Purificazione delle proteine e la loro caratterizzaizone

PURIFICAZIONE DELLE

PROTEINE

A.A. 2020-2021

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PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE

Vito Calderone,

INTRODUZIONE alle proteine (lez.1 - 14/09)

Le proteine sono polimeri di amminoacidi di lunghezza molto variabile, da poche decine a diverse centinaia o

migliaia. Qualsiasi essere vivente ha la quasi totalità delle funzioni biologiche governate da proteine. Le

informazioni per la costruzione delle proteine sono contenute nei geni, cioè nelle sequenze di DNA. Le funzioni

sono innumerevoli, strutturali (per esempio la cheratina nella forma dei capelli, tubulina e actina per il

citoscheletro e cosi via), poi funzione di contrazione, come actina e miosina, funzione di riserva, funzione

enzimatica, di trasporto e di segnalazione, ma anche di difesa immunitaria tramite anticorpi.

gruppo amminico gruppo carbossilico

Che cosa è un amminoacido, una molecola fatta da un e un legati a

idrogeno R,

un carbonio centrale detto “alfa” che porta un e un gruppo detto gruppo variabile, unica parte

variabile dell’amminoacido, e in base al tipo di R avremo un tipo specifico di amminaocido. Inoltre il C centrale

stereogenico.

viene detto 20

Gli aminoacidi sono e si raggruppano in famiglie a seconda delle loro caratteristiche chimiche. Abbiamo

per esempio i gruppi R:

polari, per esempio gruppi ossidrili o amminici, come la serina o treonina, la cisteina ha un gruppo tiolico;

• non polari, e non presentano questi gruppi, tiolici, alcolici o amminici, e sono la leucina, valina, glicina,

• alanina, isoleucina, e tutti quelli aromatici eccetto la tirosina;

carichi negativamente (acidi) e possiedono gruppi totalmente ionizzabili, e in forma ionizzata sono in

• forma anionica, per questo sono acidi, e sono acido aspartico e acido glutammico, e possiedono un gruppo

carbossilato privo di un protone rimanendo carichi negativamente, acidi;

carichi positivamente (basici) e sono lisina, arginina e istidina, che possiedono un azoto protonabile che si

• comporta da base. Possiedono una carica netta positiva. essenziali,

Gli amminoacidi naturali sono una ventina, e possiamo pero dire che 8 dei 20 aminoacidi sono

ovvero il nostro corpo non riesce a sintetizzarli e deve prenderli dalla dieta tramite quindi ‘alimentazione.

Altra cosa fondamentale, è che gli aminoacidi per la loro struttura, per il fato di avere un C legato a 4 elementi

C asimmetrico due stereoisomeri

diversi, è un e può avere possedendo infatti attività chirale, e sono gli

L D.

stereoisomeri e Per convenzione lo stereoisomero L si rappresenta mettendo il NH2 alla sinistra del C

centrale e tutto il resto della molecola a destra. Possiamo dire che è verissimo che esistono tutti e due gli

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stereoisomeri per ogni molecola di amminaocido, ma possiamo dire che la natura ha selezionato per ogni

L,

amminoacido solo una configurazione per costruire le proteine, ovvero lo stereoisomero di tipo quelli di tipo

D esistono chimicamente e possono essere sintetizzate, ma in natura non sono presenti. Le nostre proteine

sono solo fatte di amminoacidi levogiri. Quindi va da se che non solo gli amminoacidi sono molecole chirali,

chirali,

anche le proteine stesse sono presentando allora la tipica attività ottica.

Come si legano gli aminoacidi tra loro al fine di formare la catena polipeptdica ? Si fa con interazione diretta

reazione di condensazione

tra un aa e l’altro, tramite una reazione detta che porta alla formazione di un

legame peptidico. Per convenzione si dice che si forma tra un gruppo carbossilico di un aa, con il gruppo

amminico dell’aa successivo nella sequenza. Quindi COOH e NH si condensano liberando una molecola

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d’acqua formando il legame peptidico.

