Metodologie Biochimiche applicate alla Proteomica

Camilla Mancassola metodologie biochimiche a.a 2018/2019

Metodologia biochimiche applicate alla proteomica

Introduzione alle proteine e alla proteomica

Le proteine sono le macromolecole biologiche più abbondanti negli organismi viventi e compongono più della metà del peso secco di animali e batteri. Sono costituite da una composizione varia di 20 diversi tipi di L-amminoacidi e differiscono tra loro per numero, composizione e sequenza amminoacidica.

La sintesi delle proteine è legata alla formazione del legame peptidico tra amminoacidi adiacenti. Questo è un legame dal carattere 40% di doppio legame a causa di fenomeni di risonanza perché l’ossigeno del gruppo carbonilico porta una parziale carica negativa e sull’azoto si localizza una parziale carica positiva; questo fa sì che l’ossigeno e l’azoto si dispongano agli estremi e che i quattro atomi si trovino tutti sullo stesso piano. Il legame è quindi rigido e planare e non si può avere rotazione tra gli atomi che interessano il doppio legame mentre gli atomi di carbonio alfa portanti le catene laterali possono ruotare di due angoli fi e psi. Questi angoli non possono assumere qualsiasi valore ma ci sono angoli permessi e angoli impossibili dipendenti dal tipo di catena laterale dell’amminoacido in questione.

Una proteina ha una struttura primaria data dalla sequenza di amminoacidi che la compongono, può avere uno o due elementi di struttura secondaria, porzioni in cui la sequenza può essere ripiegata in modo più o meno regolare, una struttura terziaria data dall’insieme di ripiegamenti che la proteina assume nello spazio ed infine una struttura quaternaria, che non tutte le proteine possiedono, ed è data dall’associazione di più subunità.

Parlando di struttura primaria, la prima sequenza proteica ad essere stata determinata è stata l’insulina. Proteina molto piccola costituita da 51 amminoacidi e determinata da Sanger nel 1953. È una proteina con una caratteristica particolare: quella che è la forma matura dell’insulina non corrisponde a quella con cui viene prodotta dal nostro organismo. La forma geometrica della catena polipeptidica dipende da tutti gli angoli fi e psi che si susseguono ma, come abbiamo detto prima, non tutte le combinazioni sono possibili, a causa dell’impedimento sterico (un gruppo che dovrebbe occupare lo spazio di altri).

La struttura secondaria può essere presente in tratti più o meno estesi della catena proteica e sono zone caratterizzate da una struttura regolare e ripetuta nello spazio perché la catena è stabilizzata da legami a idrogeno tra il gruppo peptidico di un amminoacido e il carbonile di un altro amminoacido. Le strutture secondarie più famose sono l’alfa elica ed il foglietto beta, quest’ultimo a sua volta può essere parallelo quando due o più porzioni della catena che partecipano alla formazione di questa struttura hanno le estremità ammino terminali affiancate oppure antiparallelo dove un’estremità ammino terminale è affiancata ad una estremità carbossi terminale. Nella disposizione parallela si nota come i legami a idrogeno siano distorti obliquamente perché si trovano ad una maggiore distanza mentre nel foglietto antiparallelo la struttura è più compatta perché i legami a idrogeno sono paralleli gli uni rispetto agli altri.

Nell’alfa elica la catena proteica è disposta a formare una sorta di spirale e i legami a idrogeno sono tra spire diverse del polipeptide. L’alfa elica è stato il primo motivo strutturale secondario ad essere stato scoperto ed è uno dei più diffusi. Grazie a legami idrogeno, gli amminoacidi si organizzano in un’elica destrogira che compie un giro completo di 3,62 amminoacidi (residui), equivalente a 13 atomi. Ogni amminoacido si estende per 1.5 Å lungo la catena, perciò il passo è di 5,4 Å.

Il foglietto beta è un altro elemento molto diffuso, stabilizzato dalla formazione cooperativa di un grande numero di legami idrogeno. Nella struttura, i carboni alfa sono disposti nelle pieghe delle strisce, i C=O puntano in una direzione e gli N-H che li legano nella direzione opposta. Tutti i gruppi formano legami idrogeno.

