Proteomica e Metabolomica

Proteomica e genomica

Isolamento, separazione, analisi, identificazione

RP-HPLC, spettrometria di massa, campione HPLC (cromatografia), CZE (elettroforesi capillare), IP-HPLC, 2D (bidimensionale), peso molecolare, concentrazione proteica, 1D (monodimensionale), IEF (P.I), saggio di Bradford, concentrazione DNA, SDS-PAGE, sequenza amminoacidica, relativa (sempre), qualitativa, quantitativa, semiquantitativa. Questo è uno schema di come si agisce in proteomica.

Che cosa si fa in proteomica?

La proteomica è l’insieme di tutte le proteine che possiamo trovare in un compartimento cellulare. La proteomica è importante più che altro per la ricerca perché è cambiata l’ottica e l’obiettivo. Inizialmente si lavorava studiando l’effetto di una singola proteina, ad esempio studiando l’effetto della proteina emoglobina e proteine vegetali del fotosistema, cioè si cercava di isolare questa proteina da contesto e se ne studiava la funzione, la struttura, le malattie, le patologie e così via.

Adesso questo è cambiato, è cambiata l’ottica perché tutte le proteine sono state studiate abbastanza, anche l’emoglobina è abbastanza sfruttata e ormai si sa quasi tutto. E cambiando l’ottica, questa è cambiata in questo senso, cioè non si fa più la ricerca di una singola proteina, ma si va alla ricerca di tutte le proteine, per quanto riguarda l’emoglobina nel sangue, quindi si studiano tutte le proteine del sangue, proteine di membrana, che la membrana del globulo rosso è ricca di proteine tipiche della membrana, oppure le proteine del cloroplasto. Quindi non si isola più soltanto la proteina, ma si isola l’organo e si studiano tutte le proteine di quell’organello o organo, perché è stata fatta anche la proteomica del fegato ad esempio.

Con la proteomica intendiamo andare a cercare sempre i metaboliti per esempio, di un determinato processo, che può essere la glicolisi, il ciclo di Krebs, i pentosi fosfati, e andiamo a vedere in una cellula tumorale che cosa succede ai metaboliti relativi per esempio al ciclo di Krebs, perché è chiaro che alla base di tutto c’è sempre uno studio bibliografico. Sappiamo che nelle cellule tumorali aumenta la glicolisi e diminuisce il ciclo di Krebs, perché c’è poco ossigeno e quindi si va più nella via della glicolisi (respirazione anaerobica), allora è chiaro che se facciamo un confronto tra cellula normale e cellula cancerosa, andiamo a vedere come variano questi metaboliti.

La proteomica avvolge tutto, soprattutto perché deriva dalla genomica, che studia, piuttosto che un singolo gene, l’insieme dei geni che determinano la malattia. Però ormai la genomica è più sfruttata, perché si è fatto il sequenziamento del DNA, quindi ormai sul DNA e sul gene si sa un po’ tutto e poi come disciplina è più facile della proteomica, studiarla in laboratorio, perché siccome i geni sono fatti da DNA, dobbiamo andare sempre a livello molecolare, il DNA è fatto da pochi tipi di atomi (carbonio, azoto, idrogeno). Invece le proteine hanno 21 amminoacidi, più le combinazioni e modifiche post-traduzionali, in più gli enzimi, gli ormoni, quindi sono esponenzialmente più numerose rispetto agli elementi che costituiscono il DNA, per cui la proteomica è sicuramente più complicata della genomica.

Come si fa uno studio di proteomica e genomica?

Ci sono tre step fondamentali:

1. Isolamento del campione da analizzare

Quindi l’isolamento ci porta al nostro campione, che consideriamo sempre eterogeneo (campione che contiene tante molecole). Il nostro campione contiene una quantità determinata di proteine, ed è importantissimo sapere quante proteine ci sono, quindi la loro concentrazione proteica, che viene espressa in mg/mL e non in molarità, perché abbiamo una miscela di proteine e non sappiamo il peso molecolare, quindi la molarità, che presuppone la conoscenza del peso molecolare, si fa sulla singola proteina, quindi quando abbiamo delle miscele non possiamo parlare di molarità, ma parliamo di mg/mL oppure di g/L, che è la stessa concentrazione, cambiano i volumi.

