Estrazione e purificazione delle proteine

Per evitare che la prot venga modificata per ossidazione o

o contaminazione microbica la si conserva a -80° e in gas inerti.

Si usano anche gli inibitori enzimatici, un cocktail di inibitori,

o perché quando si estrae dalle cell vengono rilasciati enzimi

digestivi che fanno da proteasi, quindi dobbiamo impedire

questo processo proteolitico.

Prima di fare la purificazione, bisogna fare la quantificazione della

proteina, perché è possibile che durante l estrazione ci siano stati degli

errori, bisogna assicurarsi di avere una [] della proteina sufficiente

per il sequenziamento o per la formazione dei cristalli per applicare poi la

cristallografia.

Ci sono dei test enzimatici commerciali in grado di misurare la [], il

+ comune è il kit ELISA, che è un saggio immunologico in cui si

usano due anticorpi, uno primario e uno secondario: il primo anticorpo

viene immobilizzato su un supporto solido; viene inserita la

soluzione campione contenente la proteina che si legherà in

modo specifcico a quella categoria di anticorpi e si incuba per un

tot di tempo; si lava per togliere la parte di campione che non si è

legata perché non corrisponde a quella proteina; si inserisce il secondo

anticorpo (step detto coniugazione), che trasporta un enzima tramite

leg cov, l anticorpo sec riconosce il complesso ant prim-prot e lo

lega; si lava per togliere gli anticorpi sec che non si sono legati; si

inserisce un substrato, la cui reazione viene catalizzata dall

enzima; a seconda della quantità di enzima presente e quindi di

proteina, si formeranno + o – prodotti, la quantità dei prodotti è

rilevata da uno spettrofotometro che misura l assorbanza e

ricava la [].

Lo spettrofotometro è in grado di misurare l assorbanza emessa

dai prodotti della reazione del substrato catalizzata dall enzima.

La concentrazione viene calcolata con la legge di Lambert-Beer: l

assorbanza A è definita come il log del rapporto tra intensità del

raggio incidente I è intensità del raggio emesso I quindi è una

0

misura della differenza fra le due intensità e questa è dovuta alla

frazione di intensità assorbita dal mezzo; la lunghezza d onda del fascio

utilizzato deve poter essere assorbita dalla proteina; A è direttamente

proporzionale alla [proteina] c (legata a quella dei prodotti), alla

lungehzza del percorso ottico l che è la lunghezza del mezzo che la

luce deve attraversare e che è nota per un dato spettrofotometro, e

al coefficiente di estinzione o di assorbanza molare e che è tipico

di quella proteina dunque noto. A seconda della c cambia il colore del

fascio emesso.

Si usa anche un controllo positivo e negativo per controllare se ci

sono degli errori fatti dall operatore nella procedura.

Prima di investigare la struttura primaria della proteina dobbiamo

purificare. L estrazione ci permette di avere una miscela di tante

proteine diverse, quindi dobbiamo purificare la soluzione per

suddividerla in tante frazioni proteiche diverse. È impo perché la

sua efficacia determina l efficacia delle tecniche di investigazione della s

3d es crist a raggi x, dato che i cristalli che possiamo usare devono

essere abbastanza puri.

Il metodo +comune per purificare è la cromatografia. Ci sono tante

diverse tecniche cromatografiche. Sono applicabili non solo alle proteine.

La tecnica cromatografica fa uso di una colonna cromatografica, che è

in grado di separare le proteine presenti nella soluzione che viene

fatta passare attraverso di essa. Alla fine troveremo delle soluzioni con

un numero inferiore di gruppi proteici.

- La fase stazionaria è una resina, è la fase statica, che separa le

varie componenti proteiche della soluzione sulla base delle loro

caratteristiche. La composizione dipende dall obiettivo e da

cosa vogliamo separare.

- La fase mobile è quella che si muove all interno della colonna,

ovvero la soluzione proteica o l eluente.

Si seguono 3 step principali:

1) L attivazione della fase stazionaria. Essa è una fase solida, è

formata da sfere di materiali inerti, ogni sfera viene funzionalizzata

attraverso gruppi funzionali o anticorpi o biomolecole che fungono da

ligandi, questi legandi interagiscono con le proteine perché hanno una

certa affinità per le proteine, quando questa affinità è alta queste

sfere interagiscono e si legano con tante proteine.

2) Il loading step ha l obiettivo di creare un certo numero di interaz

deboli tra prot e fase staz. La fase mobile è il buffer in cui viene

solubilizzata la miscela e viene aggiunta e fatta scorrere lungo la colonna

attraverso la fase staz. Le proteine +affini si muovono +lentamente a

causa dell alto numero di interazioni rimangono nella parte alta della

colonna, quelle -affini si muovono +velocemnete e finiscono sul

fondo, quindi le varie componenti proteiche vengono separate lungo

la colonna. Tutti i possibili tipi di interaz sono deboli, in questo

modo possiamo poi rimuovere le proteine dalla fase staz

idrolizzando questi leg durante l eluizione. Il tipo specifico di interaz

dipendono dal ligando: leg idrofobici, ionici, interaz complementari con

gli anticorpi, leg H.

3) eluizione o lavaggio o washing, ovvero l idrolisi dei leg deb tra

prot e fase staz, e favoriamo l uscita sequenziale delle componenti

dalla colonna. Usciranno prima le componenti che si trovano + in

basso e dopo quelle che si trovano +in alto.