La struttura terziaria è data dalla disposizione nello spazio di tutti gli atomi che costituiscono la proteina quindi tiene conto anche delle interazioni a lungo raggio. È il risultato della combinazione di tutte quelle porzioni ad alfa elica o foglietto beta che sono presenti nella catena proteica intervallate e collegate da porzioni che invece hanno un ripiegamento casuale che va a formare delle anse chiamate coil (non è evidente una struttura regolare e ordinata). In genere le zone che formano anse sono quelle in cui risiede l’attività funzionale della proteina. Non sempre proteine che condividono gli stessi elementi di struttura secondaria e terziaria hanno la stessa forma o la stessa funzione.

Confrontiamo ad esempio la triosofosfato isomerasi con la diidrofolato reduttasi: il primo è coinvolto nella conversione di una molecola in un’altra mentre il secondo è un ossido reduttasi quindi è coinvolto nel trasferimento di elettroni. La localizzazione dei ripiegamenti ed il valore degli angoli che possono generare dipendono da numero e localizzazione di residui amminoacidi come glicina, prolina, serina e treonina.

Le forze che stabilizzano la struttura terziaria di una proteina possono essere:

• Legami a idrogeno che abbiamo visto prima;
• Ponti disolfuro, cioè interazioni di tipo covalente tra due residui di cisteina disposti in punti diversi della catena proteica. Spesso proteine che devono svolgere la loro funzione nell’ambiente extracellulare, ossidante, hanno questo tipo di stabilizzazione;
• Interazione non covalenti come le interazioni idrofobiche;
• Interazioni di tipo ionico tra un aminoacido carico positivamente ed uno carico negativamente.

L’insulina quando viene sintetizzata è una sorta di pro-ormone cioè non è attiva al momento della sua sintesi. Presenta un peptide segnale che è quello che serve ad indirizzare la proteina verso l’organulo bersaglio, in questo caso le vescicole di secrezione del Golgi. Oltre al peptide segnale troviamo, all’interno della porzione rossa il peptide C che non è presente nella proteina finale ma serve solo a favorire il ripiegamento finale dell’ormone in modo che la catena B e la catena A siano avvicinate in modo da formare ponti disolfuro. Quando avviene lo stimolo alla secrezione dell’insulina, il peptide C viene tagliato per cui alla fine la proteina è costituita solo da due catene tenute insieme da due ponti disolfuro intracatena e due intercatena.

Il peso molecolare della proteina native sarà quindi diverso da quello della proteina matura e uno dei problemi che si potrebbe affrontare se non si conosce prima l’esatta struttura di questa proteina è di confondere le due catene per proteine singole.

La struttura quaternaria è la disposizione di più catene polipeptidiche nel caso di proteine con più subunità. La stabilizzazione della struttura avviene sempre secondo le modalità descritte precedentemente. Un esempio è l’emoglobina costituita da quattro subunità, due beta e due alfa, disposte in modo simmetrico.

La forma tridimensionale di una proteina dipende dalla sequenza e la funzione spesso è strettamente correlata alla struttura. La maggior parte delle proteine non ha tante conformazioni possibili ma solamente una o poche definite stabili cioè quelle con le quali possono funzionare e non essere degradate. Le forze che stabilizzano la struttura specifica di una proteina sono non covalenti.

Il metodo classico per determinare la struttura di una proteina è quello di ottenere una struttura purificata ed ottenere un cristallo che poi viene analizzato con il metodo di diffrazione ai raggi X con cui si ottiene un’immagine che viene elaborata con metodi matematici (cristallografia ai raggi X). Uno dei problemi che spesso si incontrano è che non sempre è possibile cristallizzare la proteina e, anche se si ottiene il cristallo, questo tende a compattare le varie molecole tra di loro in un modo che non corrisponde esattamente alla forma della proteina perché la struttura terziaria della proteina ha una certa elasticità. Le proteine non sono strutture statiche basti pensare agli enzimi che devono adattare la loro struttura a quella del substrato. Tra le strutture di diverse proteine si possono individuare modelli strutturali comuni che consentono di classificarle per questo è importante studiarle.

