mole: ΔA = (A - A ) = (ε - ε )CλL R L R dicroico Possiamo aggiungere che di solito l'effetto non è molto intenso, anzi è molto molto piccolo, così mille simi digrado, come la rotazione, che infatti è nell'ordine dei ma comunque sempre molto importante e ellitticità prezioso. Nonostante la rotazione si esprima in gradi solitamente, in realtà storicamente si parla di mole 3298 dove è uguale a moltiplicato per differenza di coefficienti di estinzione molare destro e sinistro: [θ ] = 3298Δε = 3298(ε - ε )L R vantaggi: Questa tecnica elettroscopica ha tanti • Richiede innanzitutto pochissimo campione, e la misura la facciamo nell'ordine massimo di 30 minuti svantaggio), Ci produce informazioni NON quantitative e non ci da informazioni a livello atomico (è uno ma • qualitative, quindi sono info su strutture, e per cui se la radiazione usata è una UV, ci da informazioni sulla struttura secondaria (alfa elica, foglietto beta e random coils), cambiamenti conformazionali, influenza dell'ambiente sulla forma della proteina, e ci dice anche lo stato di

folding e di denaturazione. Spesso sono tutte informazioni addizionali a altre tecniche, tra cui in primis la cristallografia a raggi X.

• Si può usare anche nella parte visibile dello spettro elettromagnetico e si possono ottenere comunque informazioni importanti soprattutto per le metallo proteine perché ci sono transizioni elettroniche che sono più facilmente determinabili.
• È applicabile a molecole di qualunque massa molecolare, e bassissime concentrazioni più sensibili. È uno dei metodi per l'asimmetria dei campioni, perché l'effetto dicroico lo vediamo solo in caso di molecole asimmetriche e quindi chirali.
• Possiamo aumentare il segnale dicroico aumentando lo spazio in cui il campione interagisce con la radiazione e non è necessario aumentare le concentrazioni, cosa importante perché spesso questo non è facile.

Vediamo ora in che senso concretamente il DC ci racconta usando

unaUVradiazione la struttura secondaria di una proteina. Nel grafico quaaccanto vediamo un tipico profilo di assorbimento tipico di 4 strutturesecondarie tipiche, alfa elica, foglietto beta, random coil e un turn.Sono condizioni ideali in cui lo spettro DC si esprime in funzione della lunghezza d’onda (in ascisse) e infunzione dei gradi di ellitticità molare poste in ordinate. Il range di lunghezze d’onda della luce ideale è tra190-300nm UV lontano, 190-240nme infatti parliamo di onde UV, potendo pero dividerlo in due parti, un traUV vicino 250-300nm.e poi un con lunghezza d’onda compresa tra Vediamo quindi perché si usano uno ol’altro:- UV lontano, si usa questo intervallo 190-300 perche è questo intervallo di onda che genera transizionielettroniche sopratutto nei radicali laterali per darci informazioni conformazionali e strutturali. Le transizionin->π* π->π*.principali che abbiamo sono e La prima vede elettroni dinon legame del carbonile dellacatena principale nel legame peptidico, mentre le transizioni del secondo tipo coinvolgono elettroni π del carbonile del carbonio del legame peptidico. Abbiamo quindi due angoli possibili nel legame peptidico, φ e ψ, e in base a questi angoli variano le transizioni elettroniche in questo range di lunghezze d'onda e quindi vari tipi di transizioni ci raccontano questi angoli della nostra catena e quindi se avremo strutture alfa, beta, coils, turn ecc... Al variare di φ e ψ varia l'intensità di queste transizioni elettroniche, e allora il ragionamento che faremo noi è che partendo dal valore delle transazioni elettroniche possiamo ricavare φ e ψ e valutare la proteina strutturalmente. Quindi per esempio a picco massimo di 210nm abbiamo il picco per il random coil e un minimo negativo a 190nm. Il beta sheet invece ha un picco massimo a 190nm mentre un picco minimo a 210nm. Infine l'alfa elica ha un massimo a 192nm, mentre si