Cambiamo la fase mobile che è l eluente, contenete dei reagenti

appositi per idrolizzare questi leg. Il tipo di eluente dipende dalla fase

staz. Es per proteine idrofiliche, all inizio uso un eluente molto idrofobico,

poi meno idrofobico e poi infine idrofilico per ottenere le frazioni in

successione. Quindi l eluente diventa un competitor della fase

stazionaria. Nella figura, la prima frazione sarà rappresentata dalla prot

verdi poi quelle lineari e poi quelle blu. Ogni frazione conterrà

proteine con caratteristiche simili.

Si possono usare anche colonne molto lunghe. Si può usare la pressione

atmosferica oppure si possono generare alte pressioni tramite

pompe che permettono di avere velocità di flusso basse e costanti e

un tempo di separazione minimo tra le frazioni, come la HPLC (High

Pressure Liquid Chromatography). L HPLC è uno strumento che possiede

delle pompe che controllano la velocità di flusso nella colonna e la

mantengono bassa incrementando l efficienza della separazione delle

prot (300nL/min e colonne nanocromatografiche). Il modulo pompa

si trova nella parte superiore contiene 2 pompe, una che controlla lo

step di loading (loading pump) e una per lo step di eluizione (NC

pump). Il modulo di autosampler in basso inietta la soluzione

durante il loading e controlla la temperatura a 5° per mantenerne la

stabilità. Tutte le frazioni sono raccolte e poi analizzate tramite uno

spettrofotometro, che si trova internamente allo strumento, che eccita

le frazioni con una lunghezza d onda di 280 nm alla quale si eccita il leg

peptidico, le prot rilasciano energia per l eccitazione e l assorbanza

viene registrata.

Ion Exchange Chromatography (IEX):

La fase staz ha affinità con gli ioni, prot cariche + o -.

Le proteine hanno un loro punto isoelettrico che riflette la presenza di

cariche e dipende da esse, quando si trovano nel pI sono allo stato di

zwitterioni e quindi neutre, quando si trovano a un pH diverso dal pI

(quando il pI è diverso dal ph fisiologico) allora acquistano delle

cariche per la loro capacità di buffering. Le prot anioniche hanno

car neg, perché sono formate prevalentemente da aa acidi, hanno

pI<7 (acido, perché devono sentire un ambiente acido attorno per non

comportarsi da acidi e non assumere carica- sull R). Le prot cationiche

hanno car pos, perché sono formate principalmente da aa basici, hanno

pI>7 (basico).

Nella AEX (Anionic Exchange Chromatography) la fase staz ha car pos

per legarsi con le prot anion, per es grazie a una fase staz con

gruppo amminico NH2NH3+. Nella CEX (Cationic EX) la fase staz

ha car neg che si leg alle prot cat, per es con gruppi carbossilici

COOHCOO-. Quindi il nome della tecnica cromatografica indica la

carica della proteina che vogliamo legare alla fase staz ed è opposta

rispetto alla car della fase staz. Se la carica è di segno opposto e ce ne

sono tante allora le interazioni saranno tanto maggiori e forti quanto

maggiore è la quantità di car, qunidi staranno in alto. Le cariche di

stesso segno verranno respinte e staranno in basso. Quelle neutre

saranno nel mezzo perché né attratte né respinte in quanto non dotate

di car.

Si tratta di interazioni elettrostatiche, leg ionici. Quindi le prot

vengono separate a seconda del pI ovvero della carica. L affinità della

fase staz per le prot dipende dal

- pH in relazione al pI, che determina la carica presente in

segno e numero

- dalla forza ionica ovvero la [sali].

Durante il loading step si diluisce

la miscela proteica in una

soluzione a pH fisiologico per

preservare le cariche delle prot,

cioè si usa una bassa [] di sali,

perchè sono fonte di cariche che

potrebbero interferire con le prot

modificando il ph.

Durante l eluizione, vogliamo

idrolizzare le interaz ioniche, quindi

introduciamo un competitor per le

prot, cioè aumentiamo la [] di

ioni di sali. All inizio abbiamo

bisogno di basse [] di sale per

rilasciare le proteine della prima

fazione sul fondo, poi dobbiamo

aumentare progressivamente la

[] di ioni. Il tipo di ioni dipende

dalla fase staz e dal tipo di

cromatografia. Es in una AEX, nell

ordine le proteine che escono

sono prima quelle pos, poi quelle

neutre, infine quelle anioniche.

Nella CEX il contrario.

Reverse Phase Chromatography (RPC):

La fase staz separa sulla base delle interazioni idrofobiche. La fase

staz è formata da sfere di silice (SO2) o polistirene, perché riesce a

formare sfere molto piccole, oppure si usa un supporto inerte, e queste

sono funzionalizzate con catene idrocarburiche alifatiche o

aromatiche molto lunghe, come le catene lineari C18, perché

interagiscono con gli aa idrofobici. Gli aa idrofob si trovano al centro

delle prot, perché durante il folding le prime interazioni sono

quelle idrofobiche dovute alla presenza dell acqua circostante e

formano il core idrofobico, non è facile raggiungere questa zona

interna, quindi il ligando adopera lunghe catene che riescono ad

accedere all interno della prot.

La fase mobile è una soluzione acquosa per promuovere la

formazione del core idrofobico. La % di aa idrofobici determina il

numero e la forza dei legami che la prot forma con la fase sta