La struttura terziaria determina la costituzione di microambienti che consentono alla proteina lo svolgimento di funzioni altamente specifiche (es. le tasche idrofobiche dei siti attivi degli enzimi). Si può fare una sorta di distinzione tra proteine fibrose e proteine globulari. Un esempio di proteina fibrosa è la cheratina, caratterizzata dalla ripetizione di uno o due tipi di amminoacidi; questo fa sì che vi siano degli elementi di struttura secondaria ripetuti, in questo caso alfa elica. Queste possono formare associazioni producendo dei dimeri ecc. Un altro esempio è la fibroina della seta o il collagene. Tutte proteine con funzione prettamente strutturale: la cheratina è presente nei mammiferi nei capelli, nelle unghie, nello strato superficiale dell’epidermide con funzione di protezione ed i vari filamenti sono stabilizzati grazie a ponti disolfuro; nella fibroina della seta ci sono tutte interazioni a idrogeno ed è caratterizzata da una particolare estendibilità anche se è un po’ più rigida rispetto alla precedente.

Le proteine globulari sono caratterizzate da una catena che presenta molti ripiegamenti a formare dei globuli che possono essere mono o multisubunità. Esempi sono l’ovalbumina, la rubisco e l’emoglobina. Sono spesso proteine che svolgono ruoli regolatori basti pensare agli enzimi. Le porzioni idrofobiche si pongono verso l’interno della struttura mentre quelle idrofiliche rimangono a contatto con l’ambiente acquoso.

Le proteine possono avere funzione enzimatica come i numerosi enzimi che catalizzano le reazioni delle vie metaboliche, strutturale come il collagene, di trasporto come l’emoglobina, motoria come la miosina necessaria alla contrazione, di riserva come la caseina, di trasduzione come l’insulina, recettoriali come la rodopsina, regolatrici come i repressori del lattosio e poi funzioni specifiche tipiche di ciascun organismo.

Vi sono poi proteine semplici costituite solo da amminoacidi e proteine coniugate che portano legati gruppi non proteici: glicoproteine, lipoproteine, metalloproteine, nucleoproteine, fosfoproteine e flavoproteine.

È la forma della proteina che permette o meno il legame con il ligando. Le interazioni tra i due sono di tipo non covalente e sono le variazioni conformazionali della proteina che consentono che avvenga il legame. Questo introduce il concetto di regolazione dell’attività proteica (enzimi allosterici, inibitori, ecc.).

Noi sappiamo che le proteine sono il prodotto della traduzione di un filamento di mRNA a sua volta ottenuto dalla trascrizione di un filamento di DNA costituito da geni. Il genoma è l’insieme dei geni presenti in un determinato organismo. Esso contiene una quantità fissa di informazione perché è costituito da una sequenza lineare di nucleotidi. Il genoma è statico: a meno di eccezione, l’informazione contenuta nel genoma è la stessa indipendentemente dal tipo cellulare o dalle condizioni ambientali.

Il dogma centrale della biologia afferma che da un gene si passa sempre ad una proteina. Noi sappiamo che non è proprio così; questo è stato sempre più chiaro nella scoperta che uomo e scimpanzé condividono un 98% del genoma. Il 2% di differenza è responsabile di un’enorme variabilità tra le due specie.

Ci sono stati esperimenti di epigenomica che tratta le modificazioni strutturali del DNA, delle proteine coinvolte in funzione relative al DNA ed RNA, risultante nel cambiamento del trascritto di DNA ma senza alterare la sequenza originaria. In alcuni casi, le alterazioni epigenetiche sono stabili e vengono trasmesse alle generazioni successive, ma in altri casi sono dinamiche e cambiano in risposta agli stimoli ambientali. Le differenze possono essere dovute a fenomeni epigenetici o anche fenomeni che possono avvenire durante la trascrizione e la maturazione (splicing alternativo per cui da un gene si possono avere trascritti diversi oppure degradazione di RNA messaggero per cui non si arriva ad una proteina in un determinato contesto), la traduzione ed infine durante eventi di modificazioni post- traduzionali (aggiunta di gruppo funzionali come le glicosilazioni, eventi di taglio). Questa manipolazione dà luogo alla proteina attiva e funzionale ma queste modificazioni non sono registrate a livello del DNA e quindi non possiamo prevederle studiando la semplice sequenza genica perciò servono delle altre tecniche non di biologia molecolare.

