Proteomica

VANTAGGI E SVANTAGGI

- Economico, semplice e versatile

- Limitato range di MW e pI

- High-throughput

- Necessaria derivatizzazione con fluorofori

- Compatibile con analisi quantitative multiplexing

- Basso range dinamico, sensibilità e accuratezza

- Alta risoluzione e riproducibilità

- No identificazione delle proteine presenti

APPLICAZIONE DI 2D-DIGE NELLA RICERCA DI BIOMARCATORI DI CARCINOMA EPATICO NEL PLASMA

Si vogliono identificare proteine diversamente espresse fra soggetto sano e malato. Prima di tutto si utilizza il sistema MARS per eliminare la maggior parte delle proteine maggiormente presenti nel campione (albumina, IgA-G, antitripsina, transferrina ecc), si potrebbero perdere alcuni potenziali marcatori in quanto legati all'albumina. Successivamente si fanno 6 gel in doppio in modo da coprire un range di pH da 3.5 a 11 contenenti 50ug dei due campioni colorati con Cy-3 e Cy-5 (nei 6 gel successivi si invertono i coloranti). Per permettere

La riproducibilità fra diversi gel si aggiunge uno standard interno su cui normalizzare i segnali dei due campioni, esso è costituito da 25ug di ciascun campione legato a Cy-2. Si cercano quindi spot tendenti al rosso e al verde, quelli in giallo no perché indicano che la proteina in questione non mostra variazione. Sono state identificate mediante MS/MS 43 proteine che mostrano variazione, ovvero potenziali marcatori biologici che devono essere validati da approcci diretti come western blot, ELISA e immunoistochimica.

Come capire se la differenza della proteina x nei due campioni è significativa o dovuta al caso? Innanzitutto l'analisi va ripetuta più volte e si fa la media dei valori ottenuti. Si calcola quindi quanto i dati sono distanti dalla media ottenuta (variazione standard, s) e si calcola il t-value, definito come:

t-value = (x̄ - x̄) / √((a^2 / b) + (s^2 / n))

differenza fra le medie dei campioni = t-value

variabilità osservata fra i campioni. Bisogna a questo punto definire l'ipotesi nulla H0, vale a dire che non c'è una variazione significativa. Dato un t-value, quale è la probabilità che non ci sia variazione significativa (p-value)? Il p-value viene calcolato in base ai gradi di libertà (n a+ n - 2), generalmente si fissa come soglia di accettabilità 0.05 (5% di probabilità che la variazione sia dovuta al caso). Nel caso della ricerca di marcatori si esegue il two-tail t-test, con il quale si accettano i valori all'interno delle due code della gaussiana (proteina x più o meno espressa). Esistono delle tabelle su cui valutare il t-value ottenuto e accettare o meno l'ipotesi in funzione dei gradi di libertà. Il t-value indica il punto sulle ascisse mentre il p-value indica l'area integrata della coda della gaussiana partendo dal t-value. Protein Microarrays I microarrays sono stati sviluppati inseguito all'avvento degli approcci -omici, sono sistemi miniaturizzati su cui vengono immobilizzate esche di proteine o DNA. Contengono da centinaia a migliaia di esche per chip che possono interagire con altre proteine. Ne esistono di diverso tipo, per quanto riguarda quelli su cui vengono depositate le proteine possono essere microarrays di anticorpi (questi legheranno i rispettivi antigeni per rilevarne la presenza, studi di protein profiling) o con proteine funzionali (saggi enzimatici, interazione fra proteine e DNA, piccole molecole, lipidi e altre proteine, studi funzionali). Immobilizzazione Esistono diversi approcci per la creazione di microarray attraverso legami di tipo: - COVALENTE: reattività di ammine primarie tioli: sfruttando la (NHS esters) e- (maleimide) è possibile legare le proteine covalentemente al supporto in modo irreversibile e versatile. Tuttavia non si ha il controllo sull'orientazione delle proteine in seguito al legame, la reazione chimica.può alterare la conformazione della proteina, possibile variabilità fra gli spot, sistema complesso e costoso.
NON COVALENTE assorbimento delle proteine: ad esempio attraverso l'interazione elettrostatica e/o idrofobica, sistema semplice ed economico che non richiede reazioni chimiche. Tuttavia anche in questo caso l'interazione può denaturare le proteine, non si ha il controllo sull'orientazione e potrebbe esserci variabilità fra gli spot.
Derivatizzazione della proteina, ad esempio biotinilazione con NHS esters o maleimide seguita dal legame sul chip rivestito di streptavidina. Consente un legame molto stabile, tuttavia non consente di avere il controllo sull'orientazione e il legame potrebbe causare la denaturazione della proteina.
Affinity tags, prevede l'inserzione di specifici tags tramite ingegneria genetica e il legame del tag sul chip. Questo consente di avere il controllo sull'orientazione, non richiede

reazioni chimiche e non rischia di denaturare la proteina oltre aridurre la variabilità fra gli spot.