Due minimi, in questo caso, uno a 209nm, e uno a 222nm. Ricordiamo che siamo sempre nell'idealità, nella realtà non abbiamo mai una definizione così nitida, e quindi ci vuole anche esperienza nel valutare e interpretare questi esperimenti. E infatti molte proteine non sono fatte mai di una singola struttura secondaria, ma abbiamo un mix di andamento tra questi andamenti tipici. Infatti tra gli usi che facciamo della tecnica più che altro è la volontà di avere una stima della struttura secondaria che possiamo avere. Non possiamo in realtà affidarci del tutto nei minimi termini per le percentuali di presenza delle varie strutture secondarie, per cui sono spesso dati da "prendere con le pinze". Per questo è di difficile interpretazione a volte il risultato di questi esperimenti. Quindi la parte dei raggi UV lontani, a più piccola lunghezza d'onda e maggiore energia, ci dà informazioni soprattutto sulle strutture secondarie. - UV vicino

ci da altre informazioni, in particolare le informazioni non sono le transizioni elettroniche del legame peptidico (che avvengono in questa sede solo per energie più alte, date proprio dai UV lontani), ma i residui aromatici ponti disolfuro, ciò che ci da le informazioni sono i e che hanno comportamenti spettrali molto definiti proprio nell'UV vicino. Per esempio l'anello della Phe ha un comportamenti tipico intorno a π-π*, 260nm, cosa simile si ha per la Tyr e Trp. Si parla sempre di transizioni elettroniche del tipo e così come prima l'intensità delle transazioni dipendevano di come gli atomi erano disposti dalla collocazione spaziale, cosa che ci dava informazioni sulla struttura secondaria, anche qui in parte abbiamo interazioni di questi gruppi tra loro e altri atomi nello spazio, e quindi possiamo intuire che l'UV vicino ci da informazioni su quanto una proteina è foldata o denaturata. Infatti una struttura foldata vedràche questi residui, S-S earomatici sono circondati da un ambiente e struttura di un certo tipo, che non abbiamo se la proteina è svoltolata e denaturata, e allora cambia proprio il comportamento spettrale. Quindi il comportamento ci dafolding molten globule, informazioni sul della proteina o se si trova in stato di che è quello stato a metà traproteina denaturata e foldata. Lo spettrofotometro per il DC che usiamo è molto sensibile, molto più costoso del normale spettrofotometro, proprio per questa maggiore sensibilità che richiediamo. Visto che la spettroscopia DC si usa per monitorare cambiamenti di strutture secondarie e terziarie o quando passa dallo stato nativo e denaturato o viceversa, e abbiamo detto che sono cose indotte da piu agenti, temperature o agenti denaturanti, possiamo usare il DC per studiare una proteina che ci interessa in particolari condizioni. Possiamo quindi valutare una proteina in varie condizioni, come al variare di pH, di

Forza ionica ecc... È molto importante, nel fare un esempio, per un'azienda che produce farmaci, come l'insulina esogena, sapere che tutti i lotti di produzione del farmaco sono funzionanti correttamente. Per questo si fa una serie di studi, tra cui il DC, test veloce, abbastanza economico che ci permette di stimare con abbastanza affidabilità che due lotti per esempio siano simili e ben funzionanti.

Le condizioni sperimentali che si usano per fare il DC sono una condizione innanzitutto che eviti degli assorbimenti aspecifici, proprio perché abbiamo detto che si parla di picchi di assorbimenti molto bassa. Quindi è importante evitare l'uso di tamponi che assorbono proprio nelle lunghezze d'onda che usiamo, spesso il Tris-HCl infatti va EVITATO, perché assorbe proprio tra 250-190nm. Idealmente poi dovremmo essere in acqua pura, ma abbiamo già visto tempo fa che non sempre è possibile questo. La concentrazione 1µM della proteina poi.

Deve essere intorno a <a> e il tampone in concentrazione inferiore a <a10mM>. Gli spettri che poi raccogliamo con lo strumento si raccoglie in server che ci fanno un analisi abbastanza accurata per darci informazioni abbastanza affidabili per gli studi che volevamo fare. 62

Spettrometria di massa (lez.11.2 e 12 - 26/10 e 29/10)È una delle tecniche cardine con cui possiamo studiare le proteine. Un esempio di cio che possiamo farci è proteomicache usiamo la spettrometria di massa per vedere la per studiare il corredo proteomico di un organismo. Possiamo infatti partire da una coltura batterica o da un estratto di tessuto, estraendo le proteine per centrifugazione e applicare su questo estratto grezzo per esempio l’elettroforesi 2D. A questo punto possiamo ritagliare le bande dell’elettroforesi, digerire le proteine con tripsina e studiare con spettrometria di massa i peptidi generati dalla frammentazione di una proteina, da uno spot in particolare e identificare la proteina.

presente in quello spot specifico.