Metodologie Biochimiche applicate alla Proteomica

Passaggi comuni a tutte le metodiche:

Fissazione: rende insolubili le proteine e rimuove i composti interferenti

 presenti nel gel;

Sensibilizzazione: favorisce lo sviluppo dell’immagine;

 Impregnazione dell’argento: aggiunta di una soluzione come nitrato

 d’argento o argento diamminico;

Sviluppo: con carbonato diluito (silver acido) o acido citrico (silver

 basico), in presenza di formaldeide. Lo sviluppo viene fermato con

soluzioni appropriate a seconda del metodo scelto.

Ci sono diverse metodiche utilizzabili e vengono raggruppate in base alle

condizioni impiegate per l’impregnamento dell’argento in silver basico se

viene utilizzato nitrato d’argento in ambiente alcalino mentre lo sviluppo

avviene in soluzioni acide, oppure acido se viene usato nitrato d’argento in

acqua e lo sviluppo in soluzioni a pH alcalino.

Un vantaggio di questa metodica è l’elevata sensibilità mentre gli svantaggi

sono: Scarsa riproducibilità per cui ogni passaggio può avvenire in tempi

 variabili di volta in volta portando a risultati anche molto diversi, in più

anche la qualità dei reagenti può non essere ottimale e anche la

temperatura ambientale può influire;

La linearità di questo metodo non è elevata (solo per concentrazioni di

 proteine molto basse) quindi è difficile da utilizzare ai fini quantitativi

perché va subito a saturazione;

Spesso non è compatibile con la spettrometria di massa perché le aldeidi

 utilizzate vanno a modificare in modo irreversibile alcuni gruppi degli

amminoacidi (alchilazione degli alfa e gamma amminoacidi). Per ovviare

a questi problemi esistono dei protocolli come la rimozione della

glutaraldeide.

Altra metodica è quella dei coloranti organici come il Coomassie brilliant blu.

Questo veniva utilizzato soprattutto nell’industria tessile e iniziò a venire usato

per l’elettroforesi negli anni ’60. Esiste in due forme: il coomassie R- 250 (tinta

rossa) e il coomassie G- 250 (tinta verde; questo differisce dal primo per la

presenza di due gruppi metilici). Forma interazioni elettrostatiche con gli

amminoacidi basici ed interazioni idrofobiche sia con residui idrofobici che con

le micelle di SDS; quindi, oltre a colorare le nostre proteine, colorerà anche il

gel. 27

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Il protocollo originale prevede la colorazione in: 0,1 % Coomassie, 45%

metanolo e 10% acido acetico. La colorazione può protrarsi overnight, ed è

seguita da un passaggio di decolorazione per rimuovere il colorante in eccesso.

È abbastanza sensibile, intorno ai 50-100 ng.

I vantaggi di questa colorazione sono la sua facilità di utilizzo, è economico, è il

più compatibile con la spettrometria di massa perché viene rimosso abbastanza

facilmente dalle proteine e, pur non essendo molto sensibile, dà una risposta

lineare per almeno un ordine di grandezza. La riproducibilità non è perfetta

perchè durante i lavaggi parte del colorante può essere perso ma soprattutto è

influenzato dalla composizione amminoacidica delle proteine perché lega in

preferenza amminoacidi basici.

A questa colorazione classica è stata affiancata una colorazione di tipo

colloidale che sfrutta la capacità del CBB G-250 di formare soluzioni colloidali.

In presenza di H SO il Coomassie è in stato micellare, o colloidale: forma

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complessi di dimensioni tali da non poter entrare nel gel di poliacrilammide. Il

metodo sfrutta la solvatazione localizzata del colorante: quando le proteine non

legano più CBB, questo non passa più dallo stato colloidale a quello in

soluzione. I tempi di colorazione sono minori, si aumenta la sensibilità e la

risposta è più specifica. Inoltre, non richiede decolorazione. Uno svantaggio è

che se non vengono rimosse le micelle di colorante rimaste in soluzione

possono interferire con l’analisi di immagine quindi almeno un lavaggio del gel

va fatto.

È stata sviluppata un’ulteriore miglioria denominata Blu Silver perché la

sensibilità arriva ad essere vicina a quella della colorazione Silver. Questo è

stato ottenuto aumentando la percentuale di colorante e aumentando

l’acidificazione così da protonare quasi completamente i residui di aspartato e

glutammato favorendo le interazioni elettrostatiche con il colorante. Il

colorante quando viene miscelato ha un colore verde petrolio e man mano che

entra a contatto con le proteine si solvata e diventa blu. 28

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Un utilizzo alternativo del blu di Coomassie è nella Blue Native PAGE. Quando

si vogliono studiare complessi multisubunità si va a fare un’elettroforesi in

condizioni native. Non si usano riducenti o SDS perché i complessi vanno

mantenuti integri e quindi si usa il blu Coomassie che comunque conferisce

carica negativa alle proteine e viene aggiunto al catodo così da avere la

separazione delle proteine native. Quello che si ottiene è una corsia con delle

bande e a ciascuna banda corrisponderà un complesso multisubunità di un

certo tipo; questi vengono equilibrati, cioè vengono addizionati poi gli SDS in

modo da dissociare le varie subunità e questa volta la corsia della prima

dimensione viene posizionata orizzontalmente su gel e si fa una classica SDS

PAGE in cui però ad ogni corsia corrispondono le singole subunità di uno stesso

complesso. Grazie a questo meccanismo possiamo capire da quali subunità è

composta una proteina.