Quindi 10mg/10mL = 10 g/10L = 10g/10 mL (quest’ultimo è il più concentrato). La concentrazione proteica è indispensabile, quindi, per sapere quante proteine abbiamo, perché quelle proteine in base alla quantità ci pregiudica la separazione. Che tipo di separazione devo utilizzare per questo tipo di proteine? Un conto è se abbiamo 10 proteine e un altro conto è se abbiamo 1000 proteine, devo scegliere il tipo di separazione migliore.

Come si fa la concentrazione proteica? La concentrazione proteica si fa con il saggio di Bradford, quando si calcolano le concentrazioni proteiche o le concentrazioni delle sostanze non si ha mai un valore assoluto, cioè quando estraiamo i cloroplasti partendo da un chilo di spinaci, quindi possiamo dire che le proteine che troviamo sono relative al chilo di spinaci e non a tutti gli spinaci del mondo, poi generalizziamo, cioè se abbiamo un chilo di spinaci è possibile avere questa concentrazione proteica, ma non è mai assoluta.

È assoluta quando facciamo un esperimento dall’inizio alla fine, cioè facciamo una coltivazione di spinaci, facciamo la concentrazione proteica di tutto un ettaro di spinaci e andiamo a vedere quale è la concentrazione in quell’ettaro e allora possiamo un pochino più generalizzare, perché abbiamo utilizzato una quantità di campione elevata. Quindi le concentrazioni proteiche e le quantità delle sostanze contenute in determinati organelli sono sempre relative.

Quindi quando andiamo a calcolare la concentrazione proteica del nostro campione con il metodo di Bradford, facciamo un’analisi quantitativa. Quindi l’analisi è relativa, qualitativa e quantitativa. L’analisi della concentrazione proteica è relativa sempre, invece è o qualitativa o quantitativa. Qualitativa in un certo senso è approssimativa, cioè non sappiamo precisamente quant’è, è una cosa che possiamo stabilire ad occhio, possiamo dire più intenso e meno intenso; invece quantitativa è quando la misuriamo, quindi la quantità precisa delle nostre proteine.

Per calcolare la nostra concentrazione proteica, siccome relativa vuol dire che dobbiamo avere un riferimento, il riferimento è il chilo di spinaci, però non useremo tutto prenderemo 10 g, allora siccome non siamo sicuri a chi riferire la concentrazione proteica la riferiamo a una curva standard, cioè ad un composto, ad una proteina di cui sappiamo tutto. Si usa la proteina albumina (BSA) di riferimento di cui sappiamo la concentrazione, la struttura, e quindi poi il riferimento a quest’albumina facciamo la determinazione proteica.

Una volta che il nostro campione è isolato, sappiamo quante proteine ci sono dentro, passiamo alla tecnica di separazione.

2. Separazione

Ci sono vari tipi di separazione in base alla varietà di proteine. Abbiamo l’HPLC (cromatografia ad alta pressione), anche qui si sono sviluppate tante tecniche, oggi ci sono le separazioni cromatografiche che avvengono nei capillari del diametro di 50-70 nm. Quindi l’HPLC può essere preparativa, analitica e capillare e sono tecniche strumentali. Poi abbiamo la CZE (elettroforesi capillare) e sono anche queste tecniche strumentali.

Invece la 2D (bidimensionale) e la 1D (monodimensionale) sono sempre tecniche elettroforetiche, ci sono però più manuali, dove gli errori dipendono più dall’operatore più che dallo strumento perché una volta che è iniettato basta che funziona bene. Diciamo che la proteomica è nata quasi esclusivamente con la 2D, significa che il nostro campione, siccome si presuppone che siano almeno 150-200 proteine nel nostro campione, allora le dobbiamo separare con due dimensioni, cioè dobbiamo utilizzare due parametri per separare le varie proteine, i parametri sono relativi al campione.

Il primo che posso usare è l’IEF (A), che si basa sul punto isoelettrico, quindi significa che le proteine del nostro campione non possono essere denaturate, cioè ridurla alla sequenza amminoacidica, però se dobbiamo fare la prima dimensione, l’IEF si basa sul punto isoelettrico delle cariche superficiali delle nostre proteine, se la proteina la svolgiamo non vediamo più niente, per cui si fa un’elettroforesi che si chiama elettroforesi nativa, in pratica non si usano detergenti, perché il detergente scioglie la struttura terziaria e secondaria della proteina e arriva alla struttura primaria.

