Appunti di Proteomica - modulo dell’esame Omics di SBV

Tutto questo vale SOLO SE SI CONOSCE UN PEPTIDE PERCHÉ SI RICOSTRUISCE IN SILICO LO

SPETTRO DI MASSA/MASSA.

Come fare se invece non si conosce la sequenza?

Inizialmente si prova a sostituire ogni posizione con ogni AA (es. prima tutte le A, poi tutte le A tranne

l’ultima dove si inserisce C …). Così facendo però, per un peptide di soli 10’ aa, significa creare miliardi

di spettri di massa, fino a trovarne uno teorico, in silico uguale a quello sperimentale.

Negli anni si è quindi cercato di porre rimedio a questo problema, fino a quando non si è arrivati alla

conclusione che “il peptide di nostro interesse era già presente in banca dati” e che quindi, sapendo

con quale enzima si è digerito il campione, era possibile fare lo spettro massa-massa dei peptidi già

presenti in banca dati, in modo da poterli poi confrontare con quelli sperimentali.Si è dunque

rovesciata la medaglia: partire dagli spettri teorici per poi matcharli con quelli sperimentali e non

viceversa.

In questo modo infatti si ricuce il numero di combinazioni da studiare.

Per ridurle maggiormente è possibile poi ridurre la tipologia di “parent ion” che si possono avere (per

es. indicando l’enzima con cui si ha digerito) e ancora scegliendo la banda dati solo della specie di

riferimento.

Si ottiene dunque un valore, detto “x correlation”, un

logaritmo, ed è tanto più alto quando è maggiore la

probabilità che lo spettro teorico matchi quello

sperimentale.

A questo punto, per poter identificare non ho più solo il

peso dei peptidi, ma anche la loro sequenza. In questo

modo si risale poi alla proteina iniziale. 32

Come programma per il match si utilizza MASCOT, il quale restituisce uno SCORE.

N.B. nella sequenza di ogni proteina però ci sono parti in comune con le altre; per es. una sequenza

che consente alla proteina di legare il NAD.

Tuttavia, ci sono anche parti delle proteine dette PEPTIDI UNICI, unici per quella proteina. Su questo

si basa la SHOT GUN PROTEOMIC.

Effettuare la Shot Gun Proteomic significa partire da tutte le proteine di una cellula, senza dividerle e

identificarle in base ai “peptidi unici” (almeno uno, meglio due).

In questo modo si riesce ad ottenere nome e cognome di una proteina, si ottengono o però in questo

modo anche Tera di dati e le analisi possono richiedere fino a un mese.

SEQUENZA UNICA= parte, anche piccola di peptide, tipica di una e una sola proteina

Limite: i peptidi unici devono essere presenti in banca dati, devono esserci i genomi e le analisi devono

comunque un punteggio, per cui una probabilità.

QUAL È LA DIFFERENZA FRA MS-MS E MS ?

1

La MS-MS è sicuramente più sicura, consente di avere delle

sequenze anche di proteine con modificazioni post-traduzionali e

consente di fare DE NOVO SEQUENCING, tecnica che prevede la

possibilità di ottenere la sequenza di MS-MS basandosi su

genomi di organismi simili. Tuttavia, la MS-MS richiede tempi

molto lunghi e strumenti molto costosi e richiede anche l’utilizzo

di campioni piccoli e di fare molta attenzione alle impurità. Per

questo motivo oggigiorno si preferisce utilizzare la MS-MS

rispetto al fingerprinting, in quanto restituisce molte più

informazioni.

Esistono diverse tipologie di MS-MS:

- PRODUCT ION SCAN= ottengo 3 peptidi parent ion dopo il primo quadrupolo, effettuo massa,

frammento grazie alla cella di collisione, analisi, ottengo i daughter ions e poi spettro MS-MS

- PRECURSOR ION SCAN= viene utilizzato per studiare le modifiche proteiche o per veder

somiglianze. Si analizza nel primo quadrupolo il primo parent ion, poi si passa alla cella di

collisione e vien frammentato in daughter ions. Di questi però ne viene analizzato uno solo. Si

tiene dunque fisso il secondo analizzatore.

- NEUTRAL LOSS SCAN= nel primo analizzatore misuro i parent ions, nella cela li frammento e

ottengo, oltre ai normali daughter ions, anche quelli che presentano delle parti in meno

(perdita di NH3 o H2O). Serve per vedere parent ions con modificazioni

- MULTIPLE REACTION MONITORING = molto utilizzato per studi farmacologici. Non serve avere

la MS-MS di tutti i parent ions, ma mi interessa un solo daughter ion. Partendo dunque dai

parent ions, li analizzo, li spezzetto e poi fisso il secondo scanner su un determinato peso, in

modo da filtrare un solo daughter ion. Viene fatto per targettare, per ricercare qualcosa in

particolare. 33

N.B. FINO A QUESTO MOMENTO L’UNICA TECNICA QUANTITATIVA ERA LA DIGE (tramite gel e

fluorimetria).

Quindi se in esame mi chiede: metodi di quantizzazione tramite spettrometria di massa, non devo

mettere la DIGE.

Esistono diversi metodi per effettuare analisi di QUANTIZZAZIONE RELATIVA, ovvero per confrontare

due o più campioni. Per farlo è necessario marcare, fare un “labelling”, ovvero utilizzare un isotopo

non radioattivo, e dunque stabile.