Tralasciando come le proteine vengono sintetizzate, ovvero con processo di trascrizione, traduzione, con il

coinvolgimento di tutti i meccanismi necessari, vediamo adesso l’organizzazione delle proteine.

quattro livelli

Queste hanno di organizzazione:

Primaria:

I. ci dice, non solo quali aa sono presenti a formare la proteina, ma ci dice anche la sequenza

ordinata degli aminoacidi, quindi in che ordine sono legati, a partire dall’N iniziale per arrivare al COOH

finale. È un’informazione fondamentale, perchè ciascuna proteina ha la sua struttura primaria

caratteristica, quindi il processo di comprensione di una proteina inizia proprio da qui, trovare l’ordine di

aa. Questo ci fa avanzare delle ipotesi sulle proprietà chimiche della proteina, perchè gli aa con cui è

costituita sicuramente ci fa intuire le caratteristiche globali della molecola. Potremmo aprire una parentesi

infinita che ci fa capire come la sequenza aa di ogni singola proteina sia il frutto di un processo

evoluzionistico che abbia portato a identificare la sequenza migliore per esplicare quella funzione nel

migliore dei modi, alla massima efficienza. In termini biologici la struttura primaria è codificata e decisa dal

processo di trascrizione del DNA, organizzato in triplette di nucleotidi detti codoni. Possiamo fare un

esempio molto semplice per capire l’importanza della sequenza primaria di una proteina. Per esempio lo

notiamo nell’ambito delle mutazioni della sequenza aminoacidica di una proteina. Una di queste p quella

falciforme.

mutazione che porta alla patologia dell’anemia La mutazione è puntiforme, dove un acido

glutammico in posizione 6 viene scambiato con una valina. Il cambiamento è drastico, cambiamo infatti

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un amminaocido acido, carico negativamente, con un amminoacido

apolare, neutro. Quindi è il massimo della differenza tra due amminoacidi.

Il risultato è che questa banale, all’apparenza, mutazione, causa un

effetto drammatico sulla struttura tridimensionale della proteina, che

assume la conformazione a falce, da cui anemia falciforme. Il danno è enorme, riversandosi in patologie

del sistema cardiovascolare. È un solo piccolo esempio, ma ci sono tantissime patologie causate da una

singola mutazione. Per esempio il danno è enorme se si ha una mutazione simile concettualmente a

carico di una delle proteine regolatrici delle cellule e dei suoi processi replicativi.

Secondaria:

II. ci racconta come gli amminoacidi, organizzati con una struttura primaria specifica si

alfa eliche foglietto beta coils”

organizzano, in sovrastrutture di tre tipi: o o “random (morfologia non

ben definita, né alfa né beta). L’alfa elica è un arrangiamento elicoidale in cui gli aa formano tra di loro dei

legami diidrogeno ogni 4 aa della stessa catena. Il foglietto beta, invece sono due tratti (di due catene

polipeptdiche o della stessa catena) attaccati tra di loro e si formano legami diidrogeno. Da notare che in

un singolo polipeptide possiamo anche avere tute e tre le strutture in concentrazioni piu o meno vaste e

diverse.

Terziaria:

III. è il modo in cui le strutture secondarie appena viste, alfa eliche, foglietti beta, e random coils, si

organizzano e interagiscono tra di loro nello spazio. Queste strutture secondarie quidni riempiono lo

spazio tridimensionale e interagiscono tra loro. Quindi è quella che realmente possiamo considerare come

struttura nativa.

struttura di una proteina, non a caso viene detta La maggior parte delle interazioni che

deboli

abbiamo tra le strutture, secondarie sono (idrofobiche di van der Waals, ioniche), a meno che non

forte

sia il legame disolfuro, allora (covalenti). Anche qui, così come la struttura primaria era un’ “impronta

digitale” della proteina, perchè ogni proteina presenta una ben definita struttura terziaria. Ben definita non

significa solo che le strutture secondarie sono rigide o fisse nello spazio, infatti ci sono anche proteine che

assolvono alla loro funzione biologica solo se non c’è rigidità, per cui si parla di proteine intrinsecamente

disordinate, per cui nella loro conformazione nativa non possiedono una struttura secondaria o terziaria,

men che meno quaternaria, fissa o rigida, ma che proprio per questo possono svolgere la loro funzione

Van der Waals

biologica. Quindi abbiamo interazioni di per esempio tra gruppi radicali che nella struttura

primaria sono lontanissimi, ma che entrano a contatto con le strutture secondarie o terziaria. Lo stesso

ponte di idrogeno

vale per le interazioni di tipo polare, come quelle a dove c’è un idrogeno che, carico

parzialmente positivamente interagisce debolmente con un ossigeno parzialmente negativo di un residuo,

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vicino nello spazio, ma magari lontano nella sequenza primaria amminoacidica. L’idrogeno è meno

elettronegativo dell’ossigeno, quindi legame H—O è polarizzato, quindi l’ossigeno ha una parziale carica

negativa e idrogeno positiva. Questo legame tiene la catena principale stabilizzata in un certo modo

legami ionici.