La seconda dimensione sfrutta un altro parametro, una volta che abbiamo separato le proteine per IEF, succede che ho una serie di pozzetti, separo le mie proteine in base a IEF, a questo punto la seconda dimensione, che sarebbe un SDS-PAGE (B), con un bisturi andiamo a tagliare e le andiamo a rovesciare su un gel SDS-PAGE, una alla volta.

(A) IEF 1 2 (B) SDS-PAGE
più pesante
meno pesante

Il risultato è che quelle proteine separate in base al punto isoelettrico adesso vengono denaturate e separate in base al peso molecolare, siccome sono proteine native possono essere anche dei complessi, per cui da ogni banda possiamo ottenere quelli che vengono chiamati spot, cioè più proteine. Presumibilmente questi spot saranno singole proteine, non sempre è così. Quindi otteniamo quella che viene chiamata mappa 2D (bidimensionale).

Nella direzione orizzontale cambia il punto isoelettrico, se facciamo quello è acido è da 5 a 7, invece se facciamo quello basico è da 2 a 10, quindi vediamo che gli spot aumentano il punto isoelettrico; se la lastra la leggiamo verticalmente la leggiamo in base al peso molecolare, ovviamente ci sarà uno standard che va da 50 kDa a 500 kDa.

Ora il discorso del 2D è relativo, cioè la 2D la possiamo fare con qualsiasi tecnica che ci interessa, basta che lo stesso campione lo trattiamo in due modi diversi, in questo caso lo stesso campione IEF e SDS, ma possiamo fare anche una separazione cromatografica usando due colonne diverse, anche in questo caso in HPLC possiamo raccogliere il campione con la prima separazione e riiniettarlo per una seconda separazione.

Il concetto di 2D è un concetto che si può applicare sempre basta che lo stesso campione viene analizzato con due tecniche diverse che si basano su due principi diversi. Per esempio, l’HPLC può essere di vario tipo perché si può separare sotto vari parametri, possiamo fare una separazione HPLC sfruttando la presenza di amminoacidi idrofobici, quindi diciamo che facciamo una HPLC in fase inversa (RP-HPLC), sfruttiamo il fatto che utilizziamo delle colonne, perché in HPLC per separare i campioni utilizza delle colonne, che sono colonne che riescono a trattenere tutti gli amminoacidi idrofobici, quindi quelle proteine che contengono gli amminoacidi idrofobici le vediamo alla fine della corsa.

Quando è finita la corsa, tutte le proteine separate le possiamo raccogliere e le possiamo riiniettare in HPLC utilizzando un altro metodo, cioè quello dell’accoppiamento ionico (IP-HPLC), quindi anche in questo caso abbiamo fatto una separazione cromatografica in 2D.

Quindi il 2D non è solo IEF e peso molecolare, ma può essere di tutti i tipi, basta che sfruttiamo due parametri per uno stesso campione di separazione. Naturalmente, molto semplicemente, la 1D è un’elettroforesi, a volte il nostro campione è povero di proteine, cioè è un campione che contiene poche proteine, per esempio 7-8 proteine, questo soprattutto quando si fa l’immunoprecipitazione, a volte è importante conoscere gli interattori di una proteina, cioè una proteina da sola non fa niente, però se interagisce con altre proteine dello stesso compartimento è in grado di avere una funzione specifica, allora abbiamo la necessità di capire quali sono le proteine che interagiscono con la proteina principale e quindi si fanno delle immunoprecipitazioni, si conosce l’anticorpo per questa proteina, e questa proteina si trascina dietro gli interattori, cioè le proteine che gli servono affinché esplichi la sua funzione, in questo caso vogliamo sapere quali sono gli interattori che non si conoscono, si sa la funzione della proteina, si sa che da sola non ha questa funzione, ma si vuole capire chi interagisce e ci mandano questo immunoprecipitato.

Gli interattori di una proteina nell’immunoprecipitato non possono essere 100, sono sicuramente molti meno, allora in questo caso scegliamo le vie di separazione, non scelgo una bidimensionale perché sono troppo poche le proteine che ho, quindi andiamo a fare la 1D, che sarebbe un’elettroforesi monodimensionale.

Nell’elettroforesi monodimensionale ci sono più pozzetti, andiamo a vedere l’immunoprecipitato, facciamo l’elettroforesi denaturante, l’immunoprecipitato lo smembriamo nei suoi componenti e andiamo a vedere quali sono le sue proteine e andiamo a determinare la sua sequenza amminoacidica.