Non sono molto frequenti ma vi sono anche le colorazioni in negativo in cui le

proteine risultano come macchie trasparenti su un fondo scuro del gel. Si

formano dei complessi metallici insolubili con le porzioni di gel cui non si sono

legate le proteine. È una colorazione reversibile che può sfruttare la presenza

di ioni rame, zinco, acetato di potassio o di sodio e zinco- imidazolo. Non

colorando la proteina (bande o spot trasparenti) questa non viene

modificata. Uno svantaggio è che noi non le vediamo quindi non sappiamo

quanta proteina c’è all’interno di queste zone e non possiamo utilizzarla a

scopo quantitativo. Inoltre, poiché non c’è una fissazione vera e propria delle

proteine queste possono andare perse.

Per quanto riguarda le colorazione a fluorescenza distinguiamo:

Marcatura pre- elettroforetica: le proteine possono essere modificate

 con traccianti fluorescenti prima della focalizzazione isoelettrica. L’unico

caso trova applicazione nella DIGE (Differential Imaging Gel

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Electrophoresis) che utilizza fluorofori simili per struttura e caratteristiche

chimiche ma con diverse caratteristiche spettroscopiche. Ha permesso di

ridurre moltissimo la variabilità tecnica tra i vari gel di uno stesso

campione quindi ha migliorato di molto la riproducibilità. È possibile una

visualizzazione contemporanea di campioni diversi in uno stesso gel

bidimensionale. Ci sono tecniche differenti ma la più utilizzata sfrutta la

derivatizzazione con cianine quindi i fluorofori si legano ai residui di lisina

tramite un legame amidico (in particolare il colorante Cy2, Cy3, Cy5). Le

cianine hanno tutte lo stesso peso molecolare e portano una carica

positiva che compensa la carica persa dalla lisina durante la

derivatizzazione e questo è fondamentale perché il punto isoelettrico

della proteina non cambia. Anche il peso molecolare della proteina

modificata non deve cambiare e questo si ottiene facendo una marcatura

minima cioè si tiene il rapporto colorante/ proteina al di sotto del 3%

affinchè venga marcato un singolo residuo di lisina e vi sia una minima

variazione di peso molecolare. Quindi se noi abbiamo due diversi

campioni possiamo marcare il primo con la cianina 3 ed il secondo con la

cianina 5 e mescolarli; la miscela può essere sottoposta ad elettroforesi

bidimensionale classica. Si può anche correre una sorta di standard

interno, di solito la cianina 2 viene miscelata con uguale quantità dei due

campioni in modo da andare a verificare situazioni quali errori di

quantificazione. Le tre miscele vengono unite e corse su un gel in prima e

seconda dimensione e, se noi acquisiamo l’immagine del gel utilizzando

le lunghezze d’onda di eccitazione per ciascuno dei tre coloranti,

possiamo ottenere per lo stesso gel tre immagini differenti che possono

essere sovrapposte;

Colorazione post- elettroforetica: approccio classico, colorazione

 dopo separazione delle proteine su gel. I più diffusi sono il SYPRO

(Molecular Probes) Red, Orange e Tangerine. Tutti coloranti fluorescenti

che si legano all’SDS e sono di facile utilizzo molto simile al Coomassie. Il

SYPRO Ruby è il più utilizzato: complesso di molecole organiche

coordinate con il rutenio. Interagisce con le proteine legandosi agli

amminoacidi basici tramite meccanismo simile a quello del CBB

colloidale. Necessita di fissazione e di incubazione al riparo dalla luce. È

necessario lavare il gel per rimuovere eccesso di colorante in acqua

deionizzata o in soluzione diluita di metanolo ed acido acetico. Un

vantaggio è dato dal fatto che può essere utilizzato in combinazione con

altri coloranti fluorescenti specifici per la detection di glico o

fosfoproteine (multiplexed staining). I coloranti fluorescenti sono molto

sensibili e per essere rilevati devono essere eccitati ad una lunghezza

d’onda specifica. Sono quindi coloranti rapidi, sensibili, compatibili con la

spettrometria di massa però molto costosi e richiedono degli scanner a

fluorescenza appositi per l’acquisizione ottimale dell’immagine.

Vi sono coloranti specifici come il Pro Q- Diamond che è specifico per le

fosfoproteine, in particolare rileva residui fosforilati di serina, treonina e tirosina

direttamente su gel di poliacrilammide. La sensibilità dipende dallo stato di

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fosforilazione della proteina. Poi ricordiamo il Pro Q Emerald che è specifico per

le glicoproteine. Coniugazione di glicoproteine con un’idrazide fluorescente

tramite reazione con acido periodico – reattivo di Schiff. Questi due coloranti

specifici possono appunto essere associati ai coloranti di post- elettroforesi.

Inoltre, sono compatibili con la spettrometria di massa e sono lineari per tre

ordini di grandezza. Tuttavia, sono molto costosi e necessitano di

apparecchiature apposite per acquisire l’immagine.

Possiamo avere anche coloranti di origine fungina come l’Epicocconone