specifico. Oppure quando abbiamo gruppi carichi abbiamo dei In questo caso abbiamo

residui carichi, tipo acidi e basici che interagiscono tra loro. E infine abbiamo un tipo di legame molto forte

ponte disolfuro

che viene detto che viene a essere generato dalla ossidazione tra

due gruppi tiolici SH di due cisteine affacciate, che perdono quindi due protoni e

due elettroni. Ma così come avviene la reazione di formazione del ponte disolfuro,

e quindi il processo di ossidazione, in realtà è possibile anche la reazione inversa,

ovvero la riduzione del ponte disolfuro per tornare a avere due cisteine,

cheratine

aggiungendo al legame due elettroni e due protoni. Per esempio nelle

abbiamo un’abbondanza di ponti disolfuro e non è da sorprendersi perchè è

evidente che il ponte disolfuro conferisce stabilità e rigidità, per cui la cheratina

infatti la troviamo nelle unghie, o nei capelli, appunto strutture solide.

Quaternaria:

IV. risulta dall’interazione da più catene polipeptdiche che fanno parte della stessa proteina.

Non tute le proteine hanno struttura quaternaria in quanto, se queste semplicemente composte da una

sola catena polipeptdica, non potranno evidentemente avere questo tipo di struttura.

collagene,

Un esempio di struttura quaternaria è la tripla elica del tre eliche che

interagiscono in un modo estremamente rigoroso come vediamo in figura. Quindi

per descrivere il collagene non è sufficiente parlare di struttura primaria, secondaria e

terziaria, perche descrivono una sola catena, ma la molecola in

sé è fatta da tre di queste catene. Oppure troviamo l’insulina e

l’emoglobina. L’insulina per esempio è fatta da una catena alfa e una beta, è quindi un

eterodimero con aa diversi. Quando tratterremo la purificazione di proteine sarà

fondamentale sapere se una proteina ha una struttura quaternaria o meno.

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PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE (lez.2 - 17/09)

È importante fare una breve osservazione, ovvero che nel parlare ora della purificazione delle proteine, ci

dobbiamo mettere nell’ottica che parliamo quasi sempre di proteine che sono state clonate in organismi

eterologhi (per over-esprimerle), con tecniche di biologia molecolare applicata (es. proteina eucariota umana

in un organismo procariota, come un batterio). Ricordiamo per esempio la possibilità di poter andare a far

esprimere una proteina umana per esempio in una cellula di mammifero, quindi nettamente superiore in

termini di specificità rispetto all’espressione in Coli ad esempio. E questo trova motivo nel fatto che ogni

proteina assume la propria struttura nativa, quindi da luogo al folding, per un ben determinato motivo, non

viene assunto per caso, ma avviene in genere in modo enzimaticamente assistito, dagli chaperoni.

Quindi è bene ricordare nel processo di clonaggio, che è importante scegliere la giusta via, ancor prima di

procedere all’isolamento e alla purificazione proteica, per poter poi avere risultati soddisfacenti. Infatti se la

proteina non assume le giuste forme, la proteina diventa non più funzionale. Quindi una proteina ha una

funzione SE la sua forma nativa è corretta, in caso contrario perde la propria funzione biologica, oppure ne

assume un’altra ma non funzionale.

Bisogna approcciarsi a una serie di domande, in primis cosa voglio farci con la proteina purificata e quale è il

migliore materiale da usare. Ovviamente infatti in base a cio che voglio farci non è necessario sempre lo

stesso livello di purezza per esempio. Oggi esistono tre tecniche che usiamo per determinare la struttura di

cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare microscopia

una proteina, una è la la e la

elettronica. Per esempio nella risonanza magnetica ovviamente richiedo una modesta precisione di

purificazione, ma neanche richiedo peró troppa precisione e estrema definizione nella sua purificazione, cosa

che invece viene chiaramente richiesta per la cristallografia a raggi X in cui se non si riesce a avere una

purificazione di efficienza quasi prossima al 100% sarà davvero difficile fare una corretta cristallografia. Il

rischio è che se si sbaglia questo passaggio poi non riusciremo a fare anche allora processi successivi alla

purificazione, e quindi sprecando tempo ma sopratutto soldi. Dopodiche ci interessa sicuramente capire che

contaminanti vanno rimossi, abbiamo quindi solo proteine nel campione (es. abbiamo zuccheri, lipidi ecc...) ?