3. Analisi

Tornando al fatto che le analisi possono essere quantitative e qualitative, quando facciamo l’elettroforesi bidimensionale o monodimensionale vado a fare un’analisi qualitativa, di questi spot possiamo dire quale è più intenso, ma quanto ce ne sta non lo possiamo dire, potremmo fare una cosa, prendiamo quella lastra e metterla sotto un densitometro, che è uno strumento che ha una specie di lampada che ha le sue lunghezze d’onda. Noi sappiamo che le proteine leggono a 280 nm perché legge gli anelli aromatici, allora si presuppone che queste proteine abbiano degli amminoacidi aromatici, mettiamo questa lastra sotto una lampada UV e andiamo a vedere l’impulso, il picco, e in questo caso possiamo fare una semiquantitativa.

Quindi qualitativa è l’osservazione, quantitativa la quantità e in mezzo ci si inserisce un’analisi semiquantitativa, perché in questo caso possiamo prendere il nostro gel, farlo passare sotto la lampada UV, che ha un densitometro e possiamo rilevare gli impulsi, cioè l’assorbimento viene determinato con un impulso elettrico, e quindi andiamo a rilevare l’impulso elettrico che proviene dall’assorbimento della nostra proteina rispetto al raggio UV.

Mentre quando andiamo a fare cromatografie HPLC di qualsiasi tipo, in questo caso il risultato sono dei picchi e l’analisi è quantitativa, tant’è vero che sull’HPLC ci si basano tutti i dosaggi farmaceutici, cioè i dosaggi dei farmaci vengono fatti tutti con l’HPLC.

4. Identificazione

Se a un certo punto possiamo sapere quanto componente, quanta proteina c’è nel nostro campione totale, con queste tecniche, non possiamo sapere chi sono questi componenti. Se partiamo dai tilacoidi di spinacio, facciamo la concentrazione proteica, separiamo le proteine del cloroplasto, possiamo dire se c’è uno in più rispetto a un altro, ma non possiamo dire quali sono, quindi andrò a fare l’identificazione.

Dobbiamo identificare le proteine che abbiamo separato. Come si fa un’identificazione? L’identificazione si fa con la spettrometria di massa, che ci permette di determinare il peso molecolare, che generalmente è identificabile come un finger printing, però ci sono anche le isoforme che più o meno hanno lo stesso peso molecolare, quindi non basta il peso molecolare, ma bisogna fare la sequenza con la spettrometria di massa. Quindi determiniamo il peso molecolare e facciamo la sequenza amminoacidica.

Lo spettrometro di massa, da solo, è uno strumento che si basa sul rapporto massa-carica, sulle cariche elettriche della sostanza, però l’introduzione del campione può essere fatto direttamente, cioè prendiamo il nostro campione iniziale e non gli facciamo fare tutto il passaggio di separazione, ma lo prendiamo direttamente così com’è e lo mettiamo in massa, quindi dal primo passaggio possiamo andare direttamente all’ultimo. Questo tipo di iniezione si chiama infusione diretta, che la faccio quando il nostro campione di partenza contiene pochi composti, perché lo spettrometro di massa è in grado di vedere, se ci sono 10 proteine, le vede tutte e 10 insieme, cioè non abbiamo la necessità di separarle, perché le vede comunque, perché ogni proteina si ionizza in modo diverso.

Siccome il principio base della massa è quello di ionizzare, produrre degli ioni, gli ioni di una proteina sono diversi dagli ioni di un’altra, per cui anche 10 proteine le vede tutte e 10 insieme e ci dà 10 risultati e ci fa la sequenza amminoacidica di 10 proteine. Quindi l’infusione diretta nel caso, per esempio, degli immunoprecipitati di cui parlavamo prima, quelli li possiamo iniettare direttamente in spettrometria di massa, senza fare la separazione.

Se il nostro composto, invece, contiene 100 proteine non possiamo più fare l’infusione diretta, allora dobbiamo passare attraverso la bidimensionale cromatografica o gel elettroforetica. In questo caso, però, l’identificazione dipende se parto dal gel bidimensionale o se parto da una separazione cromatografica. Se vogliamo optare per una separazione cromatografica l’HPLC lo mettiamo vicino alla massa, direttamente il nostro campione separato, dall’HPLC entra in massa, questo tipo di analisi si chiama HPLC on-line.