L’espressione genica è quindi il risultato della trascrizione più la maturazione dell’mRNA più la sintesi della proteina e le sue modificazioni che sono necessarie alla sua funzionalità.

Il sequenziamento del DNA umano e lo studio dell’espressione di mRNA non forniscono tutte le informazioni necessarie per lo studio dei processi biologici:

• Solo il 2% delle malattie dell’essere umano sono caratterizzate dal difetto di un singolo gene;
• Invecchiamento;
• Effetti ambientali;
• Differenziamento.

Le informazioni possono essere fornite grazie allo studio del proteoma: il complemento proteico codificato da un genoma. Viene definito come l’insieme delle proteine prodotte da una cellula, tessuto, organo e organismo in un determinato momento, a determinate condizioni. La caratteristica è il momento in cui si studia il proteoma e le condizioni perché esso è variabile, dinamico. È un’entità complessa e dinamica (pensiamo agli stadi di maturazione del frutto oppure alla fase di crescita che subisce l’uomo dalla nascita all’età adulta).

Il dogma della biologica molecolare viene rivisto in scala omica perché si considera la totalità delle macromolecole. Il genoma porta al trascrittoma (l’insieme degli mRNA trascritti in ogni cellula) che porta infine al proteoma che considera tutte le isoforme che sono possibili per una determinata proteina. A questo si aggiunge il metaboloma cioè l’insieme di tutti i composti chimici, i metaboliti, che sono presenti in una cellula/organismo. L’insieme di queste macrocategorie ha dato origine alla biologia del sistemi quindi attualmente si cerca di studiare includendo più branche per cercare di dare una spiegazione più completa.

La proteomica è l’insieme delle tecniche e degli approcci sviluppati per lo studio del proteoma. Permette di scattare un’istantanea della cellula e di fare un’analisi su larga scala delle proteine: identifica le proteine prodotte, localizza le proteine all’interno della cellula, definisce le interazioni tra proteine e rileva modificazioni proteiche. L’approccio proteomico è utile perché non c’è una correlazione quantitativa tra mRNA e proteina, si ha una sorta di istantanea biochimica del fenotipo. Poi dobbiamo pensare che la funzione di una proteina dipende da struttura e interazioni che non sono prevedibili dalla sequenza. Inoltre, le proteine sono molto diverse a causa di fenomeni post-trascrizionali e possono avere attività funzionali differenti a causa di modificazioni post-traduzionali. La funzione di una proteina dipende anche dalla sua localizzazione all’interno della cellula. Poi ci sono anche alcuni campioni che non presentano il DNA. Infine, le proteine sono molecole terapeutiche rilevanti, spesso vengono studiate come molecole bersaglio di farmaci.

Le modificazioni post-traduzionali sono importanti per la funzionalità proteica e sono più di 400 tipi. Rappresentano un meccanismo diretto per la regolazione dell’attività proteica basti pensare alla fosforilazione e defosforilazione delle proteine segnale. Grazie a queste modifiche cambiano le caratteristiche fisiche e chimiche di una proteina. Non è possibile prevedere, a partire dalla sequenza genica, a quali modifiche post-traduzionali andrà incontro la proteina però è possibile, una volta che si sono scoperte, andare ad annotare nelle sequenza genica la presenza dei siti di modificazione (si parla di proteogenomica). Alcuni esempi di modifiche sono l’ossidazione, la glicosilazione enzimatica, la fosforilazione, l’acetilazione, la metilazione, la nitrosilazione cioè l’aggiunta di ossido di azoto ecc.

Le modificazioni possono essere classificate in:

• Sostitutive: possono essere modifiche permanenti delle catene laterali e associate alla funzione della proteina. Si possono formare legami intra e intermolecolari oppure ci possono essere modificazioni reversibili delle catene laterali e associate alla regolazione dell’attività proteica (per esempio l’aggiunta o la rimozione di un gruppo fosfato modificazione.