Purificazione delle proteine

La L-Istidina (L-His) e il legame peptidico

Un'altra proteina di particolare interesse è la L-Istidina (L-His), una proteina che nel gruppo R presenta un anello di imidazolo, che può formare, tramite i doppietti liberi dell'azoto, complessi con metalli a doppia carica:

Gli amminoacidi possono unirsi fra loro tramite condensazione grazie a particolari enzimi. La reazione di condensazione forma un legame peptidico, un legame molto stabile, che permette la creazione della struttura della proteina. La stabilità è accentuata dalla delocalizzazione del legame:

La struttura delle proteine

La struttura e conformazione delle proteine è essenziale per comprendere la strategia da adottare per purificarle e separarle. Proteine completamente denaturate avranno infatti perso la loro funzione biologica e non potremmo certo sfruttare la loro affinità per un particolare substrato.

poterle separare da altre. Una breve carrellata delle quattro possibili strutture sarà qui presentata:

• Struttura primaria: La struttura primaria delle proteine consiste in una lunga catena di n residui amminoacidici, disposti come una catenina di perle.
• Struttura secondaria: Questo tipo di struttura è in 2D; gli amminoacidi sono avvolti su se stessi, formando dei particolari motivi. Due sono le principali conformazioni nella α-elica e β-foglietto. La struttura α-elicale è termodinamicamente più stabile della β-foglietto.
• Struttura terziaria: La struttura terziaria ha conformazioni in tutte e tre gli assi (x, y, z). Questa conformazione è retta anche da ponti bisolfuro e da interazioni di Van Der Waals. È la struttura terziaria a permettere il funzionamento biologico di una proteina. Questa struttura è estremamente sensibile al calore (almeno ciò vale per la stragrande maggioranza

delle proteine) e un’eccessiva energia termica del sistema può denaturarla irrimediabilmente.

 Struttura quaternaria

Quest’ultima struttura è un oligomero di più strutture terziarie (subunità). Un ottimo esempio è il tetramero l’Emoglobina (Hb), costituita da due sub-unità alpha(141 residui) e due sub-unità beta (146 residui).

Dimensioni delle proteine

Le dimensioni delle proteine possono variare enormemente. Abbiamo proteine umane formate da poche centinaia di residui amminoacidici come il Citocromo c è macromolecole enormi come la Titina:

La marcata differenza di peso fra il Citocromo c è l’Emoglobina o fra l’Apolipoproteina B e la Titina può essere sfruttata per separarle da una miscela proteica.

Cap.2 -

Metodi di estrazione

L'estrazione della proteina dal tessuto richiede la citolisi dei suoi componenti cellulari. Vi possono essere diversi metodi, come la rottura per via fisica, personicazione o per osmosi. Nell'osmosi si immerge una cellula in una soluzione strettamente ipotonica, la cellula per compensare la drastica differenza di concentrazione salina assorbe acqua dentro di sé, esplodendo per l'eccessiva quantità assorbita. Nella sonicazione si usano particolari vibrazioni dei liquidi (ultrasuoni) per rompere le membrane cellulari. Anche la via criogenica è un modo utile, cristallizzando l'acqua dove sono in soluzione le proteine che si andranno a rompere per la dilatazione del volume dell'acqua.

Tampone di Estrazione

Il tampone di estrazione è necessario per avere la nostra proteina in condizioni ottimali. Il tampone deve avere una bassa temperatura, attorno ai 4°C; generalmente è composto da questi reattivi:

Soluzione

salina con 0,1-0,2 M di forza ionica

Agenti riducenti (ad esempio il glutatione ridotto)

Inibitori della proteasi (la proteasi è un catalizzatore della rottura del legame peptidico)

EDTA (per chetare ioni metallici bivalenti come Mg2+, Ca2+, Fe2+, Cu2+)

Azoturo di Sodio (NaN3, un agente batteriostatico)

Cap.3 - Metodi di Purificazione a bassa risoluzione

Salamoia (Salting Out)

Un metodo poco costoso per separare una miscela di proteine in una soluzione acquosa è la salamoia (tecnica meglio conosciuta come salting out). Nella miscela viene disciolto, in concentrazioni sempre maggiori, un sale, generalmente il (NH4)2SO4, ad alta forza ionica (2 o più cariche). La forza ionica del sale depaupera la superficie delle proteine dalle molecole di H2O, massimizzando le interazioni fra le proteine stesse, formando grandi agglomerati proteici che precipitano.