Ricorda: isotopi sono atomi con lo steso numero atomico, ovvero n.e = n.p , ma diverso numero di

- +

massa, ovvero p e n . Es. C e C

+ o 14 12 34

Lezione 9 QUANTITATIVE PROTEOMICS

Ppt

Per effettuare una quantificazione relativa si usa come strategia etichettare, marcare i campioni con

isotopi non radioattivi, i quali hanno la caratteristica di variare di peso molecolare (C diverso C ),

12 13

caratteristica che è possibile misurare con lo spettrometro di massa, consentendoci di discriminare

fra due campioni:

Gli isotopi più utilizati sono:

- C /C /C (poco perché un minimo decade)

12 13 14 SIL (Stable Isotop Labelling)

- N /N

14 15

- H /H /H

1 2 3

Esistono 3 diverse tecniche SIL:

SILAC ICAT iTRAQ

(Stable Isotope Labelling by (Isotope Coded Affinity Tags) (Isobaric Tagged Relative and

Amminoacids in Cell Colture) Absolute Quantitation)

Consente il confronto fra due Le proteine vengono marcate Si etichettano campioni ma non

campioni in colture. con isotopi, un campione (A) con isotopi: le etichette sono

Prevede la crescita dei due con l’isotopo light, il B con composte da due parti, balance

campioni, A e B, in terreni di quello heavy. e reporter.

cultura in cui vi è aggiunta di Si induce una reazione chimica Tutte le etichette devono

aa marcati (normalmente C o tra le proteine e l’”etichetta” sempre avere lo stesso peso,

N). con l’isotopo. L’etichetta è dunque per discriminare si usa

Es. si aggiunge ad ARG il C composta da una parte solo la differenza tra i pesi

12.

Questo significa che tutte le reattiva, che forma un legame relativi tra reporter e balance. Il

proteine avranno aa con ARG- o con CYS o LYS o ARG, e dal reporter, infatti, può variare

12. L’altro campione viene “linker”, che contiene all’interno di un range e di

invece marcato con C l’isotopo, mentre l’ultima conseguenza, per mantenere

13

(heavy). In questo modo tutti parte è quella che consente uguale la somma, farà il

gli aa delle proteine del successivamente di purificare balance.

campione B avranno ARG-13. le proteine marcate tramite Si mischiano uguali quantità dei

Si prende poi uguale quantità cromatografia per affinità (di campioni, si separa per affinity e

dei due campioni (es. 1 microg norma è Biotina che viene poi si fa lo spettro di massa.

di A e uno di B) e li si unisce riconosciuta dalla Avendo tutti lo stesso peso si

ottenendo una miscela. streptobilina). dovrebbe avere un solo picco,

Studiando lo spettro di massa Quindi prendo una miscela ma così non è in quanto per

della miscela è dunque delle proteine di A e una di B e poter discriminare, si prende il

possibile confrontare le le unisco. Digerisco e ottengo picco e lo si rompe, tagliano via

proteine dei due campioni, la peptidi. Questi vengono il reporter. In questo modo si

relativa presenza e quantità. separati per affinity e poi si ottengono picchi con pesi

studia lo spettro di massa. leggermente diversi: 35

Vantaggio: facendo crescere Vantaggi: molto precisa, può Vantaggio= a differenza degli

in cultura si è sicuri che il essere usata anche per altri due metodi può confrontare

100% delle proteine si sono proteomi complessi (come più di due campioni, anche in

marcate correttamente cibo o biopsie) e consente cultura e consente di fare

(MARCATURA + ROBUSTA e eventualmente di analizzare in quantizzazioni precise.

precisa) MS/MS i peptidi e ottenerne la Svantaggi= molto costoso e

Svantaggi: solo in cultura. Su sequenza. marcatura non al 100%

alcuni campioni non si può Svantaggi: essendo una

applicare (es. farina o analisi di reazione chimica, non il 100%

biopsie) + costi molto elevati delle proteine saranno

marcate. Inoltre, è molto

costoso e se nel campione non

sono presenti CYS, ARG o LYS

non si riesce a labellare.

ATTENZIONE= con iTRAQ si può fare anche QUANTIZZAZIONE PUNTUALE: si può sapere quanti

microg/millig di peptide ci sono nel campione.

Per farlo si crea una retta di taratura sfruttando un peptide a peso noto. In questo modo è possibile

ottenere dati precisi. Per non dover usare per forza il peptide si usano anche i reporter.

Esiste anche un’altra tecnica di quantizzazione relativa, la LABEL-FREE QUANTIFICATION.

Confronta due campioni, ma senza etichettarli. Per questo motivo non si mischiano i campioni, ma se

ne prende uguale quantità e né si studia l’altezza dei picchi. 36

Si sa che però in questo modo è da considerarsi la variabilità

sperimentale: per avere la certezza dell’altezza dei picchi si ripete

almeno 5/6 volte la misura.

Vantaggi= è meno costosa, perché non si usano le etichette, è

molto più veloce, perché non si fanno reazioni chimiche né

cromatografia. Inoltre, consente di usare campioni qualsiasi, non

solo in cultura.

Svantaggi= può studiare solo due campioni per volta e necessita

l’utilizzo di strumenti molto precisi, all’avanguardia. In ogni caso si

può dire che l’altezza dei picchi è solo probabilistica. 37

Lezione 10 PROTEOMICA DEI COMPLESSI

Ppt

Oggigiorno si sa che le proteine non lavorano da sole, ma in complessi,

ovvero per interazioni le une con le altre.

Questi complessi possono essere:

A. MONOCOMPLESSI = stesse proteine

B. ETEROCOMPLESSI = composti da componenti proteiche diverse

Quando si studiano i complessi si vuole rispondere a molte domande:

Quali sono le parti del complesso? Dove si trovano nella cellula? Quante

subunità? Quando lavorano? Come funziona la regolazione? In che

processo sono coinvolte?

In realtà a molte è possibile rispondere utilizzando tecniche di massa alla prima (identità delle

proteine) o massa alla seconda, per rispondere ad altre invece è possibile utilizza