Poi ci interessa una purificazione su larga scala o basta una piccola quantità ? E ovviamente sono domande

che mi devo porre prima di fare la purificazione, solitamente per esempio se il mio scopo è di sequenziare una

proteina, o fare studi di catalisi enzimatica, non è necessario andare a ottenere tantissima quantità di proteina,

ne basta poca, ma se voglio usare tecniche di biologia strutturale (ottenere mRNA) devo ottenere tanta

quantità di proteina e avere purificazione su vasta scala. Uguale è importante l’ambito delle risorse umane,

quanto lavoro è necessario, quanti strumenti devo usare? E allora la parte economica è evidente che rientra in

gran parte negli studi di laboratorio. Ma poi è importante anche avere un’idea chiara e diretta sulle proprietà

chimico-fisiche delle proteine, per esempio il punto isoelettrico, la natura della proteina, la solubilità, stabilità

ecc... Dobbiamo quindi trovare il giusto equilibrio tra tutto ciò.

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Ora, quali saranno le metodiche, a livello di panoramica generale, di cui avremo bisogno per purificare e

centrifugazione,

caratterizzare in seguito le proteine? Sostanzialmente ci avvarremo di 3-4 tecniche, tra cui i

cromatografia

vari tipi di (per esclusione molecolare, per affinità, a scambio ionico), avremo le tecniche di

filtrazione ultrafiltrazione, elettroforetiche.

e e poi le tecniche Ecco qua uno schema che le riassume:

Sempre prima di approcciarsi a un protocollo specifico dobbiamo avere presente una cosa fondamentale, la

proteina che voglia mo purificare, è già stata purificata da qualcun altro ? C’è già un protocollo per la sua

estrazione, o siamo i primi al mondo a farlo ? La logica fa pensare che se c’è già qualcun altro che jha già

pubblicato il come purificare questa proteina, abbiamo il lavoro già fatto, basta seguire passo passo questo

lavoro. Sicuramente però è molto più avvincente a volte lavorare su proteine nuove, su cui nessuno ha mai

messo mano. Allora dobbiamo cercare di essere noi a fare il protocollo di purificazione, e quindi dobbiamo

standardizzare il protocollo,

essere in grado di renderlo quindi riproducibile sia da noi stessi in un secondo

ridurre il numero di step

momento, che da terzi. Una delle cose fondamentali è di il più possibile, perchè più

manipolazioni facciamo del campione, e più perdiamo il materiale proteico, e non è il caso, partendo infatti

quasi sempre da un materiale già di per se limitato. Ma non solo, se di questa proteina vogliamo fare saggi

mantenere la struttura nativa,

biologici o vari studi strutturali, la proteina deve non possiamo permette che

si denaturi, a meno che non vogliamo occuparci del sequenziamento, per cui non ci interessa in fin dei conti il

mantenimento della funzione della proteina. Prima di iniziare una purificazione abbiamo una marea di proteine,

a diversi pesi molecolari, per cui abbiamo davvero tantissime proteine. Per cui noteremo che dovremo

applicare via via più step purificativi in sequenza che vanno a rimuovere il rumore e l’inquinamento in eccesso.

Per cui arriveremo all’ultimo step di purificazione che porta a avere un campione, sicuramente in parte non

pura al 100% (non sempre ovviamente), ma che chiaramente rispetto all’inizio sarà enormemente più pura.

Vediamo nella figura sotto un esempio, in cui vogliamo arrivare a purificare una proteina, una GGT1, a partire

dal composto iniziale “iper-contaminato”. 7

Quindi, riparliamo ancora degli usuali passi di purificazione, per esempio

partiamo dall’omogeneato, di cui abbiamo per esempio 1L (numeri in

riferimento a un’immagine esemplificativa non importante, alla slide

numero 7) di campione iniziale, in cui c’è un sacco di proteine, decine di

grammi di proteine totali. Via via ogni step porta a dare una diminuzione

netta sia di volume totale della soluzione, sia la massa delle proteine

totali. Infatti partiamo da circa 10.000 mg di proteina, finendo addirittura a 3 mg di proteina in un volume totale

di soluzione addirittura a solo 6ml (partendo da 1L). Quindi, se all’inizio la nostra proteina era una minoranza

arricchita,

su tutta la soluzione, alla fine non solo l’avrò più pura, ma addirittura la avrò anche ovvero l’avrò

de-contaminata dagli inquinanti.

Il grafico accanto ci fa capire come, per esempio, se volessimo purificare una proteina tramite 4 step di

purificazione, e in ciascuno perdessimo il 25% delle nostre proteine, dopo 4 step avremmo solo il 31-32%

delle nostre proteine, quindi sicuramente già fermarsi a uno step in meno o due in meno, se in fin dei conti la

purezza non cambia troppo potremmo fare una strategia con base sulla convenienza. Quindi possiamo

cal