Precipitazione per pH

Per far precipitare le proteine si può anche sfruttare la concentrazione degli ioni H+

.L'elevata concentrazione di ioni idrogeno modifica la costante dielettrica dell'acqua (l'acqua pura ha una costante di 80 a 20°C), favorendo le interazioni fra le proteine che si agglomereranno portando a precipitazione. Inoltre, la carica netta delle proteine sarà a sua volta influenzata da questa concentrazione di ioni idrogeno:

pI = pH = proteina globalmente neutra

pI < pH = proteina carica positivamente

pI > pH = proteina carica negativamente

Se il pI è uguale al pH la proteina avrà egual numero di gruppi carbossilici deprotonati e gruppi amminici protonati.

Se il pI è minore del pH, la proteina tenderà ad avere più gruppi amminici protonati (carica positiva).

Se il pI è maggiore del pH, la proteina tenderà ad avere più gruppi carbossilici deprotonati (carica negativa).

L'influenza del pH sulla carica netta delle proteine sarà una proprietà chimico-fisica che sfrutteremo.

successivamente su altri metodi di separazione.

Precipitazione per solventi organici

Alcuni solventi organici, come l'alcool etilico (C₂H₅OH), sono ottimi agenti precipitanti per le proteine. Normalmente vengono aggiunti alla soluzione a temperature attorno ai -20°C, per evitare denaturazione della proteina. Non tutti i solventi organici sono agenti precipitanti, la N,N-dimetilformammide è un ottimo solvente delle proteine.

La N,N-dimetilformammide

Precipitazione Termica

La maggior parte delle proteine animali e umane ha un optimum di funzionalità attorno ai 36°C/37°C. Già verso i 45°C la funzionalità è compromessa, mentre la struttura tende a collassare, riducendo la proteina a filamento. Vi sono però alcuni organismi che presentano proteine termo-resistenti, anche sui 90°C; per le caseine del latte occorre portare la soluzione a 140°C. Una miscela di proteine, contenente anche quest'ultime, se fatta

Cap.5 - Metodi di Filtrazione e Ultra-filtrazione

Questi metodi sono usati quando si vuol separare la nostra soluzione dai sali che sono stati usati per far precipitare il solito. Elenchiamone alcuni:

Dialisi

Questo metodo è molto impreciso, ma relativamente veloce ed economico. Consiste nello sfruttare la migrazione osmotica di un soluto. Una soluzione ipotonica, messa a contatto tramite una barriera semipermeabile, con una soluzione ipertonica, farà migrare le sue molecole d'acqua per riequilibrare il dislivello di concentrazione, creando una differenza di pressione. La variazione di pressione può essere calcolata mediante la formula: [ ] = π a RTi

Se la soluzione presenta disciolte molecole che si dissociano totalmente in soluzione (sali o acidi forti), bisogna aggiungere all'equazione il coefficiente di

comuni di 1 o 2 Å. I sali verranno migrati tutti fuori, mente le proteinerimarranno intrappolate dentro la celletta. Anche le molecole d’acqua però verrannomigrate fuori dal contenitore (diametro di una molecola di H O prossimo a 1,4 Å),2questo aumenterà la concentrazione del nostro analita proteico in soluzione. L’unicoinconveniente è che per aumentare la velocità di desalazione, nella celletta vieneaggiunta una ancoretta magnetica e un acceleratore per omogenizzare al massimo lasoluzione, questo può portare ad uno stress meccanico per le proteine, formandoschiuma. Un esempio di celletta Amicon

Cap.6 - Metodi di Purificazione ad alta risoluzione

Questi metodi necessitano di strumenti e procedure molto più sofisticate e costosedelle precedenti. Tuttavia, permettono anche una purezza molto maggiore delcampione, necessaria se vogliamo ottenere cristalli della nostra proteina per studistrutturali tramite raggi X

(cristallografia delle proteine).ElettroforesiQuesta tecnica permette di separare le proteine in base alla loro massa e al loro pI.Una soluzione tampone contenente i nostri analiti viene messa in un gel,generalmente o di agarosio o di poliacrilammide. L'agarosio è consigliato perproteine grandi, mentre la poliacrilammide per proteine più picciole. Su questo gelviene poi fatta passare una corrente elettrica. La corrente farà migrare il nostro analitasecondo la formula: zE=6 πηrv6 πηr E=z vProteine ad alto peso molecolare migreranno molto più lentamente delle proteine piùpiccole, creando bande di separazione.

Struttura del polimero dell'acrilammide

PAGE-SDSLa PAGE-SDS (Elettroforesi su Gel di Poliacrilammide - Sodio Dodecil Soldato)