Tra le affinity tags le più comuni sono:

• Hys tag: prevede l’inserzione di una coda di- 6 His, esse sono in grado di legare ioni2+metallici come il Ni. Il chip vienederivatizzato con acido nitrilo triacetico,2+anch’esso in grado di legare il Ni. L’eluzione si ottiene tramite lavaggio conimidazolo.
• Arg tag: prevede l’inserzione di una coda di arginine, esse essendo cariche- positive possono legare ioni negativi, per l’eluzione si cambia la forza ionica delsistema (verso pH basici).
• Myc tag: prevede l’inserzione del peptide Myc per cui è disponibile un anticorpo- molto specifico che viene legato sulla superficie del chip. Per l’eluzione si puòusare un agente denaturante o un’alta concentrazione di peptide Myc.
• Flag tag: inserzione di un peptide in grado di legare il calcio, sul chip è presente- 2+un

anticorpo in grado di legare Flag quando legato al Ca. Per eluire è sufficiente aggiungere un chelante di ioni positivi come EDTA o EGTA.

Calmoduline binding peptide: peptide di 26-amminoacidi in grado di legare la calmodulina in presenza di ioni Ca, l'eluzione si ottiene usando EDTA o EGTA.

Strep-tag/Strep-Tactin: peptide in grado di imitare la biotina che può legarsi alla streptavidina (a volte si usa strepactina, più stabile della streptavidina). L'eluzione si ottiene tramite lavaggi con destiobiotina.

S tag: 15 residui derivanti dalla ribonucleasi umana, può legarsi alla restante proteina e ricostituire l'attività enzimatica, eluzione con guanidinio tiocianato.

GST tag: grande proteina che lega il GSH, eluzione con GSH. È anche possibile inserire un sito di taglio per eliminare il tag dalla proteina di interesse.

Halo tag: proteina in grado di rimuovere un alogeno da un alogenoalcano, è possibile ingegnerizzare

laproteine in modo da legarsi e non catalizzare lareazione sostituendo una His con una Phe.

Metodi di produzione

Direct printing : partendo dalla proteina purificata, è possibile depositarla in modo controllato sulla superficie del chip dove si instaura il legame in base al tipo di strategia di immobilizzazione adottata. Un modo per purificare la proteina di interesse in modo specifico è inserire un His tag, passare l'estratto in una colonna con Ni2+, eluire, tagliare il tag con TEV e far ripassare tutto sulla resina in modo da eliminare eventuali proteine naturalmente presenti nell'estratto in grado di legare la resina. Per evitare di contaminare il prodotto finale con la proteasi si può inserire un His tag anche in quest'ultima. Questo metodo è molto costoso in quanto richiede la purificazione di ogni singola proteina.

Cell-free protein expression system : sistema di trascrizione ed espressione in vitro direttamente sul chip, consente di

bypassare lo step di produzione e purificazione delle esche. In commercio esistono diversi kit per poter usare questa tecnica, essi contengono tutto il necessario (RNA pol, ribosomi, fattori di trascrizione, tRNA amminoacidi ecc). Esistono diverse strategie:

1. PISA (Protein In Situ Array): su ciascuno spot del chip viene depositata una gocciolina che contiene il DNA codificante prodotto tramite PCR e il lisato cellulare, lo svantaggio è legato alla diffusione che può causare cross-contaminazione fra gli spot.
2. NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array): evoluzione del sistema PISA che elimina il problema della diffusione, il DNA viene fissato sul chip accanto all'esca per il tag scelto in modo che la proteina appena viene sintetizzata si lega al chip.
3. TUS-TER: sistema che sfrutta il legame fra la sequenza TUS presente sulla proteina di interesse e la sequenza TER presente sul plasmide. Si può quindi immobilizzare il plasmide, una volta prodotta la proteina,

La sequenza TUS andrà alegarsi alla sequenza TER.4.

DAPA (DNA Array to Protein Array) : si utilizza un DNA array contenente le sequenze da esprimere e uno su cui immobilizzare. I due chip vengono messi unosopra l'altro e fra essi si allestisce la reazione di sintesi della proteina, nel momento in cui la proteina viene prodotta si lega sull'altro chip.

Ab microarrays

Il concetto alla base è quello di immobilizzare un set di anticorpi sul chip in modo che espongano le porzioni che devono interagire con l'antigene. Ogni spot da le stesse informazioni di un western blot, in un campione complesso è possibile rilevare la presenza di una determinata proteina con una sensibilità dal pM al fM.

Esperimenti di protein profiling

È possibile anche comparare l'espressione di due campioni ottenuti da situazioni differenti, ad esempio soggetto sano e malato, semplicemente marcando i due campioni con due coloranti differenti come Cy-3 e Cy-5.

L'unica limitazione di questo metodo è data dalla quantità di anticorpi che sono stati legati sul chip, produrre anticorpi per una vasta quantità di proteine diverse è ancora un problema. Produzione di anticorpi Gli anticorpi sono molecole complesse costituite da catene pesanti (in grigio) e leggere (in blu), domini fissi (C) e variabili (V) e possono legare carboidrati difficili da produrre. Disporre di anticorpi miniaturizzati che conservano il legame verso l'antigene risolve in parte il problema, sono più semplici da produrre per via ricombinante e da manipolare. Tramite il taglio con pepsina o papaina è possibile ottenere versioni ridotte degli anticorpi, nel primo caso si ottengono e